마이크로 기둥 미세 유체 장치에서 바이오 필름 보리 형성을위한 프로토콜

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

몇몇 세균 종은 표면에 부착 생물막 불리는 박막의 형태로 이들을 정착 할 수있는 능력을 갖는다. 다공성 매체에서 성장 바이오 필름은 폐수 처리 및 CO ₂ 격리 등의 여러 산업 및 환경 프로세스에 적합하다. 우리는 모방 다공성 지지체를 미세 유체 장치에서 biofilm 형성을 조사하기 위해, 슈도모나스 fluorescens 그람 음성 호기성 세균을 사용했다. 미세 유체 장치는 소프트 리소그래피를 사용하여 제조 된 마이크로 게시물의 배열로 구성되어 있습니다. 그 후, 흐름이 장치에서 biofilm 형성을 조사하고, 우리는 우리의 장치 깃발로 알려진 사상 바이오 필름의 형성을 보여줍니다. 제조 및 미세 유체 장치의 조립을위한 상세한 프로토콜은 세균 배양 프로토콜과 함께 여기에 제공됩니다. 마이크로 유체 장치와 실험에 대한 자세한 절차는 담당자와 함께 제공됩니다결과.

최근에, 우리는 다공질 ^일을 모방 한 미세 유체 장치에서 세균 biofilm 형성의 역 동성을 보여 주었다. 세균 바이오 필름은 기본적으로 세포 외 고분자 물질 (EPS) ^2-4으로 쌌다 아르 표면 집계 박테리아의 식민지입니다. 세균이 박막은 부드러운 표면을 다공성 매체의 훨씬 더 복잡 서식지에 이르기까지 거의 모든 생각할 수있는 틈새 시장이 형성 될 수 있기 때문이다. Valiei 외. ¹ 다공질 구조를 시뮬레이션하기 위해 마이크로 - 기둥 배열을 미세 유체 소자를 사용 및 액체 유량의 함수로서이 장치에서 바이오 필름 ​​형성을 연구 하였다. 그들은 특정 흐름 정권, 깃발로 알려진 사상 바이오 필름은 다른 기둥 사이에 등장하기 시작 것을 발견했다. 깃발에 닿는 일 수 있거나 둘 고체 표면에 끝나지만 구조의 나머지는 액체 중에 현탁된다. 보리 형성은 일반적으로 시작하는 바이오 필름의 초기 층 형성과 그 형식 후이온은 복잡한 서식지에서 바이오 필름의 장기적인 발전을 지시 할 수 있습니다. 최근 여러 연구자들은 유영 형성의 역학을 조사 하였다. 야 즈디 등. ^5는 깃발이 진동 거품에서 발생하는 와류 흐름에 형성 할 수있는 것으로 나타났다. 또 다른 실험에서, Rusconi가 외. ⁶ 깃발의 형성에 채널 곡률 및 채널 형상의 효과를 조사 하였다. 그들은 깃발이 마이크로의 굴곡 부분에 형성 할 수있는 것을 발견하고, 유영 형태는 운동과 관련이있다. 최근의 연구에 깃발들이 다공성 인터페이스에서 성숙 구조의 형성에 선구자 역할을 할 수 있습니다로, 다양한 자연과 인공 시나리오에서 폭 넓은 영향을 생물 의학 시스템에서 신속하고 치명적인 바이오 필름의 증식으로 이어질, 또한 상당한 플로우 기반을 일으킬 수 있다는 것을 보여 주었다 구조의 상호 작용 등 ^1,7-9.

바이오 필름의 깃발은 자주를 형성다공성 매체와 같은 N 복잡한 서식지. 다공성 미디어 환경의 이해 생물막 성장은 같은 CO ₂ 포집 ^11로 상황에서 잘 보어의 무결성을 유지하고 토양 ¹² 모공의 막힘 생물학적 폐수 처리 ^(10)로 여러 가지 환경 및 산업 공정에 관련이있다. 복잡한 서식지에서 바이오 필름의 형성을 관찰하는 것은 종종 의한 다공질의 불투명도에 도전 할 수 있습니다. 그들이 실시간 인 시츄 모니터링을 허용하는 이러한 상황에서, 마이크로 유체 기반 다공성 미디어 플랫폼은 매우 유리한 증명할 수있다. 마이크로 유체의 또 다른 장점은 단일 바이오 마이크로 유체 플랫폼에서 여러 생물 반응기를 구축하고 동시에 온라인으로 모니터링 및 / 또는 센서의 통합을 허용하는 능력이다. 하나의 장치 및 정확한 통계적 분석을 위해 상당한 관련 데이터를 수집하는 기능이 여러 실험실 실험을 구현하는 유연성 중요하다 ADV미세 유체 시스템 ^{(13, 14)의} ANTAGE.

위 설명의 문맥에서, 다공성 매체 환경에서 이해 유영 형성 역학은 여러 응용에 유익 할 것이다. 본 연구에서는 본뜬 다공성 매체 장치에서 스 트리머 형성을 조사하는 프로토콜을 개발한다. 미세 유체 플랫폼의 제조는, 세포 배양과 실험에 필요한 단계가 설명되어 있습니다. 실험에서는, 슈도모나스 fluorescens의 야생형 균주 사용 하였다. P. 토양에서 자연적으로 fluorescens는 토양 생태 ^(15)을 유지에 중요한 역할을합니다. 사용 된 균주는 유전자 구성 적으로 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현하기 위해 설계되었다.

아래에서 설명한 순서에 따라 여기에 실험 프로토콜을 수행합니다. 미세 유체 플랫폼을 만들기위한 미세 프로토콜은 1 단계 2는 세균 배양 프로토콜 (그림 2)에 대해 설명하고, 3 단계 실험 장치 (그림 3)의 조립에 관한 단계에서 설명합니다. 마지막으로, 실제의 실험 공정은 단계 4에서 설명한다.

1 칩 제조 절차

참고 : 적절한 안전 절차는 아래에 설명 된 프로세스에 따라야합니다. 자세한 내용은 제도적 안전 요원에게 문의하십시오.

1. 적절한 소프트웨어 (예를 들면, L-편집)와 마스크를 디자인합니다. 채널 디자인은 폭 625 μm의의 주요 마이크로 채널로 구성되어 있습니다. 채널의 중심 영역의 직경은 50 μm의가 (보조 파일 참조) 떨어져 25 μm의 간격 마이크로 게시물의 배열을 포함합니다.
2. 유리에이 디자인을 인쇄 (5 "× 5"소다 석회 유리), "0.09의 두께를 가지며, 포토 마스크를 제조하기 위해서 마스킹하여, 크롬 (크롬)의 약 70 nm 두께의 층으로 코팅된다. 사용 AZ400K 현상 제 1 분간 어느. 후, 크롬 에칭 제를 이용하여 크롬 층을 에칭 약 1 분간 레지스트 차가운 피라냐 용액으로 닦아 제거하는 아세톤을 사용한다. (H ₂ SO _4, H ₂ (3)의 _비율이 O : 1).
3. 포토 리소그래피
   1. 20 분 동안 피라나 용액으로 화학적으로 표준 4 "실리콘 웨이퍼를 청소합니다.
   2. DI 워터와 웨이퍼를 헹구고 건조.
   3. 핫 플레이트 (15 분 동안 200 ° C)에 웨이퍼를 가열.
   4. 코팅 된 포토 레지스트와 실리콘 웨이퍼. 여기서, 포지티브 포토 레지스트 AZ4620는 12.5 μm의 두꺼운 층을 얻기 위해 25 초 동안 2000 rpm으로 실리콘 웨이퍼 상에 스핀 - 코팅 하였다.
   5. 100 ° C에서 질소 흐름에 90 초 동안 웨이퍼를 부동으로 핫 플레이트에 웨이퍼의 소프트 베이킹의 모든 용매를 제거합니다. 이어서, t 진공에 유지60 초 동안 그는 같은 온도.
   6. 탈수 24 시간 동안 어두운 상자에 웨이퍼를 놓습니다.
   7. 포토 레지스트로 설계된 패턴을 전사하기 위해 UV 광에 웨이퍼를 노출.
   8. 240 초 동안 포토 레지스트 현상액 (AZ400K)에서 웨이퍼를 담근다. 이어서, 이소 프로필 알코올로 웨이퍼를 헹구고 질소 가스의 스트림에 배치하여 건조.
4. ICP-DRIE (유도 결합 플라즈마 - 딥 반응성 이온 에칭) 공정
   1. DRIE 에칭을 적용합니다. 장치에 필요한 최종 깊이 (이 조사에서 50 μm의)에 따라 적절한 식각 깊이를 선택합니다. 포토 레지스트는 이러한 프로세스 동안 마스크 층으로서 작용한다.
   2. 아세톤 남아있는 포토 레지스트를 제거하고 웨이퍼를 청소합니다.
5. PDMS (폴리 디메틸 실록산) 주조
   1. 실리콘 마스터 금형을 silanizing에 대한 trichloromethylsilane (TCMS)를 사용합니다. 유리 병에 trichloromethylsilane 2 ~ 3 방울을 붓고 옆에 데시 케이 터에 배치실리콘 마스터 몰드. silanizing 프로세스가 완료 될 때까지 2 ~ 3 시간을 허용합니다.
   2. PDMS를 제조 1 : 별도의 용기에서, 10의 중량비로 경화제와 실 가드 184 실리콘베이스를 혼합한다. 조건 (약 2 시간)를 진공 청소기로 청소하는 데 쓰는하여 PDMS를 가스를 제거한다.
   3. 홀더 실리콘 마스터 주형을 넣어. 이어서, PDMS 스탬프를 형성하는 실리콘 마스터 주형에 부어 PDMS. 거품이 과정에서 PDMS에 형성하지 않도록해야합니다.
   4. 80 ° C에서 2 시간 동안 PDMS를 치료.
   5. 필 마스터 금형에서 PDMS 스탬프 끕니다. 이어서, 별도의 마이크로 PDMS 스탬프로 자른다. 마지막으로, 입구 (들)와 출구 (들)에 구멍을 드릴 절단 코어를 사용합니다.
6. 유리에 PDMS의 본딩
   1. 30 초 동안 산소 플라즈마에 커버 슬립과 PDMS 스탬프를 노출. 커버 슬립에 본드 PDMS 스탬프입니다.
   2. PDMS 스탬프 및 커버 슬립 사이에 적당한 밀봉을 달성하기 위하여, 10 분 동안 70 ° C에서 오븐에 넣어 어닐링 장치.

2 세균성 문화

참고 : 적절한 바이오 안전성 프로토콜 단계 2-4에 따라야합니다. 자세한 내용은 제도적 안전 요원에게 문의하십시오.

1. LB 한천 플레이트를 준비
   1. 1 L 플라스크에 20g 루리아 - 베르 타니 (LB) 한천 (밀러) 분말 및 초순수의 500 ML을 추가합니다. 분말을 용해 약동하십시오.
   2. 15 PSI, 15 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균에 의해 소독.
   3. 플라스크 벤치에 또는 바이오 안전성 후드에서 물을 욕조에 50 ~ 55 ° C까지 냉각 할 수 있습니다.
   4. 50 μg / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 항생제 테트라 사이클린을 추가한다. 잘 저어 섞는다.
   5. 접시에 혼합물을 부어. 전체 2/3 - 2까지 각 판을 채 웁니다.
   6. 불꽃 공기가 형성하는 경우를 나타 짧게 거품. 응고 된 기포 위에 박테리아 배양을 전파하기 어렵다.
   7. 판 하룻밤 실온에서 냉각시킵니다.
   8. 그들은 멋진 때,자신의 소매로 다시 접시를 넣어 4 ℃에서 가방, 라벨 (항생제와 날짜) 및 저장을 봉인.
      참고 : 빛이 많은 항생제를 비활성화로, 주석 호일 접시의 주식을 커버.
2. LB 국물 준비
   1. 20g 루리아 - 베르 타니 (LB) 배지 (밀러) 분말 및 플라스크에 초순수의 1 L를 추가합니다. 분말을 용해 약동하십시오.
   2. 15 PSI, 15 분 동안 121 ° C에서 고압 증기 멸균에 의해 소독.
   3. 플라스크 벤치에 또는 바이오 안전성 후드에서 물을 욕조에 50 ~ 55 ° C까지 냉각 할 수 있습니다.
   4. 50 μg / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 항생제 테트라 사이클린 (tetracycline)을 추가한다. 잘 저어 섞는다.
   5. 때 멋진, 4 ° C에서 레이블 병을 배치합니다.
      참고 : 빛이 많은 항생제를 비활성화로, 주석 호일로 병을 커버.
3. LB 한천 접시에 문화 박테리아 (이 프로토콜을 사용하는 슈도모나스 fluorescens)
   1. (냉장고에서 -80 °를 박테리아의 주식을 가지고; C)과 얼음에 놓습니다.
   2. -80 ° C 세균 주식 및 바이오 안전성 후드 내부 LB 한천 플레이트를 놓습니다.
   3. 킬 지그재그 패턴 LB 한천 플레이트 상에 균주. 한천 플레이트를 덮고 하룻밤 30 ºC 그것을 품어. 마지막으로, 4 ° C에서 냉장고에 접시를 저장합니다.
4. 박테리아 용액을 제조 (S1)
   1. 멸균 플라스크에 50 ㎖의 LB 국물 미디어를 붓고. 바이오 안전성 후드 내부에서이 작업을 수행합니다.
   2. 플라스크에 LB 아가 플레이트로부터 박테리아 단일 콜로니를 전송합니다. 이 조작은 생물 안전성 후드 안쪽 수행되어야한다.
   3. 30 ° C 및 충분한 시간 (4 시간) 150 rpm에서 진탕 배양기에서 플라스크를 넣습니다.
5. 희석 세균 솔루션 (S2)를 준비
   1. 멸균 플라스틱 튜브에 5 ㎖의 LB 국물 미디어를 붓고.
   2. LB 국물 매체와 혼합하여 S1을 희석. 그런 다음 솔루션을 소용돌이. 용액은 목적하는 광학 달성 희석알 밀도 (OD 600 nm의 0.1에서 측정).
      참고 : 바이오 필름 실험은 일반적으로이 부근에서 OD 값을 사용한다.

3 실험 설치 준비

1. 핀셋은 마이크로 칩의 입구 (들)와 출구 (들)에 유연한 플라스틱 튜브 (0.20 "ID)를 연결합니다. 입구와 출구가 이전에 마이크로 칩 (스텝 1.5.5)의 PDMS 부분에 드릴되었다.이 조사에서 마이크로 칩은 두 개의 입구와 하나의 출구로 구성되어 있습니다.
2. 박테리아 용액 (S2 용액) 주사기 (들)을 입력하고 주사기 (들)의 모든 거품을 제거합니다.
3. 입구 관 (들)에 주사기 팁 (들) (30 G 0.5 "무딘 바늘)을 연결합니다. 그런 다음 컨테이너를 낭비 출구 관 (들)을 연결합니다.

(4) 실험을 실행

1. 주사기 팁 (들) 주사기 (들)을 연결합니다.
2. 주사기 펌프 위에 장소 및 수정 주사기 (들). 그런 desir의 대물 렌즈와 광학 현미경 마이크로 칩을 배치에드 배율 (예를 들어, 40 배). 박테리아 증식 (P. 30 °의 C는 fluorescens) 동안 일정한 온도 환경을 유지하기 생균 챔버기구와 마이크로 칩을 포함한다.
3. 원하는 유량 레벨로 펌프 (예를 들어 10 μL / 시간)를 설정하고 유체 펌핑을 시작합니다.
4. 박테리아가 챔버 내로 도입되면, 바이오 필름 형성이 또한 개시된다. 바이오 필름 형성 및 성숙은 일반적으로 몇 시간 또는 며칠의 기간에 걸쳐 발생한다. 관찰하고 현미경을 통해 생물막 성장의 이미지를 가져 가라.

상술 한 미세 프로토콜을 이용하여 PDMS 기반의 미세 유체 소자를 제작 하였다. 1 주 사형 전자 현미경 (SEM) PDMS의 이미지를 보여준다 장치.도 1a는 상기 장치의 입구 부분을 나타낸다. 포크 모양의 입구는 장치에서 압력 헤드를 동일하게 만들어집니다. 또한 SEM 영상은 기둥 벽 (그림 1b) 거의 수직 것으로 나타났다. 배양 균액 (도 2)로 희석시키고, 그것의 광학 밀도가 0.1의 값으로 조정 하였다. 우리는 유입 흐름 속도의 함수로서 미세 유동 장치에 바이오 필름 형성을 조사 하였다. 때 P. fluorescens 0.8 μL / 시간, 세균성 부착 낮은 유량으로 장치에 주입하고, 바이오 필름 ​​형성 장치의 벽에서 발생. 심지어 장기간 (> 20 시간) 후, 표면 포옹 생물막 이외 다른 박테리아 구조 없음 우리다시 관찰했다. 다음으로, 동일한 실험 8 μL / hr의 유량으로 반복 하였다. 이 경우, 바이오 필름 형성이 다시 희석 세균 배양의 주입의 몇 분 후에 시작되었다. 다만, 몇 시간 후, 마이크로 기둥들 사이에서 연장 필라멘트 구조의 모양은 장치 (도 4)의 중앙부 부근에 관찰되었다. 이러한 필라멘트의 구조가 고정되어 박테리아의 존재를 통해 가시화 될 수있다. 이러한 구조는 깃발로 알려져 있으며, 그들은 단지 하나에 닿는 또는 둘 모두가 표면에 종료되는 사상 바이오 필름입니다. 구조의 나머지는 종종 (이 경우에서와 같이) 액체 매질에 현탁된다. 4 생물막 유영 구조의 시간의 진화를 보여주고있다. 테이프는 일반적으로 점탄성 생물막에 유체 전단의 효과로 인해 형성한다. 5 기둥 일련 과거 흐름 유선 및 속도 윤곽을 보여준다. 시뮬레이션은 그 깃발을 보여줍니다우리의 마이크로 유체 시스템의 형태는 본질적으로 유체 유동 유선을 따라 정렬된다. 흐름 구조와 생물막 깃발의 형성 사이의 상관 관계는 아직 잘 이해되지 않습니다. 그러나 다스와 쿠마 ^(16)는 최근이 깃발은 본질적으로 점탄성 바이오 필름의 점성이 높은 액체 상태로 형성하는 것을 제안했다. 그들은 생물막 유영 형성의 시간 규모는 일반적으로 지금까지 바이오 필름의 점탄성 휴식 시간 규모를 초과 관찰에 자신의 추측을 기반으로. 바이오 필름은 같은 점탄성 액체를 작동하는 것으로 알려져 따라서 점탄성 휴식 시간 규모보다 훨씬 큰 시간 규모에서, 그들은 본질적으로 같은 점성이 높은 액체 ^(17)를 동작합니다. 이 제제에 따르면, 테이프가. 높은 전단 응력의 ​​위치에서 발생하는 기대 (5)가 채널에서의 고속의 위치를 보여주고, 이러한 위치는 높은 전단 응력의 ​​위치와 일치 할 수있다. 초기의 쟁반에서 성장 그 자체는, 깃발 이러한 위치 (그림 4) 근처에 생성 된 것으로 관찰된다.

미세 유체 채널 (상위 - 뷰)도 1의 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지. ) 입구 부, 마이크로 기둥을 포함 b)는 지역. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

박테리아 문화에 관련된 2 연속 단계를 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

깃발의 진화의 그림 4 시간 경과 공 촛점 이미징은. 이미지 평면 = Z로 장치의 25 μm의, 즉 중간에 해당한다. 점선 타원 생물막 깃발을 보여줍니다. 를 클릭하십시오여기이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 마이크로 기둥 과거 흐름의 합리화와 속도 윤곽을 보여주는 5 전산 유체 기계 시뮬레이션. 유체 흐름이 바닥과 속도 규모 위로부터입니다 것은 m / 초이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 복잡한 서식지에서 바이오 필름 개발 연구를위한 다공성 미디어를 모방하는 간단한 미세 유체 장치를 보여 주었다. 실험의 결과를 지시 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 그들은 장치의 형상을 포함한다. 포스트 형상은 다를 수 있지만, 깃발은 형성하기위한 적절한 기공 공간이 필요합니다. 더욱이 Valiei 외. ¹ 트리머 형성 할수 특정 유량 범위에서 발생 것을 증명했다. 임계 값보다 낮은 유속에서, 깃발에 바이오 필름의 변형이 관찰되지 않을 수 있습니다. 그러나 어떤 다른 임계 유량 값 이상, 생물막 골절 지배하고 깃발의 형성을 허용 할 수 없습니다. 이 실험을 괴롭히는 또 다른 문제는 마이크로 기둥 배열에 갇혀 될 수 있습니다 기포이다. 보통 이러한 기포가 원하는 값으로 점차적으로 감소하는 후 초기 유속의 증가에 의해 제거 할 수있다.

미세 유체 플랫폼등 이러한 여러 가지 장점과 몇 가지 제한을 제공합니다. 이 플랫폼은 작은 문화 볼륨에서 작동하도록 우리를 가능하게하고, 사용자 정의 기능을 통합의 유연성을 가지고있다. 예를 들어, 다른 다공성 구조는 상기 마이크로 필러 배열의 기하학적 파라미터를 변화시킴으로써 시뮬레이트 될 수있다. 실제 다공질 매체의 임의의 구조를 모방하는 구조에서도 미세 유체 플랫폼 ⁽¹⁸⁾ 상에 제조 될 수있다. 또한, 몇몇 이러한 채널은 정확한 통계적 분석을 위해 상당한 관련 데이터의 수집을 가능하게 하나의 디바이스 상에 구현 될 수있다. 그러나, 미세 유체 시스템은 일반적으로 다공성 지지체의 2 차원 구조를 모방. 다공질의 3 차원 성질을 모방 할 수있는 장치는 일반적으로 제조하는 것이 매우 도전적이다.

깃발의 형성과 진화는 아직 잘 이해되지 않고, 추가 연구가이 방향으로 필요합니다. 깃발이 형성 형식으로 이어질 방법의 이해성숙한 생물막 구조의 이온은 심장 스텐트, 토양에서 생물막 및 여과 시스템과 같은 생의학 장치의 막힘을 포함한 다양한 시나리오와 관련된다. 우리의 마이크로 유체 플랫폼은 그 방향에서의 공정이다.

The authors have nothing to disclose.

The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.