Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Varias especies bacterianas poseen la capacidad de adherirse a las superficies y colonizar ellos en la forma de películas delgadas llamadas biopelículas. Las biopelículas que crecen en medios porosos son relevantes para varios procesos industriales y ambientales, tales como el tratamiento de aguas residuales y secuestro de CO _2. Utilizamos Pseudomonas fluorescens, una bacteria aerobia gram-negativos, para investigar la formación de biopelículas en un dispositivo de microfluidos que imita medios porosos. El dispositivo microfluídico consiste de una matriz de micro-mensajes, que fueron fabricados utilizando litografía suave. Posteriormente, la formación de biopelículas en estos dispositivos con flujo fue investigado y se demuestra la formación de biofilms filamentosos conocidos como serpentinas en nuestro dispositivo. Los protocolos detallados para la fabricación y montaje de dispositivo de microfluidos se proporcionan aquí junto con los protocolos de cultivo bacteriano. Los procedimientos detallados para la experimentación con el dispositivo de microfluidos también se presentan junto con el representanteresultados.

Recientemente, hemos demostrado la dinámica de la formación de biopelículas bacterianas en un dispositivo de microfluidos que imita medios porosos ^1. Los biofilms bacterianos son esencialmente colonias de bacterias de la superficie agregada que están cubiertos de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) ^2-4. Estas películas delgadas de bacterias pueden formar en casi todos los nichos concebible que van desde superficies lisas para el hábitat mucho más complejo de los medios porosos. Valiei et al. ¹ utiliza un dispositivo de microfluidos con una matriz de micro-pilares para simular una estructura de medios porosos y estudió la formación de biopelículas en este dispositivo como una función de la tasa de flujo de fluido. Encontraron que en un régimen de flujo determinado, biofilms filamentosos conocidos como serpentinas comenzaron a surgir entre los diferentes pilares. Serpentinas pueden ser atados en uno o ambos extremos para superficies sólidas, pero el resto de la estructura se suspende en un líquido. Formación Streamer comienza típicamente después de una capa inicial de la biopelícula se ha formado y su formatoion puede dictar la evolución a largo plazo de la biopelícula en tales hábitats complejos. Recientemente, varios investigadores han estudiado la dinámica de formación de serpentina. Yazdi et al. ⁵ mostró que las serpentinas pueden formar en los flujos de torbellino se originan en una burbuja oscilante. En otro experimento, Rusconi et al. ⁶ investigó el efecto de la curvatura del canal y la geometría del canal en la formación de serpentinas. Ellos encontraron que las serpentinas se pueden formar en secciones curvas de microcanales, y la morfología streamer está relacionada con la motilidad. La investigación reciente ha demostrado que las cuerdas pueden tener una amplia repercusión en diversos escenarios naturales y artificiales, ya que pueden actuar como precursores para la formación de estructuras porosas maduros en las interfaces, conducir a la proliferación de biopelículas rápido y catastrófico en unos sistemas biomédicos, y también puede causar Flow sustancial interacciones estructura, etc ^1,7-9.

Serpentinas Biofilm menudo forman in hábitats complejos como medios porosos. El crecimiento de biopelículas Entendimiento en el entorno de medios porosos es relevante para varios procesos industriales y medioambientales como el tratamiento biológico de aguas residuales ^10, manteniendo así la integridad de ánima en situaciones como la captura de _CO2 ¹¹ y el taponamiento de los poros en el suelo ^12. Observar la formación de biopelículas en tales hábitats complejos, con frecuencia puede ser un reto debido a la opacidad de medios porosos. En tales situaciones, las plataformas de medios porosos microfluidos basada pueden resultar muy ventajosa, ya que permiten en tiempo real y el seguimiento in situ. Otra ventaja de la microfluídica es la capacidad de construir múltiples biorreactores en una sola plataforma de microfluidos bio-y simultáneamente permitir la supervisión y / o incorporación de sensores en línea. La flexibilidad para implementar múltiples experimentos de laboratorio en un solo dispositivo y la capacidad de recopilar datos pertinentes importantes para el análisis estadístico exacto es un adv importanteantage de los sistemas de microfluidos ^13,14.

En el contexto de la discusión anterior, la comprensión de la dinámica de formación de serpentina en un entorno de medios porosos sería beneficioso para varias aplicaciones. En este estudio, desarrollamos el protocolo para la investigación de la formación de serpentina en un dispositivo que imita los medios porosos. La fabricación de la plataforma de microfluidos, se describen los pasos necesarios para el cultivo celular y la experimentación. En nuestros experimentos, se empleó la cepa bacteriana de tipo salvaje de Pseudomonas fluorescens. P. fluorescens, que se encuentra naturalmente en el suelo, juega un papel clave en el mantenimiento de la ecología del suelo ^15. La cepa bacteriana empleada había sido manipulada genéticamente para expresar la proteína fluorescente verde (GFP) constitutivamente.

Realice los protocolos experimentales aquí en el orden descrito a continuación. Protocolos de microfabricación para la creación de la plataforma de microfluidos se discuten en el Paso 1 Paso 2 describe el protocolo de cultivo bacteriano (Figura 2), y el Paso 3 se refiere al montaje de la configuración experimental (Figura 3). Finalmente, la etapa experimental real se describe en el paso 4.

1. viruta Procedimiento Fabrication

NOTA: los procedimientos de seguridad deben ser seguidas por los procedimientos descritos a continuación. Consulte al encargado de seguridad institucional para más detalles.

1. Diseñar la máscara con un software apropiado (por ejemplo, L-Edit). El diseño del canal consiste en un principal micro-canal de ancho de 625 m. La región central del canal contiene una matriz de micro-mensajes 50 m de diámetro, espaciados 25 m aparte (Ver Archivos Suplementarios).
2. Imprimir este diseño en vidrio (5 "x 5" vidrio sódico-cálcico), Que tiene un espesor de 0,09 "y está recubierto en aproximadamente 70 nm de espesor de capa de cromo (Cr), el uso de enmascaramiento con el fin de preparar una máscara foto. Desarrollador Uso AZ400K durante 1 min. Entonces, grabar la capa de Cr Cr utilizando reactivo de ataque durante 1 min con acetona para quitar la capa protectora y limpiarlo con una solución de pirañas frío. (H ₂ SO ₄ y H ₂ O ₂ en una proporción de 3: 1).
3. Fotolitografia
   1. Limpie una oblea de 4 "de silicio estándar químicamente con una solución de pirañas durante 20 min.
   2. Enjuague la oblea con agua desionizada y séquelo.
   3. Calentar la oblea en una placa caliente (200 ° C durante 15 min).
   4. Escudo de la oblea de silicio con fotoprotector. Aquí, el AZ4620 fotoprotector positivo se revistió spin-sobre una oblea de silicio a 2000 rpm durante 25 s para obtener una capa de espesor 12,5 micras.
   5. Eliminar todo el disolvente por hornear suave de la oblea en una placa caliente por la flotación de la oblea durante 90 segundos en el flujo de nitrógeno a 100 ° C. A continuación, guárdelo en vacío a tél misma temperatura durante 60 seg.
   6. Coloque las tabletas en una caja oscura durante 24 horas por deshidratación.
   7. Exponer la oblea a la luz UV con el fin de transferir el patrón diseñado para la fotoprotección.
   8. Sumergir la oblea en solución de revelador fotorresistente (AZ400K) para 240 seg. Luego, enjuague la oblea con alcohol isopropílico y séquelo colocando en una corriente de gas nitrógeno.
4. ICP-DRIE (plasma acoplado inductivamente - Deep Reactive Ion Aguafuerte) Proceso
   1. Aplicar DRIE grabado. Seleccione la profundidad de ataque apropiado de acuerdo a la profundidad final requerido para el dispositivo (50 micras en esta investigación). Fotoprotector actúa como una capa de enmascaramiento durante este proceso.
   2. Retire el fotoprotector restante con acetona y limpiar la oblea.
5. PDMS (polidimetilsiloxano) Casting
   1. Utilice triclorometilsilano (TCMS) para silanizar el molde maestro de silicio. Vierta 2 o 3 gotas de triclorometilsilano en un vial y colocarlo en un secador al lado delmolde maestro de silicio. Permita 2-3 horas para el proceso de silanización para completar.
   2. En un recipiente separado, mezclar la base de silicona Sylgard 184 con agente de curado en relación en peso de 10: 1 para preparar PDMS. Desgasificar la PDMS sometiéndolo a condiciones de vacío (alrededor de 2 h).
   3. Ponga el molde maestro de silicio en un soporte. Luego, vierta el PDMS en el molde maestro de silicio para formar el sello PDMS. Asegúrese de que las burbujas no se forman en los PDMS durante este proceso.
   4. Curar el PDMS durante 2 horas a 80 ° C.
   5. Despegue el sello PDMS del molde maestro. A continuación, cortar el PDMS sello en microchips separados. Por último, utilizar un núcleo de corte para perforar agujeros para la entrada (s) y salida (s).
6. La unión de PDMS a Glass
   1. Exponer la hoja de la cubierta y el sello PDMS de plasma de oxígeno durante 30 segundos. Sello Bond PDMS a la hoja de la cubierta.
   2. Para lograr un sellado adecuado entre el sello de PDMS y la hoja de la cubierta, recocer el dispositivo al ponerlo en el horno a 70 ° C durante 10 min.

2. bacteriana Cultura

NOTA: los protocolos adecuados de bioseguridad debe ser seguido por los pasos 2-4. Consulte al encargado de seguridad institucional para más detalles.

1. Preparar placas de agar LB
   1. Añadir 20 g de Luria-Bertani (LB) agar (Miller) polvos y 500 ml de agua ultrapura a un matraz de 1 L. Revuelva para disolver el polvo.
   2. Esterilizar en autoclave a 15 psi, 121 ° C durante 15 min.
   3. Dejar el frasco enfriar a 50-55 ° C en un banco o en un baño de agua en la campana de seguridad biológica.
   4. Añadir el antibiótico tetraciclina para lograr una concentración final de 50 mg / ml. Mezclar bien por agitación.
   5. Vierta la mezcla en placas. Llene cada plato hasta 1.2 a 2.3 completa.
   6. Llama burbujas de aire brevemente para hacerlas explotar si forman. Burbujas de aire solidificadas son difíciles de difundir la cultura bacteriana más.
   7. Deje que los platos se enfríen a temperatura ambiente durante la noche.
   8. Cuando estén fríos,poner placas de nuevo en su manga, selle la bolsa, la etiqueta (antibiótico y fecha), y se almacenan a 4 ° C.
      NOTA: Cubra el balance de las placas con papel de aluminio, como la luz se desactiva muchos antibióticos.
2. LB Preparación Caldo
   1. Añadir 20 g de Luria-Bertani (LB) caldo (Miller) polvos y 1 L de agua ultrapura a un matraz. Revuelva para disolver el polvo.
   2. Esterilizar en autoclave a 15 psi, 121 ° C durante 15 min.
   3. Permita matraz se enfríe a 50-55 ° C en un banco o en un baño de agua en la campana de seguridad biológica.
   4. Añadir el antibiótico tetraciclina para lograr una concentración final de 50 mg / ml. Mezclar bien por agitación.
   5. Cuando esté frío, coloque la botella etiquetada a 4 ° C.
      NOTA: Cubra la botella con papel de aluminio, como la luz se desactiva muchos antibióticos.
3. Cultura de las bacterias en una placa de LB Agar (utiliza este protocolo Pseudomonas fluorescens)
   1. Tomar la acción bacteriana del congelador (-80 °; C) y colocarlo en hielo.
   2. Coloque el ° C de stock bacteriana -80 y una placa de agar LB dentro de una campana de bioseguridad.
   3. Racha de la cepa bacteriana sobre una placa de agar LB en un patrón de zigzag. Cubrir la placa de agar y se incuba a 30 º C durante la noche. Por último, guarde la plancha en el refrigerador a 4 ° C.
4. Preparar la solución bacteriana (S1)
   1. Verter 50 ml de medio de caldo LB a un matraz autoclave. Realice esta operación dentro de una campana de bioseguridad.
   2. Transferir una sola colonia bacteriana de la placa de agar LB al matraz. Esta operación también se debe realizar dentro de una campana de bioseguridad.
   3. Ponga el frasco en un incubador con agitación a 30 ° C y 150 rpm durante el tiempo necesario (4 horas).
5. Preparar la bacteriana solución diluida (S2)
   1. Vierta 5 ml de medio LB caldo en un tubo de plástico esterilizado.
   2. Diluir S1 mezclando con los medios de caldo LB. Entonces, agite la solución. Diluir la solución alcanzar la óptica deseadaal densidad (OD medida a 600 nm = 0,1).
      NOTA: los experimentos Biofilm suelen emplear valores de DO en esta vecindad.

3. Preparar el montaje experimental

1. Con ayuda de pinzas se conectan tubos de plástico flexibles (0.20 "ID) en la entrada (s) y salida (s) del microchip. Las entradas y salidas se perforaron previamente en la porción de PDMS del microchip (etapa 1.5.5). En esta investigación , el microchip consta de dos entradas y una salida.
2. Llene la jeringa (s) con la solución bacteriana (solución S2) y eliminar todas las burbujas en la jeringa (s).
3. Conecte la punta de la jeringa (s) (30 G 0.5 "aguja roma) en el tubo (s) de entrada. Luego, conecte el tubo (s) de salida al contenedor de residuos.

4. Ejecute el Experimento

1. Conectar la jeringa (s) a la punta (s) jeringa.
2. Lugar y jeringa (s) revisión en la bomba de jeringa. A continuación, coloque el microchip bajo un microscopio óptico con lentes objetivas de desirmagnificación ed (por ejemplo, 40X). Cubrir el microchip con un dispositivo de cámara de la celda en vivo para mantener un ambiente de temperatura constante para el crecimiento bacteriano (30 ° C para P. fluorescens).
3. Ajuste la bomba al nivel del caudal deseado (por ejemplo, 10 l / h) e iniciar el bombeo de líquidos.
4. Una vez que las bacterias se introducen en la cámara, también se inicia la formación de biopelículas. La formación de biopelículas y la maduración ocurren típicamente durante un período de varias horas o incluso días. Observar y tomar imágenes de la formación de biopelículas a través del microscopio.

Utilizando el protocolo de microfabricación mencionados arriba, se construyó un dispositivo de microfluidos basada PDMS. Figura 1 muestra el microscopio electrónico de barrido (SEM) imágenes de la PDMS dispositivo. Figura 1a muestra la sección de entrada del dispositivo. Se crea una entrada de tenedor para igualar la carga de presión a través del dispositivo. Además de imágenes SEM mostró también que las paredes pilar son casi vertical (Figura 1b). La solución bacterianas cultivadas (Figura 2) se diluyó y su densidad óptica se ajustó a un valor de 0,1. Se examinó la formación de biopelículas en el dispositivo de microfluidos como una función de la tasa de flujo de entrada. Cuando P. fluorescens se inyectó en el dispositivo a un bajo caudal de 0,8 l / h, la adhesión bacteriana y la formación de biopelículas se produjo a las paredes del dispositivo. Incluso después de un período de tiempo prolongado (> 20 horas), no hay otras estructuras bacterianas distintas de las biopelículas que abraza la superficie quere observado. A continuación, el mismo experimento se repitió con un caudal de 8 l / hr. En este caso, la formación de biopelículas de nuevo comenzó después de unos pocos minutos de la infusión del cultivo bacteriano diluido. Sin embargo, después de unas pocas horas, se observó aparición de estructuras filamentosas que se extienden entre micro-pilares cerca de la sección media del dispositivo (Figura 4). Estas estructuras filamentosas pueden ser visualizadas a través de la presencia de bacterias inmóviles. Estas estructuras son conocidas como serpentinas y son biofilms filamentosos que sólo están atados a uno o ambos extremos de las superficies. El resto de la estructura es a menudo suspendido en el medio líquido (como en este caso). Figura 4 muestra la evolución temporal de la estructura de serpentina de biofilm. Serpentinas generalmente se forman debido al efecto de la cizalladura del fluido sobre la biopelícula visco-elástica. Figura 5 muestra las líneas de corriente y contornos de velocidad para el flujo más allá de una serie de pilares. La simulación muestra que las serpentinas queforma en nuestro sistema de microfluidos son esencialmente alineado a lo largo de las líneas de corriente del flujo de fluido. La correlación entre las estructuras de flujo y formación de biofilm serpentinas aún no está bien entendido. Sin embargo, Das y Kumar ¹⁶ han propuesto recientemente que estos streamers forman como estado líquido muy viscoso de los biofilms intrínsecamente viscoelásticas. Basaron su conjetura en la observación de que la escala de tiempo de la formación de biofilm streamer normalmente supera con creces las escalas viscoelásticas tiempo de relajación de biofilms. Las biopelículas son conocidos a comportarse como líquidos viscoelásticos y por lo tanto a escalas de tiempo mucho mayor que la escala de tiempo de relajación viscoelástico, que esencialmente se comportan como líquidos de alta viscosidad ^17. De acuerdo con esta formulación, serpentinas se puede esperar que se originan en lugares de tensiones de cizallamiento altas. Figura 5 muestra las ubicaciones de alta velocidad en el canal, y estos lugares coinciden con las ubicaciones de altas tensiones de cizallamiento. En el pha inicial se de crecimiento, se observó serpentinas originarse cerca de estos lugares (Figura 4).

Imágenes del canal de microfluidos (vista superior) Figura 1. microscopio electrónico de barrido (SEM). a) Sección de entrada, b) Región que contiene micro-pilares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. pasos secuenciales que intervienen en el cultivo bacteriano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Time-lapse de imagen confocal de la evolución de serpentinas. Plano de la imagen se corresponde con z = 25 micras es decir medio del dispositivo. Elipses punteadas demuestran serpentinas biofilm. Haga clicaquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. simulaciones de mecánica de fluidos computacional que muestran líneas de corriente y contornos de velocidad de flujo que pasa por micro-pilares. El flujo de fluido es de arriba a abajo la escala y la velocidad es en m / seg. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Hemos demostrado un dispositivo de microfluidos sencillo que imita medios porosos para estudiar el desarrollo del biofilm en hábitats complejos. Hay varios pasos críticos que determinan el resultado de los experimentos. Ellos incluyen geometría del dispositivo. Mientras que la geometría mensaje puede variar, adecuada poro-espacio para serpentinas para formar es necesario. Además, Valiei et al. ¹ han demostrado que la formación de streamer se produce sólo en un cierto rango de caudal. A caudales inferiores a un valor umbral, no se puede observar la deformación de biofilms en serpentinas. Sin embargo, por encima de un determinado valor de caudal otro umbral, fractura biofilm puede dominar y no permitir la formación de serpentinas. Otra de las cuestiones que pueden plagar estos experimentos es burbujas de gas que pueden quedar atrapados en la matriz de micro-pilar. Por lo general, estas burbujas tienen que ser removidos mediante el aumento de la velocidad de flujo inicialmente y luego, gradualmente, disminuyendo al valor deseado.

Plataformas de microfluidoscomo estos ofrecen varias ventajas y algunas limitaciones. La plataforma nos permite trabajar con pequeños volúmenes de cultivo, y tiene la flexibilidad de incorporar características definidas por el usuario. Por ejemplo, diferentes estructuras porosas se pueden simular mediante la alteración de los parámetros geométricos de la matriz de micro-pilar. Incluso estructuras que imitan la estructura aleatoria de medios porosos real pueden ser fabricados en plataformas de microfluidos ^18. Por otra parte, varios de esos canales se pueden implementar en un solo dispositivo que permite la recolección de los datos pertinentes importantes para el análisis estadístico preciso. Sin embargo, los sistemas de microfluidos típicamente imitan la estructura bidimensional de medios porosos. Los dispositivos que pueden imitar la naturaleza tridimensional de medios porosos son por lo general bastante difícil de fabricar.

Formación y evolución de serpentinas no son bien entendidas aún, y se requiere más investigación en esta dirección. La comprensión de cómo se forman las serpentinas y conducen al formatoion de las estructuras de biopelícula madura será relevante para una amplia variedad de escenarios, incluyendo la obstrucción de los dispositivos biomédicos tales como stents corazón, biofilms en el suelo, y sistemas de filtración. Nuestra plataforma de microfluidos es un paso en esa dirección.

The authors have nothing to disclose.

The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.