O método de imunofluorescência para Caracterização de Células Esôfago de Barrett

Há uma necessidade visível de uma melhor informação sobre os condutores moleculares de Esôfago de Barrett. Coloração de imunofluorescência é uma técnica útil para entender os efeitos da sinalização celular na morfologia celular. Nós apresentamos um protocolo simples e eficaz para o uso de coloração de imunofluorescência para avaliar tratamento terapêutico em células esôfago de Barrett.

Adenocarcinoma de esôfago (EAC) tem uma taxa de sobrevida global de menos de 17% ea incidência de EAC aumentou dramaticamente ao longo das últimas duas décadas. Um dos principais fatores de risco de EAC é o esôfago de Barrett (BE), uma mudança metaplásico do esôfago escamoso normal em resposta a azia crônica. Apesar da ligação bem estabelecida entre EAC e BE, o interrogatório dos eventos moleculares, particularmente vias de sinalização alterados envolvendo progressão da SER para EAC, são mal compreendidos. Grande parte isto é devido à falta de modelos in vitro adequados disponíveis para estudar estas doenças. Recentemente, as linhas de células imortalizadas BE tornaram-se disponíveis comercialmente permitindo estudos in vitro de BE. Aqui, apresentamos um método para coloração de imunofluorescência de linhas de células imortalizadas BE, permitindo caracterização in vitro de sinalização e estrutura da célula após a exposição a compostos terapêuticos. Aplicação destas técnicas irá help desenvolver insights sobre os mecanismos envolvidos na BE à progressão EAC e fornecer potenciais caminhos para o tratamento e prevenção da EAC.

Esôfago de Barrett (EB) é uma mudança metaplásico no epitélio escamoso normal do esôfago e uma consequência da exposição crônica ao conteúdo gástricas resultantes da doença do refluxo gastroesofágico (DRGE) ^1. BE é pensado para ser um mecanismo de proteção em resposta a RGE, no entanto, a presença de BE confere um risco aumentado de adenocarcinoma esofágico (EAC), uma doença que acarreta uma sobrevivência significativamente pobre ^1. As estimativas atuais sugerem que até 5,6% da população americana tem BE, porém, como BE é muitas vezes assintomática, pensa-se que a maioria das BE permanece sem diagnóstico ^2. Como as taxas de incidência de ambos DRGE e EAC têm visto um crescimento contínuo ^3, tornou-se importante para compreender os mecanismos moleculares envolvidos na progressão do BE para EAC, particularmente porque essas informações poderiam fornecer abordagens terapêuticas no sentido de prevenir a progressão da BE à EAC.

Paciente dirigidos resultaram no paradigma atual de BE-EAC patogênese ^1. A inflamação crônica, lesões e danos genotóxicos resultantes da exposição prolongada ao conteúdo gástrico exercer pressão seletiva sobre a lesão estar promovendo a progressão neoplásica a EAC. Uma série de alterações genéticas foram identificadas durante a BE à progressão EAC. No entanto, apesar disso, há uma clara falta de entendimento sobre as mudanças exatas na sinalização celular e os efeitos subsequentes sobre a estrutura e função celular.

Imortalizado em linhas celulares in vitro são ferramentas úteis para o estudo dos efeitos de sinalização de células, particularmente em investigar os efeitos dos compostos terapêuticos alvo. A recente disponibilidade comercial de ser linhas de células imortalizadas permite tais estudos. Embora os ensaios de alto rendimento, como os ensaios de viabilidade amplamente utilizada, pode ser valioso para avaliar os efeitos das terapias-alvo sobre a proliferação celular e survival ^4-6, estes ensaios não são úteis para interrogar os efeitos de sinalização de células sobre a morfologia celular. Coloração de imunofluorescência (IF) é uma técnica útil para investigar os efeitos de terapias específicas sobre as características morfológicas, de crescimento e sobrevivência das células e as proteínas que estão envolvidas. Nosso laboratório adaptou esses métodos para linhas de células imortalizadas BE, usando IF para avaliar os efeitos de uma droga clinicamente disponíveis mediante linhas de células BE na esperança de delinear um possível tratamento quimiopreventivo e biomarcador para tratamento de drogas ^7. Da mesma forma, a aplicação destas técnicas na EAC, BE e linhas de células do esôfago imortalizados delineou conclusões críticas sobre BE à progressão EAC ^8-10. Encontramos se a análise de células ser tratados com terapias direcionadas tem valor, permitindo a caracterização de mudanças na estrutura celular e localização de proteínas. Aqui, apresentamos os nossos métodos para IF de ser células imortalizadas para characterize tratamento medicamentoso.

1. Linha celular Manutenção

1. Humana imortalizada BE displásicas de alto grau (CP-B, CP-C, CP-D) e metaplásico (CP-A) de linhas celulares por transfecção estável da telomerase humana transcriptase (TERT) de proteína ¹¹ reversa.
2. Manter BE linhas de células de queratinócitos em meio suplementado com extracto de pituitária de bovino (BPE), factor de crescimento epidérmico (EGF), 5% de soro fetal bovino (FBS), aminoácidos não essenciais (NEAA), penicilina-estreptomicina-neomicina (PSN), e padrão condições de cultura de tecidos (37 ° C, 5% de CO _2, 98% de humidade).

2. BE celular chapeamento

1. Preparação de 12 poços de placas / lamelas. Coloque 18 milímetros lamínulas em uma placa de Petri e autoclave de vidro. Transferência autoclavada 18 milímetros lamelas de vidro em um prato de 12 poços de cultura de tecido utilizando uma pipeta de vidro estéril ligada a um tubo de vácuo. Lave as lamelas com PBS estéril e mídia.
2. Trypsinize e contagem de células ser imortalizado. Contar células using contador de células automatizado ou um hemocitômetro. Diluir as células em meio de cultura a uma concentração de 20.000-40.000 células / ml.
3. Colocar 1 ml de células em cada cavidade contendo uma lamela para uma contagem de células totais de 20.000-40.000 células / poço.
4. Utilizar uma ponta de pipeta estéril de empurrar suavemente a lamela para o fundo do poço, para assegurar que as células fixar a lamela.

3. Tratamento de Drogas de Células BE

1. Diluir fármaco seleccionado em meio morno (37 ° C) até à concentração desejada e misturar bem, invertendo o tubo várias vezes ou usando um misturador de vórtice. As concentrações de medicamento determinado empiricamente. Comece o tratamento 24 horas após a semeadura inicial das células ser o de permitir que as células de fixação para a lamela
2. Para efeito de comparação e controle, o tratamento de uma lamela adicional de células BE com 0,1% de veículo (dimetilsulfóxido [DMSO] ou agente usado para solubilizar composto) diluído em meios de cultura. Placa de etiqueta com uma caneta de laboratório para identificar a droga e veculo amostras tratadas. Colocar as células em uma incubadora de cultura de células definido como 37 ° C, 5% de CO _2, 98% de humidade e incubar durante pontos de tempo desejados.

4. Immunofluorescent Coloração

1. Fixação
   1. Seguindo o tempo de incubação desejado do tratamento com droga, os meios de aspiração e lava-se rapidamente as lamelas com tampão fosfato salino 1x (PBS) à temperatura ambiente (TA, 25 ° C).
   2. Aspirar o PBS e adicionar 1 mL de PBS contendo 4% de PFA [4% PFA / PBS] a cada poço e incube à temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Aspirar a 4% PFA / PBS e lavar o lamelas 3x, 5 min cada com PBS à temperatura ambiente. Armazene lamelas para uma semana em PBS/0.1% PFA a 4 ° C, se desejar.
2. Permeabilização / Bloqueio
   Permeabilizar células PFA fixas para permitir que o anticorpo para aceder aos alvos intracelulares. Para extracelular surgiu proteínas, executar todos os passos subsequentes sem saponina adicionado à solução de BSA 1x PBS/0.5%.
   1. Reduzir o fundo por incubação com 50 mM de NH ₄ Cl diluído em PBS durante 10 min à temperatura ambiente e lava-se com PBS, uma vez RT durante 5 min.
   2. Incubar ser células durante 30 minutos em 100-300 ul de PBS contendo 0,1% de saponina e 0,5% de albumina de soro bovino (BSA). Dilui-se a partir de 10% de saponina estoque, esterilizada por filtração, preparada em água e armazenado a 4 ° C.
   Nota: Isto impede a ligação não específica de anticorpos contra proteínas celulares, bloqueando lamelas, devido à adição de 0,5% de BSA. Alternativamente, substituem BSA com soro de cabra diluído a 5% para ajudar a reduzir a ligação não específica de anticorpos.
3. Preparação de secção Humano
   1. Prepare um prato quadrado bioensaio por camadas na parte inferior da câmara com papel-toalha molhada e coloque uma camada de Parafilm no topo.
   2. Gentilmente transferir as lamelas, células voltadas para cima, para o Parafilm usando uma pinça e uma agulha de seringa.
   3. Marque o Parafilm com uma caneta de laboratório para identificar lamelas.
4. Primário Incubação de anticorpos
   1. Dilui-se o anticorpo primário em PBS contendo BSA a 0,5% tanto e 0,1% de saponina.
   2. Seque levemente para fora da solução de bloqueio utilizando um tecido de laboratório e adicionar 100 ul de solução de anticorpo primário. Incubar o anticorpo primário às células BE durante a noite a 4 ° C.
5. A incubação do anticorpo secundário
   1. Lavar as lâminas 3x com PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina por 5 min cada em temperatura ambiente.
   2. Dilui-se o anticorpo secundário conjugado com um marcador fluorescente em PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina que o anticorpo secundário reconhece as espécies em que o anticorpo primário foi levantadas.
   3. Adicionar 100 ul de anticorpo diluído em cada lamela. Incubar o anticorpo secundário durante 2 horas à temperatura ambiente.
6. Lavagem e montagem de Lamelas
   1. Lave as lamelas de 3x, 5 min cada em PBS/0.5% BSA/0.1% de saponina. Remover o tampão de lavagem e adicionar 100-300 ul de PBS para as lamelas.
      NOTA: Para a dupla anticoloração do corpo, repita os passos de 4,4-4,5 com o anticorpo primário e secundário adicional desejado de acordo com informações descritas na discussão.
   2. Utilizando uma pinça, retire cuidadosamente a lamela e secar fora da PBS usando um tecido de laboratório ou toalha de papel.
   3. Adicionar 15 mL de um meio de montagem anti-fade apropriado contendo 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) para a lamela e inverter a lamela, células para baixo, sobre uma lâmina de vidro.
   4. Colocar as lâminas em uma pasta de slides e incubar longe da luz direta durante a noite à temperatura ambiente para permitir que o meio anti-fade definir difícil de curar, de acordo com as instruções do fabricante. Uma vez que o meio anti-desbotamento definiu, as lâminas podem ser armazenadas a 4 ° C ou -20 ° C até a visualização microscópica.

5. Visualização microscópica de Lamelas

Células coradas podem ser visualizados através de qualquer microscopia confocal ou um IF microscop vertical capaze. Apesar de microscopia confocal fornece imagens de alta resolução em profundidades discretas, uma microscópica vertical é capaz de produzir imagens úteis mais rápido. Para resumir, um método de imagem manchado BE células usando microscopia padrão é apresentado. Em geral, a imagem de isotiocianato de fluoresceína (ITCF) ou fluoróforos semelhantes (isto é, proteína fluorescente verde), Texas Red e DAPI, requer um microscópio com filtros capazes de discriminar estes fluoróforos. Confira o microscópio antes de iniciar o protocolo para determinar fluoróforos compatíveis.

1. Imagem em um IF Microscópio Padrão
   1. Retirar armazenados slides / lamelas de -20 ° C ou 4 ° C e permitem-lhes a aquecer até à temperatura ambiente. Ligue microscópio e lâmpada de arco de mercúrio.
   2. Coloque lâmina de microscópio com lamela voltada para objetivo para o palco microscópio. Para o uso de um objetivo de imersão em óleo, adicione uma gota de óleo de imersão sobre lamela.
   3. Selecione o filtro DAPI e abrir o obturador.
   4. Concentre-se o objetivo ao olhar pelas oculares até que a imagem apareça. Uma vez que todas as células que coram com DAPI, os núcleos devem ser facilmente observável.
   5. Coletar imagens usando o respectivo software de processamento de imagem.

Um exemplo dos resultados obtidos com a aplicação dos procedimentos descritos está ilustrada nas Figuras 1A-D. Lamelas com PC-D e FP-C BE células foram tratadas durante 24 horas com 1 uM do inibidor de Src família, SKI-606, ou veículo (DMSO) e coradas utilizando os procedimentos descritos acima para o Adherens junção de sinalização Wnt e proteína, β -catenina. Visualização de β-catenina foi conseguida por marcação com uma IgG anti-coelho acoplado a um fluoróforo verde, enquanto que a rotulagem do núcleo da célula foi realizada por meio de etiquetagem com DAPI (azul). Lamelas foram montados para lâminas de microscópio utilizando difícil definir a montagem e as células foram fotografadas usando microscópio de varredura a laser confocal usando uma objetiva plano-Apochromat 63X/1.4N. O fluoróforo verde escolhido foi excitado a 488 nm e visualizados através de um filtro de emissão de 505-525 nm. Da mesma forma, DAPI estava animado a 405 nm e emissão coletados por meio de um filtro de 410-460 nm. Atividade da tirosina quinase, Src is aumentou em BE, particularmente em elevado grau de displasia ^12. Em concordância com as observações em células de cancro colo-rectal e da próstata ^13-15, inibição de Src resulta em relocalização da β-catenina do citoplasma / núcleo (setas, as Figuras 1A, 1C, 1E e) para a membrana celular (pontas de seta, as Figuras 1B, 1E e 1F). Utilizando estas técnicas, nós e outros, anteriormente demonstrado que a inibição de Src também altera a expressão e localização do supressor do tumor, p27 ^{kip1 7,16} e estes métodos são correntemente utilizadas no nosso laboratório.

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Figura 1. IF de células ser imortalizadas após o tratamento com um inibidor de Src-cinase. CP-C (AD) e CP-D (E, F) Foram tratadas com veículo (DMSO, painéis esquerdos) ou 1 uM do inibidor de Src, SKI-606, durante 24 h (painéis da direita). BE células foram fixadas e coradas de acordo com o protocolo descrito. β-catenina (verde) foi visualizada utilizando um anticorpo específico e um anticorpo secundário acoplado a Alexa Fluro 488, enquanto que o núcleo foi corado com DAPI (azul). Note-se a mudança de localização para β-catenina do núcleo (setas) para a membrana celular (pontas de seta) a seguir ao tratamento com SKI-606. C, D) de caixas de imagens ampliadas branco em A e B, realçar ainda mais as mudanças na β- localização catenina. Estas imagens representam a coloração ideal com fundo mínimo e coloração distinta para o destino escolhido. Barras, 7 um (A, B, D, F), 0,5 m (C, D).

Temos delineado um método para aplicação de IF de células ser no sentido de elucidar os efeitos fisiológicos de terapias específicas sobre estas células. Embora se tenha descrito o uso desses procedimentos contra células BE, verificou-se que estes métodos também são aplicáveis ​​a uma variedade de diferentes tipos de células ^13,17,18. Além disso, esses procedimentos podem ser modificados de várias formas para optimizar a coloração para alvos específicos.

Nós encontramos um parâmetro que tem um efeito directo, mediante a devida IF é a escolha de fixação. Nós descrevemos o uso de 4% PFA / PBS para fixação nos procedimentos acima, mas fixadores alternativos são também aplicáveis. A fixação com metanol frio (-20 ° C) durante 20 min, após lavagem com PBS, é adequado para certas proteínas / anticorpos ^13. Utilização de metanol frio para fixação nega a necessidade de permeabilizar as células. No entanto, a escolha do fixador (4% PFA / PBS ou metanol frio) deve ser determinada empiricamente.

Os procedimentos descritos acima descrevem a visualização de uma única proteína; no entanto, este método é facilmente adaptável a identificação de um alvo adicional ^13. Para um óptimo IF de duas proteínas, os anticorpos primários criados em duas espécies diferentes (por exemplo, um relevo em um coelho e no rato) e anticorpos secundários que reconhecem especificamente a cada uma das espécies, acoplados aos fluoróforos diferentes, são necessárias. Anticorpos secundários acoplados aos verdes e vermelhas fluoróforos, combinados com DAPI fornecer um contraste excelente entre os alvos, para além de evitar a interferência de geralmente os vários fluoróforos. Porque, se de dois alvos em células BE, execute incubação sequencial de dois anticorpos primário e secundário a sua respectivas seguinte fixação. Passos para a lavagem e montagem de lâminas permanecem os mesmos.

Em resumo, nós fornecemos um protocolo simples e útil para IF de células BE. A aplicação destes procedimentos pode render informatíon sobre os efeitos do tratamento da toxicodependência, a introdução de genes de interesse ectópica, ou RNAi regulação baixa de genes de interesse em células BE.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Este trabalho foi financiado por doações do St, Fundação de Joseph (AJF, LJI) e American Lung Association, RG-224607-N (LJI).