Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

Várias espécies bacterianas possuem a capacidade para ligar a superfícies e colonizar-los sob a forma de películas finas chamadas biofilmes. Os biofilmes que crescem em meios porosos são relevantes para vários processos industriais e ambientais, como o tratamento de águas residuais e sequestro de CO _2. Usamos Pseudomonas fluorescens, uma bactéria Gram-negativa aeróbica, para investigar a formação de biofilmes em um dispositivo de microfluidos, que imita meios porosos. O dispositivo de microfluidos consiste de uma matriz de micro-mensagens, que foram fabricados utilizando-litografia macia. Subsequentemente, a formação de biofilmes em estes dispositivos com o fluxo foi investigado e que demonstram a formação de biofilmes filamentosos conhecidos como serpentinas em nosso dispositivo. Os protocolos detalhados para fabricação e montagem de dispositivos microfluídicos são fornecidos aqui, juntamente com os protocolos de cultura de bactérias. Os procedimentos detalhados para a experimentação com o dispositivo micro também são apresentados juntamente com o representanteresultados.

Recentemente, demonstramos dinâmica de formação do biofilme bacteriano em um dispositivo micro que imita meios porosos ^1. Biofilme bacteriano são essencialmente colônias de bactérias da superfície agregados que são revestidas por substâncias poliméricas extracelulares (EPS) ^2-4. Estas películas finas de bactérias podem formar em quase todos os nichos concebível que varia de superfícies lisas ao habitat muito mais complexa de meios porosos. Valiei et al. ^Uma usado um dispositivo de microfluidos com uma matriz de micro-pilares para simular uma estrutura de meio poroso estudado a formação de biofilme e neste dispositivo, em função da taxa de fluxo do fluido. Eles descobriram que em um determinado regime de fluxo, os biofilmes filamentosos, conhecidos como flâmulas começaram a surgir entre os diferentes pilares. Flâmulas pode ser amarrado a uma ou ambas as extremidades a superfícies sólidas, mas o resto da estrutura é suspenso num líquido. Formação Streamer normalmente começa depois de uma primeira camada de biofilme foi formado e seu formatoion pode ditar a evolução a longo prazo de biofilme em tais habitats complexos. Recentemente, vários pesquisadores têm investigado a dinâmica de formação de serpentina. Yazdi et al. ⁵ mostrou que as serpentinas podem formar-se os fluxos de turbilhão originários a partir de uma bolha de oscilação. Numa outra experiência, Rusconi et al. ⁶ investigaram o efeito de curvatura do canal e da geometria do canal sobre a formação de fitas. Eles descobriram que as fitas podem se formar em trechos curvos de microcanais e morfologia de galhardetes está relacionada à mobilidade. Pesquisas recentes têm demonstrado que os galhardetes pode ter amplas repercussões em vários cenários naturais e artificiais como eles podem atuar como precursores da formação de estruturas maduras nas interfaces porosas, levar à proliferação de biofilme rápida e catastrófica em um sistemas biomédicos, e também causar fluxo-substancial interações estrutura, etc ^1,7-9.

Flâmulas biofilme muitas vezes formam ihabitats n complexos, tais como meios porosos. Crescimento do biofilme Entendimento em ambiente de meios porosos é relevante a vários processos ambientais e industriais, tais como o tratamento biológico de águas residuais ^10, mantendo a integridade de poços em situações como a captura de CO ₂ ¹¹ e entupimento dos poros no solo ^12. Observando a formação de biofilme em tais habitats complexos, muitas vezes pode ser um desafio, devido à opacidade de meios porosos. Em tais situações, as plataformas de mídia porosos microfluídicos com base pode ser extremamente vantajoso, pois permitem em tempo real e monitoramento in situ. Outra vantagem da microfluídica é a capacidade de construir vários reatores em uma única plataforma bio-microfluídicos e, simultaneamente, permitir o monitoramento e / ou incorporação de sensores online. A flexibilidade para implementar várias experiências de laboratório em um dispositivo e a capacidade de recolher dados pertinentes significativas para a análise estatística rigorosa é um adv importanteantage de sistemas microfluídicos ^13,14.

No contexto da discussão acima, dinâmica de formação flâmula compreensão em um ambiente de meio poroso seria benéfico para várias aplicações. No presente estudo, nós desenvolvemos o protocolo para investigar a formação de um dispositivo de serpentina de em que mimetiza meios porosos. Confecção da plataforma microfluídica, são descritos os passos necessários para a cultura de células e experimentação. Nas nossas experiências, a estirpe bacteriana tipo selvagem de Pseudomonas fluorescens foi empregue. P fluorescens, que se encontra naturalmente no solo, tem um papel fundamental na manutenção da ecologia do solo ^15. A estirpe bacteriana utilizada foi geneticamente manipulada para expressar a proteína fluorescente verde (GFP) constitutivamente.

Executar os protocolos experimentais aqui na ordem descrita abaixo. Protocolos de microfabricação para criar a plataforma de microfluidos são discutidos no Passo 1 Passo 2 descreve o protocolo de cultura de bactérias (Figura 2), e Passo 3 refere-se a montagem da instalação experimental (Figura 3). Finalmente, o passo real experimental é descrito no Passo 4.

1 Chip Fabricação Procedimento

NOTA: Proper procedimentos de segurança devem ser seguidas para os processos descritos abaixo. Consulte o oficial de segurança institucional para mais detalhes.

1. Projete a máscara com um software apropriado (por exemplo, L-Edit). O desenho é constituído por um canal principal micro-canal de largura de 625 m. A região central do canal contém uma matriz de micro-postos 50 um de diâmetro, espaçados de 25 um (ver a ficheiros suplementar).
2. Imprima este projeto em vidro (5 "x 5" vidro soda cal), Que tem uma espessura de 0,09 "e é revestido por cerca de 70 nm de espessura da camada de crómio (Cr), usando mascaramento de modo a preparar uma máscara de foto. Utilização AZ400K programador durante 1 min. Seguida, gravar a camada de Cr Cr usando cáustico durante cerca de 1 min a utilização de acetona para retirar a resistir e limpá-lo com uma solução fria de piranha. (H ₂ SO ₄ e H ₂ O ₂ em uma proporção de 3: 1).
3. Fotolitografia
   1. Limpe uma bolacha 4 "de silício padrão quimicamente com solução piranha para 20 min.
   2. Lavar o wafer com água DI e secá-la.
   3. Aquece-se a bolacha em uma placa quente (200 ° C durante 15 min).
   4. Cubra o wafer de silício com photoresist. Aqui, o revestimento fotoprotector positivo AZ4620 foi revestido por centrifugação sobre uma bolacha de silício, a 2000 rpm durante 25 segundos para se obter uma camada de espessura de 12,5 | iM.
   5. Remover todo o solvente por cozimento da bolacha mole em uma placa quente, flutuando a bolacha durante 90 segundos em fluxo de azoto a 100 ° C. Em seguida, mantê-lo no vácuo a tele mesma temperatura durante 60 seg.
   6. Coloque a bolacha em uma caixa escura por 24 horas para a desidratação.
   7. Expor a pastilha à luz ultravioleta, a fim de transferir o padrão concebido para o foto-resistente.
   8. Mergulha-se o wafer foto-resistente na solução de revelação (AZ400K) para 240 seg. Em seguida, lavar a bolacha com álcool isopropílico e secá-lo, colocando em uma corrente de azoto gasoso.
4. ICP-DRIE (plasma indutivamente acoplado - Deep Reactive Ion Etching) Processo
   1. Aplicar DRIE gravura. Escolha a profundidade etch adequado de acordo com a profundidade final necessária para o dispositivo (50 mm nesta investigação). Photoresist actua como uma camada de máscara, durante este processo.
   2. Remover o fotorresistente remanescente com acetona e limpar a bolacha.
5. PDMS (polidimetilsiloxano) Fundição
   1. Use triclorometilsilano (EMT) para silanização o molde mestre de silício. Despeje 2 ou 3 gotas de triclorometilsilano em um frasco e colocá-lo num exsicador junto aomolde mestre de silício. Permitir 2-3 horas para o processo de silanização para ser concluído.
   2. Num recipiente separado, misturar a base de silicone Sylgard 184 com o agente de cura pela relação de peso de 10: 1 para preparar PDMS. Desgasificar o PDMS, submetendo-o a condições de vácuo (cerca de 2 h).
   3. Coloque o molde mestre de silício em um suporte. Em seguida, despejar o PDMS sobre o molde mestre de silício para formar o selo de PDMS. Certifique-se de que não se formam bolhas de PDMS durante este processo.
   4. Curar o PDMS durante 2 horas a 80 ° C.
   5. Retire o selo PDMS do molde mestre. Em seguida, corte os PDMS carimbar em microchips separados. Finalmente, a utilização de um núcleo de corte de furos para a entrada (s) e saída (s).
6. Colagem de PDMS para Vidro
   1. Expor a lamínula e PDMS selo de plasma de oxigênio por 30 seg. Vínculo PDMS selo à lamela.
   2. Para obter uma vedação adequada entre o carimbo de PDMS e o deslizamento da tampa, o dispositivo de recozimento, colocando-o num forno a 70 ° C durante 10 min.

2 Cultura bacteriana

NOTA: protocolos adequados de biossegurança devem ser seguidas para os passos 2-4. Consulte o oficial de segurança institucional para mais detalhes.

1. Prepare placas LB Agar
   1. Adicionar 20 g de meio de Luria-Bertani (LB) agar (Miller) pós e 500 ml de água ultra-pura a um balão de 1 L. Agita-se a dissolver o pó.
   2. Esterilizar por autoclave a 15 psi, a 121 ° C durante 15 min.
   3. Permitir que o balão arrefeça a 50-55 ° C num banco ou num banho de água na capa de biossegurança.
   4. Adicionar o antibiótico tetraciclina para se conseguir uma concentração final de 50 ug / ml. Misture bem por agitação.
   5. Despeje a mistura em placas. Encha cada prato até meia - 2/3 cheio.
   6. Chama bolhas de ar brevemente para estourá-los se formar. Bolhas de ar solidificados são difíceis de espalhar a cultura bacteriana over.
   7. Permitir que as placas de arrefecer à temperatura ambiente durante a noite.
   8. Quando eles são legais,colocar placas de volta para a sua manga, selar o saco, etiqueta (antibiótico e data), e armazenar a 4 ° C.
      NOTA: Cubra o estoque de placas com papel de alumínio, como a luz desativa muitos antibióticos.
2. Caldo LB Preparação
   1. Adicionar 20 g de meio de Luria-Bertani (LB) broth (Miller) pós e 1 L de água ultrapura com um balão. Agita-se a dissolver o pó.
   2. Esterilizar por autoclave a 15 psi, a 121 ° C durante 15 min.
   3. Permitir balão arrefecer até 50-55 ° C num banco ou num banho de água na capa de biossegurança.
   4. Adicionar o antibiótico tetraciclina para se conseguir uma concentração final de 50 ug / ml. Misture bem por agitação.
   5. Quando estiver frio, coloque a garrafa rotulada a 4 ° C.
      NOTA: Cubra a garrafa com papel de alumínio, como a luz desativa muitos antibióticos.
3. Cultura das bactérias em uma placa de LB Agar (Este protocolo utiliza Pseudomonas fluorescens)
   1. Pegue o estoque de bactérias do freezer (-80 °; C) e coloque-o no gelo.
   2. Coloque o ° C -80 estoque bacteriana e uma placa de ágar LB dentro de uma capa de biossegurança.
   3. Streak a estirpe bacteriana em uma placa de ágar LB em ziguezague. Cubra a placa de ágar e incubar-lo a 30 ° C durante a noite. Finalmente, a placa de armazenar no frigorífico a 4 ° C.
4. Preparar a solução bacteriana (S1)
   1. Despeje 50 ml de caldo LB mídia para um frasco autoclavado. Realize esta operação dentro de uma capa de biossegurança.
   2. Transferir uma única colónia bacteriana da placa de agar LB para o balão. Esta operação deverá ser realizada dentro de um capuz de biossegurança.
   3. Colocar o balão numa incubadora com agitação a 30 ° C e 150 rpm durante um tempo suficiente (4 h).
5. Preparar a solução bacteriana diluída (S2)
   1. Despeje 5 ml de caldo de meio LB num tubo de plástico esterilizado.
   2. Diluir S1 por mistura com meio LB. Então, Vórtice a solução. Dilui-se a solução atingir a desejada ópticaai densidade (OD medido a 600 nm = 0,1).
      NOTA: experimentos biofilme normalmente empregam valores de DO nesta vizinhança.

3 Prepare o Setup Experimental

1. Usando pinças ligar tubos de plástico flexíveis (0.20 "ID) na entrada (s) e saída (s) de que o microchip. As entradas e saídas foram previamente perfurados na porção de PDMS do microchip (passo 1.5.5). Nesta investigação , o circuito integrado é composto de duas entradas e uma saída.
2. Encher a seringa (s) com a solução bacteriana (solução S2) e remover todas as bolhas na seringa (s).
3. Conecte a ponta da seringa (s) (30 G 0.5 "agulha romba) no tubo (s) de entrada. Então, conecte tubo de saída (s) para contentor de resíduos.

4 Execute o Experimento

1. Ligar a seringa (s) para a ponta (s) seringa.
2. Local e correção seringa (s) para a bomba de seringa. Em seguida, coloque o microchip sob um microscópio óptico com lentes objetivas de desired ampliação (por exemplo, 40X). Cobrir o microchip com um aparelho de câmara de células vivas para manter um ambiente de temperatura constante para o crescimento bacteriano (30 ° C por P. fluorescens).
3. A bomba para o nível de fluxo desejado (por exemplo 10 l / h) e iniciar o bombeamento de fluidos.
4. Uma vez que as bactérias são introduzidas na câmara, a formação de biofilme é também iniciada. A formação de biofilme e de maturação tipicamente ocorrem ao longo de um período de várias horas ou mesmo dias. Observar e tirar fotos de crescimento do biofilme através do microscópio.

Usando o protocolo de microfabricação acima mencionado, um dispositivo de microfluidos com base de PDMS foi construído. Figura 1 mostra o microscópio electrónico de varrimento (SEM) de imagens do dispositivo de PDMS. Figura 1a mostra a secção de entrada do dispositivo. Uma entrada de tipo forquilha é criado para equalizar a pressão do outro lado da cabeça do dispositivo. Outras imagens de SEM mostraram igualmente que as paredes da coluna são quase verticais (Figura 1b). A solução bacteriana em cultura (Figura 2) e diluiu-se a sua densidade óptica foi ajustado para um valor de 0,1. Examinámos a formação de biofilme no dispositivo microfluidico, em função da taxa de fluxo de entrada. Quando P. fluorescens foi injectado no dispositivo a uma baixa taxa de fluxo de 0,8 mL / hora, a ligação e a formação de biofilme bacteriano ocorreu nas paredes do aparelho. Mesmo após um período prolongado de tempo (> 20 h), não há outras que não sejam biofilmes abraçando-estruturas superficiais bacterianas quere observado. Em seguida, a mesma experiência foi repetida com um caudal de 8 ul / h. Neste caso, a formação de biofilme de novo iniciado depois de alguns minutos de infusão da cultura bacteriana diluída. No entanto, depois de algumas horas, a aparência de estruturas filamentosas que se estendem entre as micro-colunas foi observada perto da secção média do dispositivo (Figura 4). Estas estruturas filamentosas podem ser visualizadas através da presença de bactérias imóveis. Essas estruturas são conhecidas como serpentinas e são biofilmes filamentosos que só são amarrados em uma ou ambas as extremidades para as superfícies. O restante da estrutura é frequentemente suspensas em meio líquido (tal como no presente caso). Figura 4 mostra o tempo de evolução da estrutura do biofilme flâmula. Flâmulas geralmente formam devido ao efeito de cisalhamento do fluido sobre o biofilme de visco-elástico. Figura 5 mostra as linhas de corrente e os contornos de velocidade de fluxo passando por uma série de pilares. A simulação mostra que as flâmulas queforma no nosso sistema microfluídico estão essencialmente alinhados ao longo das linhas de corrente de fluxo de fluido. A correlação entre as estruturas de fluxo e formação de biofilme flâmulas ainda não é bem compreendida. No entanto, e Kumar Das ¹⁶ propuseram recentemente que essas flâmulas formar como estado líquido altamente viscoso dos biofilmes intrinsecamente viscoelástico. Eles basearam sua conjectura sobre a observação de que a escala de tempo de formação de biofilme streamer normalmente excede em muito as escalas de tempo de relaxamento viscoelástico de biofilmes. Os biofilmes são conhecidos por se comportam como líquidos viscoelásticos e, portanto, em escalas de tempo muito maior do que a escala de tempo de relaxamento viscoelástico, que essencialmente se comportam como líquidos altamente viscosos ^17. De acordo com esta formulação, serpentinas pode-se esperar que se originam em locais de tensões de corte elevadas. Figura 5 mostra os locais de alta velocidade no canal, e estes locais coincidem com os locais de tensões de corte elevadas. No pha inicial si de crescimento, serpentinas são observados para originar perto destes locais (Figura 4).

Imagens Figura 1 microscópio eletrônico de varredura (SEM) do canal microfluídicos (top-view). a) Seção de entrada, b) Região contendo micro-pilares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 etapas seqüenciais envolvidos na cultura bacteriana. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 Time-lapse imagem confocal de evolução de flâmulas. Plano da imagem corresponde a z = 25 um ou seja, do meio do dispositivo. Elipses tracejadas demonstram flâmulas biofilme. favor cliqueaqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 simulações mecânicas de fluidos computacional, mostrando linhas de corrente e contornos velocidade do fluxo passado micro-pilares. Fluxo de fluido é de cima para baixo escala e velocidade é em m / s. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nós demonstramos um dispositivo micro simples que imita meios porosos para estudar o desenvolvimento de biofilme em habitats complexos. Existem vários passos críticos que ditam o resultado das experiências. Eles incluem a geometria do dispositivo. Embora a geometria pós podem variar, de poros adequado para o espaço de modo a formar serpentinas é necessário. Além disso, Valiei et al. ¹ demonstraram que a formação da flâmula ocorre apenas em um determinado intervalo das taxas de fluxo. Em taxas de fluxo mais baixas do que um valor limiar, a deformação de biofilmes em serpentinas não pode ser observado. No entanto, acima de um determinado valor de vazão outro limiar, fratura biofilme pode dominar e não permitir a formação de serpentinas. Outra questão que pode assolar estas experiências é bolhas de gás que possam ficar presas na matriz micro-pilar. Normalmente, estas bolhas têm que ser removidas, aumentando a taxa de fluxo inicialmente e em seguida a diminuir gradualmente com o valor desejado.

Plataformas microfluídicoscomo estes oferecem várias vantagens e algumas limitações. A plataforma permite-nos trabalhar com pequenos volumes de cultura, e tem a flexibilidade de incorporar características definidas pelo usuário. Por exemplo, diferentes estruturas porosas podem ser simuladas pela alteração dos parâmetros geométricos da rede de micro-coluna. Mesmo estruturas que imitam a estrutura aleatória de meios porosos real pode ser fabricado em plataformas de microfluidos ^18. Além disso, vários desses canais pode ser implementado em um único dispositivo permitindo a recolha de dados pertinentes significativas para a análise estatística precisa. No entanto, os sistemas de microfluidos tipicamente imitar a estrutura bi-dimensional de meios porosos. Dispositivos que podem imitar a natureza tridimensional de meios porosos são geralmente muito difícil de fabricar.

Formação e evolução das flâmulas ainda não estão bem entendidas, e mais pesquisas são necessárias neste sentido. Compreensão de como flâmulas formar e levar para o formatoion de estruturas biofilme maduro será relevante para uma ampla variedade de cenários, incluindo o entupimento dos dispositivos biomédicos, como stents cardíacos, biofilmes no solo, e sistemas de filtração. Nossa plataforma microfluídica é um passo nessa direção.

The authors have nothing to disclose.

The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.