Kalkınma Erken Dönemlerinde Diseksiyon ve Zebra Finch Embriyolar Mansabında Analizi

The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.

Zebra ispinoz (canlıdır Taeniopygia guttata) toksikoloji ^{1, 2, 3} davranış ve bellek dahil ve ^4,5,6 öğrenme araştırma birçok alanda giderek daha önemli bir model organizma olmuştur. Sıralı bir genomu ile sadece ötücü kuş gibi, zebra ispinoz gelişim çalışmalarında kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahiptir; Ancak, zebra ispinoz gelişiminin erken evreleri iyi çalışılmamıştır. Zebra ispinoz geliştirme araştırma eksikliği küçük yumurta ve embriyo diseksiyon zorluğu isnat edilebilir. Aşağıdaki Diseksiyon yöntemi embriyonik gelişiminin tüm aşamalarında morfolojisi ve gen ifadesinin soruşturma için izin verir embriyonik doku hasarı en aza indirir. Bu, parlak alan hem de izin verir ve embriyo floresan görüntüleme kalitesi, örneğin in situ hibridizasyon (ISH), hücre çoğalma deneyleri ve bu nicel rea gibi kantitatif deneyleri için RNA ekstraksiyonu gibi moleküler prosedürler kullanmakl-time PCR (qtRT-PCR). Bu teknik müfettişler erişimi önce zor olan gelişiminin erken aşamalarında çalışma sağlar.

Bu tekniğin genel amacı gelişimsel çalışmaları geniş bir yelpazede kullanım için embriyogenezisin ilk aşamalarından itibaren zebra ispinozu (canlıdır Taeniopygia guttata) embriyolar elde etmektir. Zebra ispinoz baskın ötücü bir model organizma olmuştur ve toksikoloji ^1,2, davranış ^3, bellek ve ^4,5,6, karşılaştırmalı nöroanatomisini ^7,8 öğrenme ve dil gelişimi ^9,10 dahil olmak üzere çeşitli alanlarda, yaygın olarak kullanılır olmuştur . Sıralı bir genomu ile sadece ötücü kuş gibi, zebra ispinoz bilinen kuş türünün ^{11, 12,13%} 50 üzerinde temsil Passeriformes düzeni, moleküler ve genetik çalışma sağlar.

Alanları çeşitli bir dizi yetişkin ve çocuk zebra ispinoz kullanılmasına rağmen, birkaç çalışma özellikle gelişiminin erken evrelerinde, zebra finch embriyolar üzerinde yapılmıştır. Bu onların yumurta a küçük boyutu isnat edilebilirnd embriyolar ve tavuk (Gallus gallus domesticus), daha önce bir baskın model sistemi ^{17,18,19,20,21} olarak kullanıldığı çalışmalar için bir model organizma ^14,15,16 olarak yeni durumu. Ancak, non-vokal öğrenenler olarak, tavuk vokal öğrenme, vokal öğrenme, kalıtım, davranış ve motor ¹⁰ öğrenme dahil kortikal-bazal ganglion devre gelişimi genetik temeli eğitim için uygun bir model sistem değildir.

Bu zebra ispinoz embriyoların çok daha hassas ve daha kolay zarar diseksiyon ve moleküler işlemler sırasında civciv embriyoları daha olduğunu not etmek önemlidir. Zebra ispinoz embriyolar üzerinde permeabilizasyon adımları gerçekleştirirken özellikle de daha fazla bakım gereklidir. Bir civciv embriyo zarar olmaz güçlü deterjanlar ve enzimler zebra ispinoz embriyolar zarar verebilir. Genel bakım açısından, bir inkübatör içinde yerleştirilmesinden önce küçük fincanlarda zebra ispinoz yumurta koymak için gereklihaddeleme inkübasyon sırasında kırılmasını önlemek için.

Zebra ispinoz kolayca ve semereli esaret yıl boyunca cins, davranışsal çalışmalar için uygun olan, ve vokal öğrenenler vardır. Bu özellikler zebra ispinoz kullanımı gelişimini, genetik ve dil davranışsal açıdan entegre bir model organizma için ihtiyacını gidermek için izin verir. Zebra ispinoz ²² özgü bir yeni geliştirilen evreleme kılavuz ile birlikte aşağıda ayrıntılı diseksiyon yöntemleri, zebra ispinoz giderek yararlı bir standart gelişimsel model organizmadır olun. Ancak, erken aşamalarında embriyoların elde edilmesi zor olabilir. Bu protokol araştırmacılar kolayca erken evre embriyolar elde etmesini sağlar. Zebra ispinoz karmaşık davranışlar, ya da diğer küçük gelişme üzerinde toksikolojik etkilerin erken gelişim ve moleküler gelişim temelini araştıran çalışmalar, ötücü kuşlar bu diseksiyon yöntemi yararlı bulacaksınız.

Etik Açıklama: yöntemler William ve Mary Koleji'nde damızlık koloniden evcilleştirildiği zebra ispinoz ile yapılmıştır. Tüm prosedürler RSPCA kuralları ²³ takip ve William ve Mary'nin OLAW (Laboratuar Hayvan Refahı Ofisi) Hayvan Refahı Güvence (# A3713-01) Koleji tarafından onaylanan ve (# 2013-06 Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onayı vardı -02-8721-dacris).

1.. Yumurta Toplama ve Kuluçka

1. Karanlık döngüsü: 14:10 ışık zebra ispinoz çiftleri kurmak. Yiyecek, su, saman, ve bir yuva kutusu safada kaynağı. Not: zebra ispinozlar için Rutin bakım ve ıslah iyi ²³ tarif edilmiştir.
2. Eğerek raflı bir standart civciv kuluçka hazırlayın. Not: her gün kuluçka altına su eklenerek% 95 nem - 80 - ° C (1 + /) 37,5 de yapay kuluçka koruyun. Kuluçka iki gün boyunca dengelenmeye izinkullanmadan önce.
   1. Inkübatör yumurta tutmak için en az 2,5 cm derinliğinde küçük besleme bardak (5 x 7,6 cm) seçin. Hala yumurta kolayca rulo izin verirken Hat alt ve kağıt havlu iki kat ile fincanın alt kenarları gr, doldurulur ve böylece. Kuluçka devirme raflarında bu bardak yerleştirin. Not: Çok fazla dolgu haddeleme inhibe edebilir nedeniyle kabuk iç yapışma başarılı embriyo inkübasyon önleyecektir edilmektedir.
3. , Işık çevriminin başlamasından sonra iki saat yumurta toplayın. Not: Bu, ebeveyn inkübasyon nedeniyle, belirli bir inkübasyon süresi için gelişme aşamasında farklılıkları en aza indirir.
   1. Yavaşça yumurtanın uzunluğu boyunca ucu ve üssünde başparmak ve işaret parmağı ile yumurta Pick up. Yuva toplanan koydu tarih ve saati etiketlemek için bir donuk, yumuşak 4B grafit kalem kullanın. Not: yumuşak 4B kalem kırılgan yumurtaların kırılma kalem riskini azaltır.
   2. Her c 5 etiketli yumurta - 1.3.2), 1. Sırainkübatör yumurta serbestçe kabuğun iç embriyonik yapışmasını önlemek için bir rulo, böylece kadar. Not: Bir fincan içinde fazla 5 yumurta yerleştirme bireysel yumurta yuvarlanmasını önlemek ve embriyo canlılığını azaltabilir.

Egg adlı Embriyo 2. Kaldırma

1. , Diseksiyon için hazırlık aşağıdaki malzemeler monte etmek için: Temiz bir neşter, ince uçlu forseps ve iki ekstra ince uçlu forseps. 10 x 10 cm diseksiyon için temiz, emici olmayan bir yüzey temin etmek üzere kesme kapsam bazında kağıt ağırlığı koyun. Not: Bu sarısı kolay manipülasyon izin verir ve bir neşter ile hassas membranlar kesim için en iyi yüzey çünkü tartmak kağıt önemlidir.
2. 50 ml'lik bir polipropilen tüp içinde fosfat tampon tuzlu su (1X PBS) bir kısım hazırlanması ve en az üç aktarma pipetler ve küçük bir kova atık kazanır. Embriyoların sabitleme durumunda,% 4 paraformaldehit (PFA) bir kısım hazırlamak Dikkat:. PFA buharlar toksik, bird PFA ile ilgili tüm adımlar maruziyeti en aza indirmek için davlumbaz içine yapılmalıdır. Flaş embriyoların dondurulması durumunda, sıvı azot elde edilir ve diseksiyon kapsamı yakın tutun. Sterilite bu diseksiyon protokol için bir sorun değil, ama tüm malzemelerin temiz olduğundan emin olun.
3. Zebra ispinoz hazırlama kılavuz ²² de tarif edildiği gibi arzu edilen bir aşama için gereken zaman noktasında inkübatör yumurta çıkarın. Not: ²² 12 embriyolar (Şekil 3A) aşamasında incelemek için aşama 6 embriyolar (Şekil 4A) ²² incelemek ve inkübasyon 56 saat sonra yumurta kaldırmak için 36 saat kuluçkadan sonra yumurta çıkarın.
4. Bir fiber optik aydınlatma lamba kullanarak, içini aydınlatmak için yumurta yoluyla, dikey eksen ve parlaklık ışık boyunca tutarak yumurta mum. Yumurta arkasında ışığın ucu yerleştirin ve yumurta sarısı ve gelişmekte olan embriyo bulun.
   1. Yumurta sarısı karşı tarafında neşteri yerleştirin ve ucundan yumurta boyunca kesilmişsoluk basıncı ile taban.
5. Dikkatli bir başparmak ve işaret parmağı ile yumurtanın ucu ve taban baskı uygulanması ya da hafifçe forseps ile kesik boyunca yumurtaların ayrı kanırtarak ile yumurta içeriğini çıkarın. Sarısı yavaşça çıkarıyor ve böylece doğrudan tartmak kağıdın üstünde yumurta açın.
6. Embriyo gelişimini çevreleyen soluk beyaz bir halka olarak görünür ve embriyo merkezinde böylece ekstra para cezası kullanarak sarısı forseps uçlu şark kavşak beyaz bölge için sarısı inceleyin.
   Not: sarısı yüzeyinde hafif bir beyaz daire görülmektedir değilse, ince forseps almak ve yavaşça embriyo yumurta sarısı üstüne kadar sarısı üzerinde rulo. Not: aşamaları için 1. - 9. ^22, embriyonik bir disk çapı en az 6 mm, ve yumurta sarısı yüzeyinde hafif bir hafif opak disk gibi görünür - Referans Şekil 1 'e bakınız. Aşamaları için 10 ve üzeri ^22, kan havuzu geliştirilmiş V'yi izinembriyonun isibility, ama bu zor embriyo bulma yapar gibi, yumurta sarısı kesesi delinmesiyle önlemek için özen.

Ekstra embriyonik dokudan Embriyo 3. Ayırma

1. Basıncı (Şekil 1B) rahatlatmak için sarısı kenarlarını delinme ve embriyonik diskin yanında sarısı çapı uzunluğu boyunca bir kesim yapmak. Embriyoyu içeren sarısının bölümü başarılı bir şekilde (Şekil 1 B) ayrılmış kadar bu çapraz çizgiler hale tekrarlayın. Not: Bu adım, yumurta sarısı kütle bozulmamış olarak kalmasına imkan vermekte, ancak embriyonik yapılara zarar görmesini engelleyen, embriyo etrafında keserken sarısının yüzeyi üzerindeki düşük basınç daha hassas sağlar.
2. Bir transfer pipet sarısı kenarlarını çıkarın. Mümkün olduğu kadar çok yumurta sarısı çıkarmak, ama embriyo tartmak kağıt ve yıpranma kuru bir yüzeye bağlı değildir ve böylece bir miktar bırakınız.
3. Dispens ile embriyonik diski yıkayınembriyonun altına doğru 45 ° 'lik açıyla 1X PBS ing. Yanındaki değil yukarıda embriyonik diske transfer pipet ucu yerleştirin. Ek sarısı ihtiyaçları kaldırılacak durumunda, Petri kabına embriyo transfer etmeden önce ağırlık kağıdı üzerinde herhangi bir neşter ile yumurta sarısı ayırın. Not: Bu yöntem, tartmak kağıdın yüzeyinden embriyo kaldırır.
4. Küçük bir plastik Petri kabına 1X PBS minimal hacimde ile birlikte bir transfer pipeti kullanarak embriyo transfer edin. Embriyonun, doğrudan değil, Petri kabı içine daha 1X PBS eklenmesi ve yakın 1X PBS damlama ancak ile embriyo yıkayın. Petri kabı transfer pipet ile atık 1X PBS yıkama ve kaldırmak kalan yumurta sarısı, Petri eğin ve kaldırmak için girdap.
   Not: 1X PBS çıkarıldığında plastik yüzeyin kalan 1X PBS ile kaygan olduğu için, embriyo tipik olarak Petri tabağın tabanına bağlı değildir. Embriyo çanak yapışır, ancak daha 1X PBS eklenebilir.
   Eğer sabitleme to embriyo, adımları 3.5 ve 3.6 izleyin. Flaş embriyo dondurma, hemen 3.8 adıma atlayın.
5. In situ hibridizasyon için embriyo sabitleme, hemen embriyo daldırın Petri kabına% 4 PFA ekleyin. Düzleştirmek için embriyonun en doğrudan% 4 PFA Damla; Bu kıvırma embriyo engeller. 12 saat boyunca 4 ° C 'de% 4 PFA içinde embriyo düzeltildi.
   1. Tespit edildikten sonra, dereceli metanol% 100 MeOH içinde -20 ° C'de (MeOH) çözümleri ve mağaza embriyolar kurutmak.
6. Embriyo aşamaları 1 arasında ise - 8 ^22, embriyo yapışık vitellin membran kaldırmak. Not: Bu adım tespit sırasında veya sonrasında yapılabilir. Onlar vitellin membran bağlı çünkü aşamada 8 ²² daha genç embriyoların kolayca Şekil 2A görüldüğü gibi önemli yapıları engellemeyecek, görselleştirilemediği.
   1. Kavrama Ekstra ince forseps ile birleşme mahalli ötesine uzanan zarın kenarı. Carefully kalan yumurta sarısı granülleri yıkayacak ve vitellin zara embriyonik diskin yapışmasını gevşetmek için birden fazla kez embriyo çevirin. Not: Bu embriyonik yapılara zarar verir gibi, embriyonun ortasına dokunmayın.
   2. Bir boşluk kavşak bölgesi ve vitellin membran arasında görünmüyorsa, yavaşça ekstra para cezası ile kavşak bölge vitellin membran gevşetmek için forseps uçlu kazıyın. Kavrama ekstra para cezası ile vitellin membran forseps uçlu ve yavaşça embriyo çekin. Gerekirse, yavaşça birleşme bölgesi embriyonik diskin periferik kenarı kavrama tarafından uzak vitellin zardan embriyo çekin.
   3. Çıkarılmasından sonra biohazard 1 atıkların (biyogüvenlik düzeyi 1) de vitellin zar atın.
7. Civciv embriyo ^{24, 25} standart tüm montaj ISH protokolleri takip, ancak aşağıdaki önerileri dikkate genç embriyonik aşamalarında bir ISH deneyi yaparken.
   1. , ISH prosedürü esnasında embriyolara zararı azaltmak her embriyo için bir vidalı kapak ile tek bir 5 ml bir cam şişe kullanın. Embriyoların tam olarak su altında olmasının sağlanması, çözelti 3 ml - Sadece 2 şişeler doldurulur. Nutate şişeleri dikey bir strafor raf (veya güvenli şişeleri tutacak herhangi rafa) içine 5 ml şişeleri koyarak bir nutator için güvenli olduğunu. Not: Bu önlem yatay nutation sırasında şişenin kapak ile temas ettiğinde meydana gelebilecek, yırtılmış olan embriyo engeller.
   2. Embriyolar aşaması için 0 - 6 ^22, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1X Ptw içinde 5 ug / ml proteinaz K ile muamele. Arka plan boyama azaltmak için 37 ° C'de 10 dakika boyunca 1X Ptw 12. ²² ile 10 ug / ml proteinaz K - embriyolar 7 kademeli Treat.
   3. 12 saat için 10 ug / ml prob konsantrasyonu ile inkübe edilir, 10 ²² - aşamada 1 gen ifadesi düşük seviyelerde tespit etmek için yeterli bir renk reaksiyonu üretmek. Eski aşamaları için, 1 & # ile inkübe956, 60 ° C'de g / ml prob konsantrasyonu
8. Diseksiyonu aşağıdaki Petri kabı 3 ml 1X PBS ve sarısı zerrelerden embriyo ayırmak için Petri tenteli - flaş dondurma embriyo, hızla 2 eklerseniz. Sıvı çıkarın ve 2 tekrarlayın - tüm yumurta sarısı kaldırmak için 3 kez. Ince kullanarak -80 ° C'de depolamadan önce, bir ön-etiketli mikrosantrifüj tüpü ve sıvı nitrojen içinde hızlı dondurulması için forseps, transfer embriyo uçlu

4. Edu Hücre Çoğalma Tahlili. Kuruluş ve Zebra Finch Embriyolar edu tespiti.

1. Embriyo veya sarısı bulmak için bir fiber optik aydınlatma lamba kullanılarak yumurta Mum.
2. Embriyo mikroenjeksiyon işlemi sırasında hasar görmesini sağlamak için yumurta içinde embriyo ya da sarısının konuma yumurta ters yan işaretleyin.
3. Çizgi istenen yönde yumurta tutmak için bir kase şeklinde modelleme kil ve kalıp onu bir 60 mm plastik tabak. Belirgin bir nokta olmalıdırmikromanipülatör kullanarak mikroenjeksiyon iğnenin sokulmasına olanak sağlamaya yönelik. Not: kil mikro enjeksiyon sırasında ve aşama 4.11 kuluçkalama boyunca yumurta stabilize olacaktır.
4. Iki cam kılcal mikroenjeksiyon iğneler çekin. Işaretli noktada yumurtanın içine bir delik açmak bir iğne künt. Mineral yağ ile atılmasıyla ve mikroenjektör takarak püskürtülmesi için ikinci bir iğne mikroenjeksiyon hazırlayın.
5. Mikroenjektör üzerinde 59.8 nl enjeksiyon başına salınan çözeltisinin hacmini ayarlayın.
6. 10 mM stok Edu çözeltisi ile mikroenjeksiyon iğne yerleştirin.
7. Kabuk paramparça veya yumurta boşluğuna kabuğun parçaları damla değil dikkat ederek, keskin olmayan cam boru ile belirgin bir noktada kabuğunda bir delik oluşturur. Delik mikroenjeksiyon iğne sarısı veya embriyo boşluğuna doğrudan takılmasını sağlayan, 45 ° açıda olacak şekilde yumurta yönlendirin.
8. Mikromanipülatör kullanarak, eklemekyaklaşık olarak 1.0 cm boşluk içine iğne yüklendi.
9. Doğrudan veya gelişen embriyonun yumurta sarısı üzerine edu çözeltinin istenilen miktarda enjekte edilir. Not: edu 478 nl bir embriyonik fazla ölüme neden olmadan enjekte edilebilir.
10. Hemen yumurta ve inkübasyon sırasında embriyo kuruma önlemek için çanak kapağı plastik wrap çoklu katmanlar ile yumurta ve kil tutucu sarın. Plastik bant kenarlarının inkübasyon sırasında açılması gelen plastik önlemek için tabağın tabanına kaydırılır. Not: Plastik wrap sadece diseksiyonu hemen önce çıkarılmalıdır.
11. İstenen aşama ulaşana kadar yeni çoğalan hücreler 37 ° C'de inkübe edilerek yumurta edu dahil izin verin. Enjeksiyonundan sonra, inkübatör raflar devirme için yumurta dönmez. Inkübatör içinde sabit bir yüzeye plastik sarılı kil astarlı çanak yerleştirin.
12. Plastik kaplamayı çıkarın ve yukarıda belirtilen protokol takip embriyo teşrih.% 4 PFA içinde embriyo saptamak ve yukarıda tarif edildiği gibi, 4 ° C'de 12 saat inkübe edilir. Tespit edildikten sonra, daha fazla analiz edilinceye kadar -20 ° C de taze% 100 EtOH içinde 5 dakika ve saklamak için% 100 etanol (EtOH) ile yıkayın.

5.. Edu Tepki Protokolü "Click"

Aşağıdaki adımlar, tüm cam şişelere gerçekleştirilir.

1. , Aşağıdaki birbirini takip eden 5 dakika yıkama ile embriyolar rehidrate:
2. EtOH,% 75 EtOH ve% 25 steril deiyonize% 25 EtOH ve 75% 1X Ptw,% 100 1X Ptw, (SDD), su,% 50 EtOH ve% 50 SDD damıtılmış su
3. 10 dakika her biri için% 100 1X Ptw üç kez yıkayın.
4. 9 bölgelerine 10X stok tampon çözeltisi (10 ul) 1 parçası birleştirilerek reaksiyon tamponu ilave (Kit Bileşen F) seyreltin, su (90 ul) sdd.
5. Karıştırılarak, ayrı bir tüp içindeki tepkime karışımı hazırlayın: 100 ul seyreltilmiş reaksiyon tamponu ilave 875 ul 1X PBS, 20 ul CuSO _4, 5 ul azit.Not: reaksiyon karışımı hacmi küçültülmüş olabilir. Embriyo tam olarak reaksiyon karışımı içinde kapalı olduğu durumlarda, reaksiyon çalışacaktır. Kullanılmadan hemen önce seyreltildi reaksiyon tamponu ilave (adım 5.3) ilave edin. Tüm takip eden aşamalar karanlıkta gerçekleştirilir. Işıktan korumak için folyo ile örtün embriyolar.
6. Alüminyum folyo ile şişeleri örtün ve bir nutator bağlı bir styrofoam rafa yerleştirerek, iki saat boyunca oda sıcaklığında dikey olarak inkübe edin.
7. 10 dakika her biri için taze 1X PBS embriyolar 3 kere yıkayın.
8. 4 ° C'de gece boyunca taze% 4 PFA embriyolar inkübe
9. 4 ° C'da taze 1X PBS içinde 10 dakika her biri ve saklamak için 1X PBS içinde 3 kez yıka Daha fazla analiz kadar folyo ile embriyolar örtün.

Vitellin zar (A) eklenmiş ve yumurta sarısı (B) embriyo ayırmak için uygun bir yöntem göstermektedir ise, Şekil 1 'de gösterilmiş adımlar embriyo görünümünü göstermektedir. Embriyo vitellin membran çok daha hafif olan birleşme, bir bölgesi tarafından tespit edilebilir. Sarısı kesip kadar embriyo kendisini ayırt etmek genellikle zordur. Embriyo yumurta disseke sonra, sabit olabilir veya flash ileride kullanılmak üzere dondurulabilir. In situ hibridizasyon, bir kesilmiş embriyo için planlanan, bu birleşme bölgesi yoluyla embriyo yapıştırıldığı vitellin membran kaldırmak için gereklidir., Bu membran (C) çıkarıldığında 2 embriyo geliştirilmiş görüş göstermektedir Şekil, ve vitellin membran (A, B) soymak için doğru yolu. Diseksiyon ve fiksasyonu sonra, bütün in situ hibridizasyon monte Şekil 3 (A, A ', B, B görüldüğü gibi gerçekleştirildi') Ve Şekil 4, (A, A', B, B ') ve Şekil 5 (A, B, C) ​​orthodenticle homeobox 2 gelişimsel PTWI düşük dozlarına maruz embriyolar (Otx2) ifade farklarını tespit etmek. Şekil 5, Şekil anlamda tarama sonuçları, arka demonstrating eksikliği. Kontrol embriyo 6 ²² (A, A sahne için geliştirilmiş olup, Şekil 4 de, aynı zaman noktasında yumurta kesilerek rağmen, gelişimsel PTWI (MeHg) maruz embriyo, aşama 5 ²² (B, B ') kadar ilerlemiştir '). Kesilir ve Şekil 4'te gösterilen embriyo grubu, yuva toplanan ve aynı zamanlarda inkübatörden alındı. Bazı doğal varyasyon gelişimi mevcut olsa da, önceki diseksiyon verilerine dayanarak, bu inkübatör sıcaklık dalgalanmaları yalnızca 2.4 ppm PTWI embriyolar develo olmasına neden olacağı olası değildirpmentally erteledi. Aşamada farklar gelişimsel PTWI maruz embriyolar, hücre çoğalmasında bir değişiklik göstermektedir.

Diseksiyon önce, Edu günde 2 yumurta içine enjekte ve gecede kuluçkaya bırakıldı. Aşamada 16 ²² embriyo diseksiyonu ve tespit sonrası, edu Şekil 6 (A, B, C) ​​de görüldüğü gibi çoğalan hücrelerin saptanmasını sağlayan kimya "tık" ile görüntülendi. Bu gelişimsel ilerlemesini bozabilir PTWI maruz kalma gibi, inkübatör ve diseksiyon sırasında yumurtaları yerleştirerek veya edu tahlil yaparken dikkatli zaman noktalarını izlemek için önemlidir. Ilk enjeksiyon adım 1.3 'de belirtildiği gibi toplama gündü gün 0, üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu embriyo yaklaşık 38 saat sonra (evre 7 ²²⁾ disseke edildi. Sağkalım oranı sürece enjeksiyon miktarı 478 nl altında olduğu gibi yaklaşık% 90 (kontrol embriyolar gibi aynı oran) olarak bulunmuştur.

Bu diseksiyon metodoloji aynı zamanda yüksek kalitede RNA çıkarılması için izin verir. Evre 16 ²² embriyolar diseksiyon sonra, bir RNA ekstraksiyon, Şekil 7'de görüldüğü gibi, herhangi bir gerekli optimizasyonu ile üreticinin protokolüne uygun olarak yapıldı. Vitellin membranın kaldırılması RNA ekstraksiyonu ve daha sonra QRT-PCR uygulamalar için gereksizdi.

Not: ön ve arka bölgeleri sırasıyla görüntüleri üstünde ve altında yer almaktadır, böylece tüm embriyo şekiller yönlendirilmiştir.

Şekil 1.. Zebra ispinoz embriyo bulma ve diseksiyon için Prosedürü, 1-10 ²² sahneliyor. Soluk beyaz diski (A) açıktır kadar yavaşça sarısı yuvarlayarak embriyo bulun. Bir kezembriyo sarısı merkezinde yer alan, yumurta sarısı ilk kesim (1) ve sonraki kesim (2) hangi kavşağı (ZJ) bölgesini sınır vitellin membran basıncı hafifletir kademeli bir şekilde (B) disseke edilir vitellin membran yapıştırılır. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder.

Vitelline membran ve embriyonik yapıların görünürlük Şekil 2.. Çıkarılması.% 4 PFA ihtiva eden bir Petri kabındaki sarısından embriyonun kaldırılması, yer embriyo ardından. In situ hibridizasyon bir yapılması gerekiyorsa, embriyonik yapıların görüş gereklidir ve vitellin membran (A) çıkarılması ile elde edilebilir. Kavrama ekstra para cezası ile vitellin membran forseps uçlu ve gerekirse hafifçe, dış kenarında doğrudan embriyo işleme göre embriyo uzak soyulması(B). Vitellin membran kaldırma embriyonik yapıların açıklık arttırır ve embriyolar, in situ hibridizasyon (C) ile görüntülenebilir veya işlem sağlar. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,. Tüm montaj in situ hibridizasyon gelişimsel orthodenticle homeobox 2 (Otx2) of PTWI. Salgılanma modellerini maruz zebra ispinoz embriyolar üzerinde 0.0 ppm PTWI (A, A ') ve 2,4 ppm PTWI (B, B maruz embriyolar karakterize edilmiştir ') ebeveyn diyet yoluyla. Dorsal (A) ve Otx2 ventral (A ') ifadesi Tedavi grubu embriyolar aynı zaman noktasında disseke edildi. kademeli 12 ²² sırasında orta beyin ve optik veziküller boyunca görülebilir, ancak gelişimsel (B) dorsal görüldüğü gibi gecikmeli ve sahnede 11 ²² Kısaltmalar karakteristik kafa yapıları, ventral (B ') görünümü:. mb, orta beyin; op, optik vezikül. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder.

Şekil 4. Tüm montaj   in situ   melezleme gelişimsel orthodenticle homeobox 2 (Otx2) ait PTWI. İfade kalıpları maruz zebra finch embriyolar üzerinde sahnede 6 ²² Embry karakterize edildi os 0.0 ppm PTWI (A, A ') ve evre 2.4 ppm PTWI (B, B maruz 5 ²² embriyolar' ebeveyn diyet yoluyla) maruz. Kısaltmalar: AM, mezodermin ön marjı; hayır, Notokordun, Notokordun mezoderm; po, proamnion, anterior blastopore; ps, ilkel çizgi ^22. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder.

Şekil 5,. Tüm yerinde montaj   melezleme anlamda prob kullanılarak zebra finch embriyolar üzerinde. (A) Aşama 5 ²² embriyo. (B) Erken evre 6. ²² embriyo. (C) Sahne 11 ²² embriyo. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder.

6 "src =" / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
Şekil 6.. Edu kuruluş ve zebra ispinoz embriyolarda de ması. Edu kimyası bir aşamada 16 ²² embriyo (A, B, C) ​​çoğalan hücreleri algılamak için kullanılan "tıklayın". Edu timidin ^{26, 27} yerine DNA içine dahil edilir ve tıklama ²⁷ kimyası kullanılarak tespit edilir. Silahların Yayılmasını Önleme Somitlerin yan kenarları ve tailbud açıkça görülebilir. Panel A embriyonun posterior olarak ortaya çıkan, çoğalmasını gösterir ve aynı zamanda tek tek proliferatif hücrelerini göstermektedir. Panel B tüm embriyo proliferatif konumları gösteriyor. Panel C anterior bölgesini göstermektedir, ve daha detaylı olarak yüksek proliferatif telencephalon (te) göstermektedir. Kısaltmalar: af, amniyotik kat; flb, ön ayakları tomurcuk; hlb, arka bacak tomurcuk; le, lens vesicle sergilemez; ms, mesencephalon; mt, Metencephalon; opc, optik fincan; pa, faringeal kemer; sm, somite mezoderm; tb, tailbud; te, telencephalon. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Parçalara zebra Finch embriyoların. Kontrol (0.0 ppm) ve 1.2 ppm PTWI embriyolardan ekstre RNA Şekil 7. Kalite kesilir ve Aşama 3.8 'de tarif edildiği gibi flaş dondurulmuştur. Her bir şerit, her bir tedavi grubundan iki homojenize embriyolardan ekstre RNA gösterir.

Bir embriyolojik evreleme rehber ²² ve genom açıklama son gelişme zebra ispinoz gelişimsel çalışmalar için arzulanan bir model organizma olun. Ancak aşamalarında 1 3 ila 7 mm arasında zebra ispinoz embriyoların, küçük boyutu ve kırılganlık - 10 ^{22, 11, 14} diseksiyonu zorlaştırabilir. Yerini ve temiz sarısının yüzeyinden embriyoların kaldırarak zor olabilir. Bu protokol kolaylıkla yordamı gerçekleştirmek için yeterli ayrıntı sağlar. Bu protokol, başarılı bir diseksiyon sağlamak için tipik olarak bilinmemektedir, ancak gerekli olan kritik adımlar gösterilmektedir. Örneğin, embriyo ve yapışmasını önlemek için kağıt tartın tabaka arasında sarısı küçük bir tabaka bırakmak için gereklidir.

Embriyonun tanımlanması ve çıkarılması zor hem de olabilir. O sahip sonra sarısının yüzeyinde embriyo belirlenmesi gidermek için, doğrudan yumurta sarısının üzerinde ışık saçıyoryumurta kaldırılır ve embriyo bulmak için bir 45 ° açıyla sarısı bakmak edilmiştir. Embriyo bulunduğu kez, embriyo gözyaşı değil özen kağıdı tartmak sarısı kesti.

Yapıların daha iyi görüntülenmesi için 8 ²² - başka uygulamalar da in situ hibridizasyon anatomik farklılıklara, veya hücre proliferasyon deneyleri için görüntüleme dahil, bu aşama 1 'de vitellin membran kaldırmak için önemlidir. Erken aşamalarında sarısı veya vitellin zarı çıkarırken sorun yaşıyorsanız eğer, embriyonik kırılganlığını azaltmak için 1X PBS yıkamadan önce% 4 PFA embriyo düzeltmek. Anlatıldığı gibi birinci diseksiyonu sırasında vitellin membran kaldırarak, yapıları in situ hibridizasyon bir gerçekleştirdikten sonra açıkça zebra ispinoz embriyo görünür ve sağlamdır.

Edu bir sınırlaması embriyonik ölüm 478 nl yol üzerinde dozaj ciltlik bu uygulanmasıdır. Ancak, geniş doz aralığı varyin sağlarproliferatif hücre etiketleme g seviyeleri.

Bu kitte kullanılan "tık" tepki Bakır (I)-katalize-Alkin-Azit-siklokatılma (Cu (I) AAC) 'dir. Bu özel reaksiyonda, bir alkin-timidin içeren analog bir molekül (EGT) aktif olarak bölünen hücreler ile bu buluşa katılmıştır. Edu içindeki alkin grubu, DNA'nın sarmal çıkıntı yapısından ve serbest alkin grubuna bağlanan, yeşil floresan molekülüne konjuge edilmiş bir azid moleküle maruz bırakılarak tespit edilir. Yeşil floresan embriyoda yeni çoğalan hücreleri gösterir. Bu reaktif türler organizmada doğal olarak mevcut değildir, çünkü azid biyo-diklik ve alkin grupları özel olmayan lekelenme engeller. DNA ortaya reaksiyon için sırayla denatüre olması gerekmez, çünkü aynı zamanda, bundan başka DNA'ya bağımlı analizi kolayca gerçekleştirilebilir ²⁷ olabilir.

Bu yöntemin bir içsel sınırlılığı, küçük boyutlu ve parçaları kullanılmıştır olduğuzebra ispinoz embriyoların ility. Dikkatli yapılmadıysa 15 ²² zararlı embriyonik yapıların neden olabilir - embriyoların vitellin membran Çıkarma 1. aşamaları. Ancak, bu protokol, araştırmacılar daha önceden derinlemesine incelenmemiştir yapısal anomaliler ve gen ifadesini incelemek için erken embriyonik aşamalarında kullanmak için izin, diseksiyon yöntemini kolaylaştırır. Bu protokol, araştırmacılar yetişkin fenotipleri gelişimsel kökenlerini belirlemek sağlayacak hücresel-moleküler deneyleri bir bolluk için yolu açar. Örneğin, gen ifadesi çeşitli çevre koşullarında vokal öğrenme karıştığı veya geliştirme ^{28, 29,30,31} ve erken aşamalarında farmakolojik tedavi aşağıdaki incelemek mümkün olacaktır. Bu çalışmada gösterilememiştir rağmen, bu metot potansiyel zebra ispinoz doku bölümleri ve elektroporasyon / ov situ hibridizasyon gibi radyoaktif gibi diğer işlemler için izin veriro cerrahi ^{32, 33,34.} Zebra ispinoz edebiyatının bir büyük gövdesi içinde önemli bir model organizma olarak kurulmuş olduğu göz önüne alındığında, bu tür çalışmalar, yetişkin fizyolojisi ve davranışları ile gelişim mekanizmalarını bağlantı dilinde ^{7, 9} özellikle geliştirme kullanılmayan fırsatlar sağlar.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yazarlar kendi finansman kaynaklarını, William ve Mary Koleji Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Fen Eğitimi Programı teşekkür ediyorum; Hibe sponsoru: NIH (MSS); Hibe numarası: R15NS067566. Onlar da hayvan bakımı ile ilgili yardım için Fen William ve Mary Koleji, Biyoloji Bölümü ve College destek için minnettarım.