Eine Immunfluoreszenz-Verfahren zur Charakterisierung von Barrett-Ösophagus Cells

Es gibt einen erkennbaren Bedarf für verbesserte Informationen über molekulare Fahrer von Barrett-Ösophagus. Immunfluoreszenzfärbung ist eine nützliche Technik für das Verständnis der Wirkung von Zell-Signalisierung auf Zellmorphologie. Wir stellen eine einfache, effektive Protokoll für die Verwendung des Immunfluoreszenzfärbung auf therapeutische Behandlung im Barrett-Ösophagus-Zellen zu beurteilen.

Adenokarzinom des Ösophagus (EAC) hat eine Gesamtüberlebensrate von weniger als 17% und die Häufigkeit von EAC hat sich in den vergangenen zwei Jahrzehnten gestiegen. Einer der primären Risikofaktoren EAC Barrett-Ösophagus (BE), ein metaplastischen Veränderungen der normalen Plattenepithel Speiseröhre in Reaktion auf chronische Sodbrennen. Trotz der etablierten Verbindung zwischen EAC und BE, Abfrage der molekularen Ereignisse, insbesondere veränderte Signalwege unter Beteiligung Progression sein, EAC, werden kaum verstanden. Vieles davon ist aufgrund des Fehlens von geeigneten in vitro-Modelle zur Verfügung, um diese Krankheiten zu untersuchen. Kürzlich immortalisierenden Zelllinien sind im Handel erhältlich so dass für in vitro Untersuchungen von BE. Hier stellen wir ein Verfahren zur Immunfluoreszenzfärbung von immortalisierenden Zelllinien, so dass in-vitro-Charakterisierung von Zellsignalen und der Struktur nach der Belichtung, um therapeutische Verbindungen. Anwendung dieser Techniken wird help entwickeln Einblick in die Mechanismen sein, um EAC Progression beteiligt und bieten potenziellen Möglichkeiten für Behandlung und Vorbeugung von EAC.

Barrett-Ösophagus (BE) ist eine metaplastischen Veränderung der normalen Plattenepithel der Speiseröhre und Folge einer chronischen Exposition gegenüber den Mageninhalt von gastroösophagealen Reflux-Krankheit (GERD) ¹ resultieren. BE wird gedacht, um ein Schutzmechanismus in Reaktion auf GERD sein, aber die Anwesenheit von BE verleiht ein erhöhtes Risiko für Speiseröhrenkrebs Adenokarzinom (EAC), eine Krankheit, die eine deutlich schlechte Überlebens ¹ trägt. Aktuelle Schätzungen gehen davon aus, dass bis zu 5,6% der amerikanischen Bevölkerung haben sich jedoch als BE ist oft asymptomatisch, es wird vermutet, dass die Mehrheit der BE bleibt unerkannt ^2. Als Inzidenzraten sowohl GERD und EAC haben weitere Wachstum ³ zu sehen, ist es wichtig geworden, um die molekularen Mechanismen in der Progression von BE zu EAC Beteiligten verstehen, insbesondere da diese Informationen könnte möglicherweise therapeutische Ansätze zur Verhinderung der Progression werden, um EAC.

Patienten gerichtet Studien haben in der aktuellen Paradigma der BE-EAC Pathogenese ¹ geführt. Chronische Entzündungen, Verletzungen und gentoxische Schäden durch längere Einwirkung von Mageninhalt ausüben resultierende Selektionsdruck auf der BE-Läsion Förderung neoplastischen Progression zu EAC. Eine Reihe von genetischen Veränderungen identifiziert wurden während EAC Progression BE. Doch trotz dieser gibt es einen deutlichen Mangel an Verständnis über die genauen Änderungen in der Zellsignalisierung und Folgewirkungen auf Zellstruktur und Funktion.

In vitro Zellinien immortalisiert sind nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Wirkungen von Zellsignalen, insbesondere bei der Untersuchung der Auswirkungen der gezielten therapeutischen Verbindungen. Die jüngste kommerzielle Verfügbarkeit von verewigt Zelllinien erlaubt für solche Studien. Obwohl Hochdurchsatz-Assays, wie etwa die weit verbreitete Lebensfähigkeitstests, kann wertvoll in der Beurteilung der Auswirkungen von gezielten Therapien bei der Zellproliferation und-su seinrvival ^4-6, sind diese Tests nicht sinnvoll, für die Abfrage der Auswirkungen der Zellsignalisierung auf Zellmorphologie. Immunfluoreszenzfärbung (IF) ist eine nützliche Technik für die Untersuchung der Wirkungen von zielgerichteten Therapien auf den morphologischen, Wachstum und Überleben von Zellen und Eigenschaften der Proteine, die beteiligt sind. Unser Labor hat diese Methoden zu verewigen Zelllinien angepasst, mit IF, um die Auswirkungen einer klinisch verfügbare Medikament auf BE-Zelllinien in der Hoffnung auf eine mögliche Abgrenzung chemopreventative Behandlung und Biomarker für die medikamentöse Behandlung ⁷ zu beurteilen. Ähnlich Anwendung dieser Techniken in EAC, BE und verewigt Speiseröhre Zelllinien hat kritische Feststellungen zu werden, um EAC Progression ^8-10 abgegrenzt. Wir finden, ZF-Analyse von BE-Zellen mit gezielten Therapien behandelt hat einen Wert, so dass für die Charakterisierung von Veränderungen in der Zellstruktur und Proteinlokalisierung. Hier präsentieren wir unsere Methoden für ZF von verewigt Zellen characterize medikamentöse Behandlung.

1. Zell Line Maintenance

1. Immortalisierte menschliche BE hochgradigen dysplastischen (CP-B,-C CP, CP-D) und metaplastischen (CP-A) Zelllinien durch stabile Transfektion von menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) Protein ^11.
2. Aufrechtzuerhalten Zelllinien in Keratinozyten-Medium mit Rinderhypophysenextrakt (BPE), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 5% fötales Rinderserum (FBS), nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), Penicillin-Streptomycin-Neomycin (PSN) ergänzt und Standard Gewebekulturbedingungen (37 ° C, 5% CO _2, 98% Luftfeuchtigkeit).

2. BE Zellüberzug

1. Herstellung von 12-Well-Platte / Deckgläser. Zeigen 18 mm Deckgläschen in eine Glaspetrischale und Autoklaven. Über autoklaviert 18 mm Deckgläschen in eine 12-Well-Gewebekulturschale mit einem sterilen Glaspipette mit einer Vakuumröhre angebracht. Mit sterilem PBS-und Medien Waschen Sie das Deckglas.
2. Trypsinize und zählen verewigt Zellen. Zählen von Zellen using eines automatisierten Zellzähler oder einer Zählkammer. Verdünnte Zellen in Kulturmedien in einer Konzentration von 20.000-40.000 Zellen / ml.
3. Platz 1 ml der Zellen in jede Vertiefung, die ein Deckglas für eine Gesamtzellzahl von 20.000-40.000 Zellen / Well.
4. Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze schieben das Deckglas auf den Boden des Brunnens, um sicherzustellen, dass die Zellen heften sich an die Deckglas.

3. Drug Treatment von BE Cells

1. Verdünnen gewählte Medikament in warm (37 ° C) Medien bis zur gewünschten Konzentration und gut mischen durch Umdrehen des Röhrchens wiederholt oder mit einem Vortex-Mixer. Entschlossen Wirkstoffkonzentrationen empirisch. Beginnen Sie die Behandlung 24 Stunden nach der ersten Aussaat der BE-Zellen, Zellen Befestigung auf dem Deckglas ermöglichen
2. Zum Vergleich und zur Kontrolle, Behandlung eine zusätzliche Deckglas von BE-Zellen mit 0,1% Fahrzeug (Dimethylsulfoxid [DMSO] oder Mittel verwendet, um die Verbindung löslich) in Kulturmedien verdünnt. Bezeichnungsschild mit einem Stift, um Drogenlabor erkennen und vezeug behandelten Proben. Zeigen Zellen in einer Zellkulturbrutschrank auf 37 ° C, 5% CO _2, 98% Luftfeuchtigkeit eingestellt und Inkubation für gewünschten Zeitpunkten.

4. Immunfluoreszenzfärbung

1. Fixierung
   1. Nach der gewünschten Inkubationszeit der medikamentösen Behandlung, saugen die Medien und waschen Sie die Deckgläser schnell mit 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei Raumtemperatur (RT, 25 ° C).
   2. Saugen Sie den PBS und 1 ml PBS mit 4% PFA [4% PFA / PBS] in jede Vertiefung und Inkubation bei RT für 30 min.
   3. Saugen Sie den 4% PFA / PBS und waschen Sie die Deckgläser 3x, jeweils 5 min mit PBS bei RT. Speicher Deck für eine Woche in PBS/0.1% PFA bei 4 ° C, wenn gewünscht.
2. Permeabilisierungs / Sperrung
   Durchdringbar befestigt PFA Zellen der Antikörper an die intrazellulären Targets zugreifen können. Für extrazelluläre Proteine ​​taucht, führen alle nachfolgenden Schritte ohne Saponin auf die 1x PBS/0.5% BSA-Lösung gegeben.
   1. Hintergrund reduzieren durch Inkubation mit 50 mM NH ₄ Cl in PBS für 10 min bei RT verdünnt und gründlich mit PBS RT einmal für 5 min.
   2. BE Zellen Inkubation 30 min bei 100-300 &mgr; l PBS, enthaltend 0,1% Saponin und 0,5% Rinderserumalbumin (BSA). Verdünnen Saponin vom Filter-sterilisiert 10% Lager, in Wasser hergestellt und bei 4 ° C gelagert
   ANMERKUNG: Dies verhindert, dass nicht-spezifische Bindung von Antikörpern an zellulären Proteinen durch Blockierung Deckgläser durch die Zugabe von 0,5% BSA. Alternativ ersetzen BSA mit Ziegenserum verdünnt auf 5% zu reduzieren, um zu helfen unspezifische Bindung von Antikörpern.
3. Herstellung von Human-Kammer
   1. Bereiten Sie einen Platz Bioassay Gericht durch Schichtung der Boden der Kammer mit feuchten Papiertüchern und legen Sie eine Schicht von Parafilm an der Spitze.
   2. Sanft übertragen Sie die Deckgläser, Zellen nach oben, auf die Parafilm mit einer Pinzette und einer Spritzennadel.
   3. Markieren Sie die Parafilm mit einem Stift auf Deckgläser Labor identifizieren.
4. Primäre Antikörper-Inkubation
   1. Verdünnte den primären Antikörper in PBS sowohl 0,5% BSA und 0,1% Saponin.
   2. Tupfen Sie die Blockierungslösung mit einer Labor Gewebe und 100 ul des primären Antikörperlösung. Inkubieren des primären Antikörpers auf den BE-Zellen über Nacht bei 4 ° C.
5. Sekundäre Antikörper Inkubation
   1. Waschen Sie die Objektträger 3x mit PBS/0.5% BSA/0.1% Saponin für jeweils 5 min bei RT.
   2. Verdünnte sekundäre Antikörper mit einem fluoreszierenden Marker in PBS/0.5% BSA/0.1% Saponin, daß der sekundäre Antikörper erkennt die Art, in welcher der primäre Antikörper gezüchtet wurde, konjugiert.
   3. 100 l des verdünnten Antikörpers an jedem Deckglas. Inkubieren des sekundären Antikörpers für 2 h bei RT.
6. Waschen und Montage der Deckgläser
   1. In PBS/0.5% BSA/0.1% Saponin Waschen Sie die Deckgläser 3x, jeweils 5 min. Entfernen Sie den Waschpuffer und fügen 100-300 ul PBS zu den Deckgläsern.
      HINWEIS: Bei DoppelantiKörperfärbung, wiederholen Sie die Schritte 4,4-4,5 mit dem gewünschten zusätzlichen Primär-und Sekundärantikörpers nach Informationen in der Diskussion skizziert.
   2. Mit einer Pinzette vorsichtig heben das Deckglas und tupfen Sie das PBS mit einem Labor Gewebe-oder Papiertuch.
   3. In 15 ul einer geeigneten anti-fade Montage Medien mit 4 ',6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) mit dem Deckglas und invertieren die Deck, Zellen nach unten, auf einem Glasobjektträger.
   4. Legen Sie die Folien in eine Folie Ordner und Inkubation vor Licht über Nacht bei RT, damit die Fest gesetzt anti-fade Medium zu heilen, nach den Anweisungen des Herstellers. Nachdem die Anti-verblassen Medium eingestellt, können Folien entweder bei 4 ° C oder -20 ° C bis mikroskopische Visualisierung gespeichert werden.

5. Mikroskopische Visualisierung der Deckgläser

Gefärbte Zellen können entweder über die konfokale Mikroskopie oder abgebildet werden IF in der Lage aufrecht mikroskopischE. Obwohl der konfokalen Mikroskopie liefert Bilder mit hoher Auflösung an diskreten Tiefen, ist eine aufrechte mikroskopisch in der Lage, brauchbare Bilder schneller. Aus Gründen der Kürze, Bunt ein Verfahren zur Bildgebung von Zellen unter Verwendung von Standardmikroskopie dargestellt. Im allgemeinen, um Bild Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder ähnliche Fluorophore (dh das grün fluoreszierende Protein), Texas Red und DAPI, erfordert ein Mikroskop mit Filtern, die Unterscheidung dieser Fluorophore. Überprüfen Sie das Mikroskop vor Beginn Protokoll, um kompatibel Fluorophore zu bestimmen.

1. Imaging auf einem Standard-IF-Mikroskop
   1. Entfernen gespeicherten Objektträger / Deck von -20 ° C oder 4 ° C und ihnen erlauben, auf Raumtemperatur erwärmen. Power on Mikroskop und Quecksilberdampflampe.
   2. Zeigen Objektträger mit Deckglas zugewandte Objektiv auf Mikroskoptisch. Für den Einsatz eines Ölimmersionsobjektiv, einen Tropfen Immersionsöl auf Deckglas.
   3. Wählen Sie das DAPI-Filter und öffnen Sie den Auslöser.
   4. Konzentrieren Sie sich das Ziel, während Sie durch die Okulare, bis das Bild erscheint. Da alle Zellen mit DAPI Fleck, sollten die Kerne leicht zu beobachten sein.
   5. Sammeln von Bildern mit entsprechenden Bildverarbeitungs-Software.

Ein Beispiel für die von der Anwendung der beschriebenen Verfahren erhaltenen Ergebnisse ist in den 1A-D veranschaulicht. Die Deckgläser mit CP-D-und CP-C BE Zellen wurden für 24 h mit 1 uM der Src-Familie-Inhibitor, SKI-606, oder Vehikel (DMSO) behandelt und gefärbt mit den oben beschriebenen Verfahren für die Adherens Junction und Wnt-Signalprotein, β -Catenin. Visualisierung von β-Catenin wurde durch Markierung mit einem Anti-Kaninchen-IgG zu einem grünen Fluorophor gekoppelt erreicht, während die Kennzeichnung des Zellkerns wurde durch Markierung mit DAPI (blau) durchgeführt. Die Deckgläser wurden auf Objektträger montiert mit Festmontage eingestellt und die Zellen wurden mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskop mit einem Plan-Apochromat 63X/1.4N Ziel abgebildet. Die gewählte grün Fluorophor wurde bei 488 nm angeregt und sichtbar gemacht mit einem Emissionsfilter bei 505 bis 525 nm auf. In ähnlicher Weise wurde DAPI bei 405 nm und Emission gesammelt unter Verwendung eines Filters bei 410-460 nm angeregt wird. Aktivität der Tyrosinkinase Src is erhöht in BE, vor allem in hochgradigen Dysplasien ^12. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen in Darm-und Prostatakrebs-Zellen ^13-15, Hemmung der Src ergibt Relokalisierung von β-Catenin aus dem Cytoplasma / Kern (Pfeile, Fig. 1A, 1C und 1E) an der Zellmembran (Pfeilspitzen, Fig. 1B, 1D und 1F). Diese Techniken haben wir und andere zuvor gezeigt, dass die Inhibierung von Src verändert auch die Expression und Lokalisation der Tumorsuppressor p27 ^{Kip1 7,16} und diese Verfahren werden derzeit in unserem Labor.

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1. ZF von immortalisierenden Zellen nach der Behandlung mit einem Inhibitor der Src-Kinase. CP-C (AD) und CP-D (E, F) Wurden mit Vehikel (DMSO, links Platten) oder 1 uM des Src-Inhibitor, SKI-606 behandelt, 24 h (rechts Panels). BE-Zellen wurden nach dem beschriebenen Protokoll fixiert und gefärbt. β-Catenin (grün) wurde unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers und eines sekundären Antikörpers an Alexa Fluro 488 gekoppelt visualisiert, während der Kern wurde mit DAPI (blau) gefärbt. Beachten Sie die Änderung in der Lokalisierung für β-Catenin aus dem Kern (Pfeile) auf der Zellmembran (Pfeilspitzen) nach Behandlung mit SKI-606. C, D) vergrößerter Bilder in weißen Feldern A und B, das weiterhin die Änderungen in β-markieren Catenin-Lokalisierung. Diese Bilder stellen ideale Färbung mit minimaler Hintergrundfärbung und deutlich für das gewählte Ziel. Bars, 7 um (A, B, D, F), 0,5 &mgr; m (C, D).

Wir haben ein Verfahren für die Anwendung der IF von BE-Zellen in Richtung der Aufklärung der physiologischen Wirkungen von zielgerichteten Therapien bei diesen Zellen beschrieben. Zwar haben wir die Verwendung dieser Verfahren zur BE-Zellen beschrieben, haben wir gefunden, daß diese Verfahren auch auf eine Vielzahl von verschiedenen Zelltypen ^13,17,18. Ferner können diese Verfahren auf verschiedene Weise zu Färbung für bestimmte Ziele zu optimieren verändert werden.

Wir finden einen Parameter, die eine direkte Wirkung auf die richtige IF hat, ist die Wahl der Fixierung. Wir haben die Verwendung von 4% PFA / PBS für die Fixierung in den oben beschriebenen Verfahren, aber alternative Fixiermittel sind ebenfalls anwendbar. Fixierung mit kaltem Methanol (-20 ° C) für 20 min nach dem Waschen mit PBS ist für bestimmte Proteine ​​/ Antikörper ^13. Verwendung von kaltem Methanol zur Fixierung negiert die Notwendigkeit, Zellen permeabilisieren. Jedoch ist die Wahl der Fixierlösung (4% PFA / PBS oder kaltem Methanol) empirisch ermittelt werden muß.

Die oben beschriebenen Verfahren beschreiben Visualisierung eines einzelnen Proteins; jedoch ist dieses Verfahren leicht an die Identifizierung eines weiteren Ziel ^13. Für optimale IF von zwei Proteinen, Primärantikörper in zwei verschiedenen Spezies (z. B. ein vom Kaninchen und eine in der Maus) und sekundäre Antikörper spezifisch erkennt jede Spezies zu verschiedenen Fluorophoren gekoppelt angehoben, notwendig sind. Sekundärantikörper, grüne und rote Fluorophore, kombiniert mit DAPI gekoppelt bieten einen ausgezeichneten Kontrast zwischen den Zielen, zusätzlich zu allgemeinen keine Interferenzen von den Fluorophoren. Für ZF von zwei Zielen in BE Zellen, führen sequentielle Inkubation von zwei primären und ihre jeweiligen Sekundärantikörper folgende Fixierung. Schritte zum Waschen und Lagerung der Folien gleich bleiben.

Zusammenfassend stellen wir eine einfache und nützliche Protokoll für IF von BE-Zellen. Die Anwendung dieser Verfahren können informat ergebenIonen über die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung, die Einführung einer Eileiter Gene von Interesse, oder RNAi Herunterregulation der Gene von Interesse in BE-Zellen.

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem St, Joseph-Stiftung (AJF, LJI) und American Lung Association, RG-224607-N (LJI) unterstützt.