Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Çeşitli bakteri türleri yüzeylere bağlanmasına ve biyofilm olarak adlandırılan ince film şeklinde kolonize yeteneğine sahiptirler. Gözenekli ortamda büyümek Biofilmler atık su arıtımı ve CO ₂ haciz gibi çeşitli endüstriyel ve çevresel süreçlere alakalı. Biz taklit eden gözenekli ortam mikroakışkan bir cihaz biyofilm oluşumunu araştırmak için, Pseudomonas fluorescens'in Gram-negatif aerobik bakteri kullanılır. Mikroakışkan cihaz yumuşak litografi kullanarak fabrikasyon edildi mikro-mesajların bir dizi oluşur. Daha sonra, akış ile bu cihazlarda biyofilm oluşumu araştırıldı ve bizim cihazda flamalar olarak bilinen ipliksi biyofilm oluşumunu göstermektedir. Imalat ve mikroakışkan cihazın montajı için ayrıntılı protokolleri, bakteriyel kültür protokolleri ile birlikte burada sağlanmaktadır. Mikroakışkan cihaz ile deney için detaylı prosedürler de temsilcisi ile birlikte sunulmuşturSonuçlar.

Son zamanlarda, gözenekli ortam ¹ ​​taklit mikroakışkan bir cihaz bakteriyel biyofilm oluşum dinamiklerini göstermiştir. Bakteriyel biyofilm esasen hücre dışı polimerik maddelerin ^{(EPS), 2-4} ile kaplı olan yüzey toplanan bakteri kolonileri vardır. Bu bakteri ince filmler düz yüzeylerinden gözenekli ortamın çok daha karmaşık yaşam kadar neredeyse her hücresi meydana gelebilir. Valiei ve ark. ¹ gözenekli bir ortam yapısının simüle etmek için mikro-ayağı bir dizi olan bir mikroakışkan olarak kullanmış ve sıvı akış hızının bir fonksiyonu olarak, bu cihazda biyofilm oluşumunu inceledik. Onlar belli bir akış rejiminde, flamalar olarak bilinen ipliksi biyofilm farklı sütunlar arasında ortaya çıkmaya başladı bulundu. Streamers birinde gergin edilebilir ya da her iki katı yüzeylere uçları, ancak, yapının geri kalan sıvı içinde süspansiyon haline getirilir. Flama oluşumu, tipik olarak başlar biyofilm bir ilk tabaka oluşturulmuş ve biçimi sonraiyon tür karmaşık habitatlarda biyofilm uzun vadeli evrim dikte edebilirsiniz. Son zamanlarda, bazı araştırmacılar flama formasyonu dinamiklerini araştırdık. Yezdi'nin ve diğ. ⁵ flamalar bir salınım kabarcık kaynaklanan dikey akışlarında meydana getirdiğini göstermiştir. Başka bir deneyde, Rusconi ve ark. ⁶ flamalar oluşumu üzerine kanal eğrilik ve kanal geometrisinin etkisini araştırdık. Bunlar flamalar mikrokanallar kavisli bölümlerde bir şekilde meydana getirdiğini, morfoloji ve kanal motilitesi ile ilgilidir. Son zamanlarda yapılan araştırmalar flamalar bunlar gözenekli arabirimleri olgun yapıların oluşturulması için ön madde olarak hareket edebilir gibi, çeşitli doğal ve yapay senaryolarda geniş etkilere sahip bir biyomedikal sistemlerde hızlı ve katastrofik biyofilm proliferasyonuna yol açan ve aynı zamanda önemli bir akış-neden olduğunu göstermiştir yapı etkileşimleri, vb ^1,7-9.

Biyofilm flamalar genellikle i oluştururlargibi gözenekli medya gibi n kompleks habitatları. Gözenekli ortam ortamında anlama biyofilm büyüme örneğin _CO2 tutumu ¹¹ olarak iyi durumlarda delikli bütünlüğünü korumak ve toprakta ¹² deliklerinin tıkanmalarını biyolojik atık su arıtma ¹⁰ gibi, çok sayıda çevresel ve endüstriyel işlemler için geçerlidir. Bu tür karmaşık habitatlarda biyofilm oluşumunu gözlemleyerek genellikle nedeniyle gözenekli ortamın opaklığına zor olabilir. Gerçek zamanlı ve yerinde izleme izin gibi durumlarda, Mikroakiskan bazlı gözenekli medya platformları son derece avantajlı kanıtlayabilirim. Mikroakiskan diğer bir avantajı, tek bir biyo-mikroakışkan platform üzerinde birden fazla biyoreaktörler oluşturmak ve aynı anda online izleme ve / veya sensörler dahil edilmesi için izin vermek için yeteneğidir. Tek bir cihazla ve doğru istatistiksel analiz için önemli bir ilgili veri toplamak için yeteneği birden laboratuar deneyleri uygulamak için esneklik önemli bir zarf olduğunuakışkan sistemleri ^13,14 antage.

Yukarıdaki tartışmanın bağlamında, bir gözenekli ortam maddesi ortamında anlama flama oluşumu dinamik çeşitli uygulamalara faydalı olacaktır. Bu çalışmada, taklit eden gözenekli ortam cihazında flama oluşumunu araştırılması için protokol geliştirmek. Mikroakışkan platformu Fabrikasyon, hücre kültürü ve deney için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Deneylerde, Pseudomonas fluorescens, yabani tipteki, bakteri soyu kullanıldı. S. toprakta doğal olarak bulunan fluorescens, toprak ekolojisine ¹⁵ sağlanması bakımından önemli bir rol oynar. Kullanılan bakteri soyu genetik kurucu yeşil flüoresan protein (GFP) ifade etmek üzere mühendislik edilmiştir.

Aşağıda tarif edilen sırayla burada deney protokolleri gerçekleştirir. Mikroakışkan platform oluşturmak için mikroimalat protokoller 1. Adım 2 bakteri kültürü protokolü (Şekil 2) açıklar ve Adım 3 deney düzeneği (Şekil 3) montaj ilgilidir Adım tartışılmıştır. Son olarak, gerçek deneysel bir süreç Aşama 4'te tarif edilmektedir.

1. Chip Fabrikasyon Prosedürü

NOT: Özgün güvenlik prosedürleri aşağıda açıklanan işlemleri için takip edilmelidir. Ayrıntılar için kurumsal güvenlik görevlisine danışın.

1. Uygun bir yazılım (örneğin, L-Edit) ile maske tasarlayın. Kanal tasarımı genişliği 625 mikron, bir ana mikro-kanal oluşur. Kanalın merkez bölge çapında 50 mikron, (Ek Dosyaları bak) birbirinden 25 mikron aralıklı mikro mesajların bir dizi içerir.
2. Camına bu tasarım yazdır (5 "x 5" soda kireç camı), "0.09 bir kalınlığa sahiptir ve bir fotoğraf maske hazırlamak için maskeleme ile, krom (Cr), yaklaşık 70 nm kalınlığında bir tabaka ile kaplanmıştır. Kullanımlar AZ400K geliştirici 1 dakika boyunca edilmektedir. Sonra Cr pürüzlendirici kullanarak Cr katman etch yaklaşık 1 dakika boyunca karşı ve soğuk pirana çözeltisi ile temizleyin şerit aseton kullanın. (H ₂ SO ₄ ve H 3 ₂ oranında O _2: 1).
3. Fotolitografi
   1. 20 dakika boyunca piranha çözümü ile kimyasal bir standart 4 "silikon gofret temizleyin.
   2. DI su ile durulayın gofret ve kurulayın.
   3. Sıcak bir levha (15 dakika 200 ° C) gofretin ısıtın.
   4. Kaplayın Fotorezist ile silikon gofret. Burada, pozitif fotorezist AZ4620 12.5 mikron kalınlığında bir tabaka elde edilmesi için 25 saniye boyunca 2000 rpm'de bir silikon gofret üzerinde yan kaplanmıştır.
   5. 100 ° C de azot akımı ile 90 saniye boyunca gofretin yüzen sıcak bir plaka üzerinde, ince bisküvinin tüm yumuşak pişirme çözücüyü çıkarın. Daha sonra, t vakumda tutun60 saniye boyunca o aynı sıcaklığı.
   6. Dehidrasyon için 24 saat için karanlık bir kutu içinde gofret yerleştirin.
   7. Fotorezist için tasarlanmış desen transfer etmek için UV ışığına gofret Açığa.
   8. 240 sn Fotorezist geliştirici solüsyon (AZ400K) olarak gofret daldırın. Daha sonra, izopropil alkol ile gofret yıkayın ve bir azot gazı akımı içinde yerleştirerek kurutun.
4. ICP-DRIE (ICP - Derin Reaktif İyon Dağlama) Süreci
   1. DRIE aşındırma uygulayın. Cihaz için gerekli nihai derinliği (bu soruşturmada 50 mikron) göre uygun rölyef derinliği seçin. Fotorezist Bu işlem sırasında, bir maskeleme tabakası olarak görev yapar.
   2. Aseton ile kalan photoresist'i çıkarın ve gofret temizleyin.
5. PDMS (polidimetilsiloksan) Döküm
   1. Silikon ana kalıp Silanizing için trichloromethylsilane (TCMS) kullanın. Bir cam şişede trichloromethylsilane 2 veya 3 damla dökün ve yanında bir desikatör içine yerleştirinsilikon ana kalıp. Silanizing işleminin tamamlanması için 2-3 saat izin verin.
   2. PDMS hazırlamak için 1: Ayrı bir kapta, 10, ağırlıkça oranı ile sertleştirme maddesi ile Sylgard 184 silikon taban karıştırın. Koşulları (yaklaşık 2 saat), vakum tabi tutarak PDMS gaz boşaltılır.
   3. , Bir taşıyıcı içinde silikon ana kalıp koyun. Daha sonra PDMS damga oluşturulması için silikon ana kalıp üzerindeki PDMS dökün. Kabarcıklar bu süreçte PDMS formu etmediğinden emin olun.
   4. 80 ° C'de 2 saat boyunca PDMS Cure.
   5. Peel ana kalıp PDMS damga kapalı. Ardından, PDMS ayrı mikroçip içine damga kesti. Son olarak, giriş (ler) ile çıkış (lar) için delikler kesme çekirdek kullanın.
6. Glass PDMS yapıştırılması
   1. 30 saniye boyunca oksijen plazma kapak kayma ve PDMS damga Açığa. Kapak kayma Bond PDMS damgası.
   2. PDMS damga ve kapak kayma arasında düzgün bir sızdırmazlık elde etmek için, 10 dakika boyunca 70 ° C 'de fırında koyarak cihazı tavlanması.

2. Bakteriyel Kültür

NOT: Özgün biyogüvenlik protokolleri Adımlar 2-4 takip edilmelidir. Ayrıntılar için kurumsal güvenlik görevlisine danışın.

1. LB agar kaplarının üzerine hazırlanması
   1. 1 L'lik bir şişeye, 20 g Luria-Bertani (LB) agar (Miller) tozları ve ultra saf su 500 ml ilave edilir. Tozu eritmek için karıştırın.
   2. 15 psi, 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavda tutarak sterilize edin.
   3. Şişe, bir tezgah veya biyo-güvenlik başlığı içinde bir su banyosu içerisinde 50-55 ° C'ye kadar soğumasına izin verin.
   4. 50 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için antibiyotik tetrasiklin ekleyin. Dönen ile iyice karıştırın.
   5. Plakalar içine dökün. Tam 2/3 - 1/2 kadar her plaka doldurun.
   6. Alev hava bunların oluşturdukları takdirde onları pop kısaca kabarcıklar. Katılaşmış hava kabarcıkları üzerinde bakteri kültürünü yaymak için zordur.
   7. Plakalar, oda sıcaklığında gece boyunca soğumaya bırakın.
   8. Serin olduğunda,, kendi kovan geri tabak koymak 4 ° C'de çanta, etiket (antibiyotik ve tarih), ve mağaza mühür.
      NOT: çok ışık antibiyotikler devre dışı bırakır gibi, kalay folyo ile plakaların stok örtün.
2. LB suyu hazırlama
   1. 20 gr Luria-Bertani (LB) suyu (Miller) tozları ve bir şişeye 1 ultra saf su ilave edin. Tozu eritmek için karıştırın.
   2. 15 psi, 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavda tutarak sterilize edin.
   3. Şişe bir bankta ya da biyogüvenlik kaput bir su banyosunda 50-55 ° C'ye kadar soğumasını bekleyin.
   4. 50 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için antibiyotik tetrasiklin ekleyin. Dönen ile iyice karıştırın.
   5. Soğuyunca, 4 ° C'de etiketli şişe yerleştirin.
      NOT: çok ışık antibiyotikler devre dışı bırakır gibi, kalay folyo ile şişeyi örtün.
3. LB Agar Plate Kültür Bakteri (Bu protokolü kullanan Pseudomonas fluorescens'den)
   1. (Dondurucu -80 ° bakteriyel stok atınC) ve buz üzerine yerleştirin.
   2. -80 ° C bakteri stok ve biyogüvenlik kaput içinde bir LB agar plaka yerleştirin.
   3. Şerit bir zik ​​zak usul içinde, LB agar plakası üzerinde bakteri suşu. Agar plaka örtün ve gece boyunca 30 ° C'de inkübe. Son olarak, 4 ° C'de buzdolabında plaka saklayın.
4. Bakteriyel Çözüm hazırlayın (S1)
   1. Bir Otoklavlanmış balona 50 ml LB suyu ortamı dökün. Bir biyogüvenlik kaput içinde bu işlemi gerçekleştirin.
   2. Şişeye LB agar plaka tek bir bakteri koloni aktarın. Bu işlem, aynı zamanda biyo-güvenlik kaput içinde yapılmalıdır.
   3. 30 ° C ve yeterli bir süre (4 saat) boyunca 150 rpm'de bir gece boyunca kuluçkaya yatırılmaktadırlar şişeyi koyun.
5. Bakteriyel seyreltin Solüsyonu (S2) hazırlanması
   1. Steril bir plastik tübe 5 mi LB suyu ortamı dökün.
   2. LB suyu medya ile karıştırılarak S1 sulandırmak. Daha sonra, çözelti vorteks. Çözelti, istenen optik elde seyreltinarkadaşları yoğunluk (OD 600 nm = 0.1 ölçülen).
      NOT: Biyofilm deneyler genellikle bu civarda OD değerleri kullanır.

3. Deneysel Setup hazırlayın

1. Cımbız mikroçip girişine (ler) ve çıkış (lar) içine esnek plastik borular (0.20 "kimliği) bağlayın. Girişleri ve çıkışları daha önce mikroçip (adım 1.5.5) PDMS kısmına açılmıştır. Bu araştırmada , mikroçip iki giriş ve bir çıkış içerir.
2. Bakteri çözeltisi (S2 çözeltisi) şırınga (ler) doldurun ve şırınga (ler) tüm kabarcıklar çıkarın.
3. Giriş borusu (ler) içine şırınga ucu (ler) (30 G 0.5 "künt iğne) bağlayın. Ardından, konteyner atık çıkış tüp (ler) bağlayın.

4. Deney çalıştırın

1. Şırınga ucunun (ler) için bir enjektör (ler) takın.
2. Şırınga pompası üzerine yerleştirin ve düzeltme şırınga (ler). Daha sonra desir objektifinde sahip bir optik mikroskop altında yer mikroçiped büyütme (örneğin, 40X). Bakteri üremesi (P. 30 ° C fluorescens'in) için sabit bir sıcaklık ortamı korumak için canlı bir hücre odası cihazı ile mikroçip örtün.
3. Istenen akış hızı seviyeye pompayı (diyelim ki 10 ul / saat) olarak ayarlayın ve akışkan pompalama başlatmak.
4. Bakteriler haznesine sonra, biyofilm oluşumu da başlatılır. Biyofilm oluşumu ve olgunlaşma tipik olarak birkaç saat ya da günlük bir süre içinde meydana gelir. Gözlemleyin ve mikroskop aracılığıyla biyofilm büyüme görüntüleri çekmek.

Yukarıda bahsedilen protokolü kullanarak mikroüretim, PDMS göre mikroakışkan cihaz inşa edilmiştir. 1 taramalı elektron mikroskobu (SEM) PDMS görüntüleri göstermektedir cihazı. Şekil 1a, aygıtın giriş bölümünü göstermektedir. Bir çatal benzeri giriş cihaz üzerinde basınç başını eşitlemek için oluşturulur. Ayrıca SEM görüntüleme ayrıca ayağı duvarları (Şekil 1b) neredeyse dik olduğunu gösterdi. Kültürlenmiş bakteri çözeltisi (Şekil 2) ile seyreltildi ve optik yoğunluk 0.1 'lik bir değere ayarlandı. Biz, giriş akış oranının bir fonksiyonu olarak mikroakışkan cihaz biyofilm oluşumunu inceledik. Ne zaman P. Flüoresan 0.8 ul / saat, bakteri bağlanma düşük bir akış hızında cihazın içine enjekte edildi ve biyofilm oluşumunu cihazın duvarları meydana geldi. Hatta uzun bir süre (> 20 saat) sonra, yüzey-sarılma biyofilmlerde dışında başka bir bakteriyel yapılar biztekrar gözlenmiştir. Daha sonra, aynı deney 8 ul / saatlik bir akış oranında tekrar edildi. Bu durumda, biyofilm oluşumunu tekrar seyreltilmiş bakteri kültürü infüzyon birkaç dakika sonra başladı. Bununla birlikte, bir kaç saat sonra, mikro-sütunlar arasında uzanan lifli yapıların görünümü cihazı (Şekil 4) orta bölümüne yakın gözlenmiştir. Bu lifli yapılar hareketsiz bakterilerin varlığı sayesinde gözlemlenebildi. Bu yapılar, serpantin şekilde bilinmektedir ve sadece biri bağlanabilir veya her iki yüzeye de sonlanan bir ipliksi biyofilm bulunmaktadır. Yapının kalanı genellikle (burada olduğu gibi), sıvı ortam içinde süspansiyon haline getirilir. 4 biyofilm flama yapısının zaman gelişimi göstermektedir. Streamers genellikle viskoelastik biyofilmde akışkan kesme etkisine bağlı oluştururlar. Sütun 5, bir dizi geçen akış için etkin ve hız hatlarını göstermektedir. Benzetim flamalar gösterirBizim mikroakışkan sisteminde bir şekilde, esas olarak sıvı akış akım çizgileri boyunca hizalanır. Yapılarından ve biyofilm serpantin oluşumu arasındaki ilişki henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak Das ve Kumar ¹⁶ Son zamanlarda bu flamalar özünde viskoelastik biyofilmlerin yüksek kıvamlı sıvı devlet olarak oluşturmak olduğu ileri sürülmüştür. Onlar biyofilm flama formasyonu zaman ölçeği genellikle çok biyofilmlerin viskoelastik gevşeme zamanı ölçekler aşan gözlem kendi varsayım dayalı. Biyo-filmler gibi viskoelastik sıvılar davranır bilinen ve bu nedenle viskoelastik gevşeme zaman ölçeği çok daha büyük bir zaman ölçeklerinde, bunlar esas olarak yüksek ölçüde zor akışlı sıvı ¹⁷ davranır. Bu formülasyona göre, flamalar. Yüksek kesme gerilimlerinin yerlerde doğması beklenir 5 kanaldaki yüksek hızın konumlarını gösterir, ve bu yerler, yüksek kesme stresleri yerleri denk olabilir. İlk Pha büyüme se, flamalar bu yerlerde (Şekil 4) yakın geldiği görülmektedir.

Mikroakışkan kanal (üst görünüm) Şekil 1. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntüleri. a) Giriş bölümünde, mikro-sütunları içeren b) Bölge. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Bakteri kültürü içinde yer 2. Sıralı adımları Şekil. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Flamalar evrim Şekil 4. Time-lapse konfokal görüntüleme. Görüntü düzlemi = z cihazın 25 mikron, yani orta gelir. Kesik elips biyofilm flamalar göstermektedir. tıklayınızBurada bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil mikro-sütunlar geçmiş akış akıcılık ve hız hatlarını gösteren 5. Hesaplamalı akışkanlar mekaniği simülasyonları. Akışkan akışı alt ve hız ölçeğine üstten olduğu m / sn olduğunu. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Biz karmaşık habitatlarda biyofilm geliştirme eğitimi için gözenekli ortam taklit basit mikroakışkan cihazı gösterdi. Deneylerin sonucunu dikte birkaç kritik adımlar vardır. Bunlar cihaz geometrisini içermektedir. Sonrası geometri değişebilirken, flamalar oluşturmak için yeterli gözenek alanı gereklidir. Ayrıca, Valiei ve ark. ¹ flama formasyonu sadece belirli bir akış hızı aralığında meydana geldiğini göstermiştir. Bir eşik değerinden daha düşük akış hızlarında, serpantin haline biyofilm deformasyonu görülmemektedir. Yine belli bir başka eşik debi değerinin üzerinde, biyofilm kırık hakim ve flamalar oluşumunu izin veremeyiz. Bu deneyler veba başka konu mikro-ayağı dizide sıkışıp olabilir gaz kabarcıkları olduğunu. Genellikle bu kabarcıklar istenen değere giderek düşen bu durumda başlangıçta artan akış oranı ile ve kaldırılması gerekir.

Mikroakışkan platformlarıgibi bu çeşitli avantajları ve birkaç sınırlamalar sunuyoruz. Platform küçük bir kültür hacimleri ile çalışmak için bize sağlar ve kullanıcı-tanımlı özelliklerini birleştiren esnekliğe sahiptir. Örneğin, farklı gözenekli yapılar, mikro-dizi sütun geometrik parametreleri değiştirmek suretiyle simüle edilebilir. Gerçek gözenekli ortam rasgele yapısını taklit da yapılar mikroakışkan platformlar ¹⁸ imal edilebilir. Dahası, birkaç tür kanallar doğru istatistiksel analiz için önemli ilgili verilerin toplanması için izin tek bir cihaz üzerinde uygulanabilir. Bununla birlikte, mikro-akışkan sistemleri tipik olarak bir gözenekli ortam, iki boyutlu yapısını taklit eden. Gözenekli ortam üç-boyutlu doğasının taklit edebilen cihazlar genellikle imal etmek için oldukça zordur.

Flamalar oluşumu ve evrimi de henüz anlaşılmış değil, ve daha fazla araştırma bu yönde gereklidir. Flamalar oluşturan ve biçimine yol nasıl anlayışolgun biyofilm yapıların iyon kalp stentler, toprak biyofilmlerin ve filtrasyon sistemleri gibi biyomedikal cihazların tıkanması dahil senaryolar geniş bir yelpazede ile ilgili olacaktır. Bizim mikroakışkan platformu bu yönde atılmış bir adımdır.

The authors have nothing to disclose.

The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.