Method Article
The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.
Zebra ispinoz (canlıdır Taeniopygia guttata) toksikoloji 1, 2, 3 davranış ve bellek dahil ve 4,5,6 öğrenme araştırma birçok alanda giderek daha önemli bir model organizma olmuştur. Sıralı bir genomu ile sadece ötücü kuş gibi, zebra ispinoz gelişim çalışmalarında kullanılmak üzere büyük bir potansiyele sahiptir; Ancak, zebra ispinoz gelişiminin erken evreleri iyi çalışılmamıştır. Zebra ispinoz geliştirme araştırma eksikliği küçük yumurta ve embriyo diseksiyon zorluğu isnat edilebilir. Aşağıdaki Diseksiyon yöntemi embriyonik gelişiminin tüm aşamalarında morfolojisi ve gen ifadesinin soruşturma için izin verir embriyonik doku hasarı en aza indirir. Bu, parlak alan hem de izin verir ve embriyo floresan görüntüleme kalitesi, örneğin in situ hibridizasyon (ISH), hücre çoğalma deneyleri ve bu nicel rea gibi kantitatif deneyleri için RNA ekstraksiyonu gibi moleküler prosedürler kullanmakl-time PCR (qtRT-PCR). Bu teknik müfettişler erişimi önce zor olan gelişiminin erken aşamalarında çalışma sağlar.
Bu tekniğin genel amacı gelişimsel çalışmaları geniş bir yelpazede kullanım için embriyogenezisin ilk aşamalarından itibaren zebra ispinozu (canlıdır Taeniopygia guttata) embriyolar elde etmektir. Zebra ispinoz baskın ötücü bir model organizma olmuştur ve toksikoloji 1,2, davranış 3, bellek ve 4,5,6, karşılaştırmalı nöroanatomisini 7,8 öğrenme ve dil gelişimi 9,10 dahil olmak üzere çeşitli alanlarda, yaygın olarak kullanılır olmuştur . Sıralı bir genomu ile sadece ötücü kuş gibi, zebra ispinoz bilinen kuş türünün 11, 12,13% 50 üzerinde temsil Passeriformes düzeni, moleküler ve genetik çalışma sağlar.
Alanları çeşitli bir dizi yetişkin ve çocuk zebra ispinoz kullanılmasına rağmen, birkaç çalışma özellikle gelişiminin erken evrelerinde, zebra finch embriyolar üzerinde yapılmıştır. Bu onların yumurta a küçük boyutu isnat edilebilirnd embriyolar ve tavuk (Gallus gallus domesticus), daha önce bir baskın model sistemi 17,18,19,20,21 olarak kullanıldığı çalışmalar için bir model organizma 14,15,16 olarak yeni durumu. Ancak, non-vokal öğrenenler olarak, tavuk vokal öğrenme, vokal öğrenme, kalıtım, davranış ve motor 10 öğrenme dahil kortikal-bazal ganglion devre gelişimi genetik temeli eğitim için uygun bir model sistem değildir.
Bu zebra ispinoz embriyoların çok daha hassas ve daha kolay zarar diseksiyon ve moleküler işlemler sırasında civciv embriyoları daha olduğunu not etmek önemlidir. Zebra ispinoz embriyolar üzerinde permeabilizasyon adımları gerçekleştirirken özellikle de daha fazla bakım gereklidir. Bir civciv embriyo zarar olmaz güçlü deterjanlar ve enzimler zebra ispinoz embriyolar zarar verebilir. Genel bakım açısından, bir inkübatör içinde yerleştirilmesinden önce küçük fincanlarda zebra ispinoz yumurta koymak için gereklihaddeleme inkübasyon sırasında kırılmasını önlemek için.
Zebra ispinoz kolayca ve semereli esaret yıl boyunca cins, davranışsal çalışmalar için uygun olan, ve vokal öğrenenler vardır. Bu özellikler zebra ispinoz kullanımı gelişimini, genetik ve dil davranışsal açıdan entegre bir model organizma için ihtiyacını gidermek için izin verir. Zebra ispinoz 22 özgü bir yeni geliştirilen evreleme kılavuz ile birlikte aşağıda ayrıntılı diseksiyon yöntemleri, zebra ispinoz giderek yararlı bir standart gelişimsel model organizmadır olun. Ancak, erken aşamalarında embriyoların elde edilmesi zor olabilir. Bu protokol araştırmacılar kolayca erken evre embriyolar elde etmesini sağlar. Zebra ispinoz karmaşık davranışlar, ya da diğer küçük gelişme üzerinde toksikolojik etkilerin erken gelişim ve moleküler gelişim temelini araştıran çalışmalar, ötücü kuşlar bu diseksiyon yöntemi yararlı bulacaksınız.
Etik Açıklama: yöntemler William ve Mary Koleji'nde damızlık koloniden evcilleştirildiği zebra ispinoz ile yapılmıştır. Tüm prosedürler RSPCA kuralları 23 takip ve William ve Mary'nin OLAW (Laboratuar Hayvan Refahı Ofisi) Hayvan Refahı Güvence (# A3713-01) Koleji tarafından onaylanan ve (# 2013-06 Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) onayı vardı -02-8721-dacris).
1.. Yumurta Toplama ve Kuluçka
Egg adlı Embriyo 2. Kaldırma
Ekstra embriyonik dokudan Embriyo 3. Ayırma
4. Edu Hücre Çoğalma Tahlili. Kuruluş ve Zebra Finch Embriyolar edu tespiti.
5.. Edu Tepki Protokolü "Click"
Aşağıdaki adımlar, tüm cam şişelere gerçekleştirilir.
Vitellin zar (A) eklenmiş ve yumurta sarısı (B) embriyo ayırmak için uygun bir yöntem göstermektedir ise, Şekil 1 'de gösterilmiş adımlar embriyo görünümünü göstermektedir. Embriyo vitellin membran çok daha hafif olan birleşme, bir bölgesi tarafından tespit edilebilir. Sarısı kesip kadar embriyo kendisini ayırt etmek genellikle zordur. Embriyo yumurta disseke sonra, sabit olabilir veya flash ileride kullanılmak üzere dondurulabilir. In situ hibridizasyon, bir kesilmiş embriyo için planlanan, bu birleşme bölgesi yoluyla embriyo yapıştırıldığı vitellin membran kaldırmak için gereklidir., Bu membran (C) çıkarıldığında 2 embriyo geliştirilmiş görüş göstermektedir Şekil, ve vitellin membran (A, B) soymak için doğru yolu. Diseksiyon ve fiksasyonu sonra, bütün in situ hibridizasyon monte Şekil 3 (A, A ', B, B görüldüğü gibi gerçekleştirildi') Ve Şekil 4, (A, A', B, B ') ve Şekil 5 (A, B, C) orthodenticle homeobox 2 gelişimsel PTWI düşük dozlarına maruz embriyolar (Otx2) ifade farklarını tespit etmek. Şekil 5, Şekil anlamda tarama sonuçları, arka demonstrating eksikliği. Kontrol embriyo 6 22 (A, A sahne için geliştirilmiş olup, Şekil 4 de, aynı zaman noktasında yumurta kesilerek rağmen, gelişimsel PTWI (MeHg) maruz embriyo, aşama 5 22 (B, B ') kadar ilerlemiştir '). Kesilir ve Şekil 4'te gösterilen embriyo grubu, yuva toplanan ve aynı zamanlarda inkübatörden alındı. Bazı doğal varyasyon gelişimi mevcut olsa da, önceki diseksiyon verilerine dayanarak, bu inkübatör sıcaklık dalgalanmaları yalnızca 2.4 ppm PTWI embriyolar develo olmasına neden olacağı olası değildirpmentally erteledi. Aşamada farklar gelişimsel PTWI maruz embriyolar, hücre çoğalmasında bir değişiklik göstermektedir.
Diseksiyon önce, Edu günde 2 yumurta içine enjekte ve gecede kuluçkaya bırakıldı. Aşamada 16 22 embriyo diseksiyonu ve tespit sonrası, edu Şekil 6 (A, B, C) de görüldüğü gibi çoğalan hücrelerin saptanmasını sağlayan kimya "tık" ile görüntülendi. Bu gelişimsel ilerlemesini bozabilir PTWI maruz kalma gibi, inkübatör ve diseksiyon sırasında yumurtaları yerleştirerek veya edu tahlil yaparken dikkatli zaman noktalarını izlemek için önemlidir. Ilk enjeksiyon adım 1.3 'de belirtildiği gibi toplama gündü gün 0, üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bu embriyo yaklaşık 38 saat sonra (evre 7 22) disseke edildi. Sağkalım oranı sürece enjeksiyon miktarı 478 nl altında olduğu gibi yaklaşık% 90 (kontrol embriyolar gibi aynı oran) olarak bulunmuştur.
Bu diseksiyon metodoloji aynı zamanda yüksek kalitede RNA çıkarılması için izin verir. Evre 16 22 embriyolar diseksiyon sonra, bir RNA ekstraksiyon, Şekil 7'de görüldüğü gibi, herhangi bir gerekli optimizasyonu ile üreticinin protokolüne uygun olarak yapıldı. Vitellin membranın kaldırılması RNA ekstraksiyonu ve daha sonra QRT-PCR uygulamalar için gereksizdi.
Not: ön ve arka bölgeleri sırasıyla görüntüleri üstünde ve altında yer almaktadır, böylece tüm embriyo şekiller yönlendirilmiştir.
Şekil 1.. Zebra ispinoz embriyo bulma ve diseksiyon için Prosedürü, 1-10 22 sahneliyor. Soluk beyaz diski (A) açıktır kadar yavaşça sarısı yuvarlayarak embriyo bulun. Bir kezembriyo sarısı merkezinde yer alan, yumurta sarısı ilk kesim (1) ve sonraki kesim (2) hangi kavşağı (ZJ) bölgesini sınır vitellin membran basıncı hafifletir kademeli bir şekilde (B) disseke edilir vitellin membran yapıştırılır. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder.
Vitelline membran ve embriyonik yapıların görünürlük Şekil 2.. Çıkarılması.% 4 PFA ihtiva eden bir Petri kabındaki sarısından embriyonun kaldırılması, yer embriyo ardından. In situ hibridizasyon bir yapılması gerekiyorsa, embriyonik yapıların görüş gereklidir ve vitellin membran (A) çıkarılması ile elde edilebilir. Kavrama ekstra para cezası ile vitellin membran forseps uçlu ve gerekirse hafifçe, dış kenarında doğrudan embriyo işleme göre embriyo uzak soyulması(B). Vitellin membran kaldırma embriyonik yapıların açıklık arttırır ve embriyolar, in situ hibridizasyon (C) ile görüntülenebilir veya işlem sağlar. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3,. Tüm montaj in situ hibridizasyon gelişimsel orthodenticle homeobox 2 (Otx2) of PTWI. Salgılanma modellerini maruz zebra ispinoz embriyolar üzerinde 0.0 ppm PTWI (A, A ') ve 2,4 ppm PTWI (B, B maruz embriyolar karakterize edilmiştir ') ebeveyn diyet yoluyla. Dorsal (A) ve Otx2 ventral (A ') ifadesi Tedavi grubu embriyolar aynı zaman noktasında disseke edildi. kademeli 12 22 sırasında orta beyin ve optik veziküller boyunca görülebilir, ancak gelişimsel (B) dorsal görüldüğü gibi gecikmeli ve sahnede 11 22 Kısaltmalar karakteristik kafa yapıları, ventral (B ') görünümü:. mb, orta beyin; op, optik vezikül. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder.
Şekil 4. Tüm montaj in situ melezleme gelişimsel orthodenticle homeobox 2 (Otx2) ait PTWI. İfade kalıpları maruz zebra finch embriyolar üzerinde sahnede 6 22 Embry karakterize edildi os 0.0 ppm PTWI (A, A ') ve evre 2.4 ppm PTWI (B, B maruz 5 22 embriyolar' ebeveyn diyet yoluyla) maruz. Kısaltmalar: AM, mezodermin ön marjı; hayır, Notokordun, Notokordun mezoderm; po, proamnion, anterior blastopore; ps, ilkel çizgi 22. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder.
Şekil 5,. Tüm yerinde montaj melezleme anlamda prob kullanılarak zebra finch embriyolar üzerinde. (A) Aşama 5 22 embriyo. (B) Erken evre 6. 22 embriyo. (C) Sahne 11 22 embriyo. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder.
6 "src =" / files/ftp_upload/51596/51596fig6highres.jpg "/>
Şekil 6.. Edu kuruluş ve zebra ispinoz embriyolarda de ması. Edu kimyası bir aşamada 16 22 embriyo (A, B, C) çoğalan hücreleri algılamak için kullanılan "tıklayın". Edu timidin 26, 27 yerine DNA içine dahil edilir ve tıklama 27 kimyası kullanılarak tespit edilir. Silahların Yayılmasını Önleme Somitlerin yan kenarları ve tailbud açıkça görülebilir. Panel A embriyonun posterior olarak ortaya çıkan, çoğalmasını gösterir ve aynı zamanda tek tek proliferatif hücrelerini göstermektedir. Panel B tüm embriyo proliferatif konumları gösteriyor. Panel C anterior bölgesini göstermektedir, ve daha detaylı olarak yüksek proliferatif telencephalon (te) göstermektedir. Kısaltmalar: af, amniyotik kat; flb, ön ayakları tomurcuk; hlb, arka bacak tomurcuk; le, lens vesicle sergilemez; ms, mesencephalon; mt, Metencephalon; opc, optik fincan; pa, faringeal kemer; sm, somite mezoderm; tb, tailbud; te, telencephalon. Ölçek çubukları 1 mm temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Parçalara zebra Finch embriyoların. Kontrol (0.0 ppm) ve 1.2 ppm PTWI embriyolardan ekstre RNA Şekil 7. Kalite kesilir ve Aşama 3.8 'de tarif edildiği gibi flaş dondurulmuştur. Her bir şerit, her bir tedavi grubundan iki homojenize embriyolardan ekstre RNA gösterir.
Bir embriyolojik evreleme rehber 22 ve genom açıklama son gelişme zebra ispinoz gelişimsel çalışmalar için arzulanan bir model organizma olun. Ancak aşamalarında 1 3 ila 7 mm arasında zebra ispinoz embriyoların, küçük boyutu ve kırılganlık - 10 22, 11, 14 diseksiyonu zorlaştırabilir. Yerini ve temiz sarısının yüzeyinden embriyoların kaldırarak zor olabilir. Bu protokol kolaylıkla yordamı gerçekleştirmek için yeterli ayrıntı sağlar. Bu protokol, başarılı bir diseksiyon sağlamak için tipik olarak bilinmemektedir, ancak gerekli olan kritik adımlar gösterilmektedir. Örneğin, embriyo ve yapışmasını önlemek için kağıt tartın tabaka arasında sarısı küçük bir tabaka bırakmak için gereklidir.
Embriyonun tanımlanması ve çıkarılması zor hem de olabilir. O sahip sonra sarısının yüzeyinde embriyo belirlenmesi gidermek için, doğrudan yumurta sarısının üzerinde ışık saçıyoryumurta kaldırılır ve embriyo bulmak için bir 45 ° açıyla sarısı bakmak edilmiştir. Embriyo bulunduğu kez, embriyo gözyaşı değil özen kağıdı tartmak sarısı kesti.
Yapıların daha iyi görüntülenmesi için 8 22 - başka uygulamalar da in situ hibridizasyon anatomik farklılıklara, veya hücre proliferasyon deneyleri için görüntüleme dahil, bu aşama 1 'de vitellin membran kaldırmak için önemlidir. Erken aşamalarında sarısı veya vitellin zarı çıkarırken sorun yaşıyorsanız eğer, embriyonik kırılganlığını azaltmak için 1X PBS yıkamadan önce% 4 PFA embriyo düzeltmek. Anlatıldığı gibi birinci diseksiyonu sırasında vitellin membran kaldırarak, yapıları in situ hibridizasyon bir gerçekleştirdikten sonra açıkça zebra ispinoz embriyo görünür ve sağlamdır.
Edu bir sınırlaması embriyonik ölüm 478 nl yol üzerinde dozaj ciltlik bu uygulanmasıdır. Ancak, geniş doz aralığı varyin sağlarproliferatif hücre etiketleme g seviyeleri.
Bu kitte kullanılan "tık" tepki Bakır (I)-katalize-Alkin-Azit-siklokatılma (Cu (I) AAC) 'dir. Bu özel reaksiyonda, bir alkin-timidin içeren analog bir molekül (EGT) aktif olarak bölünen hücreler ile bu buluşa katılmıştır. Edu içindeki alkin grubu, DNA'nın sarmal çıkıntı yapısından ve serbest alkin grubuna bağlanan, yeşil floresan molekülüne konjuge edilmiş bir azid moleküle maruz bırakılarak tespit edilir. Yeşil floresan embriyoda yeni çoğalan hücreleri gösterir. Bu reaktif türler organizmada doğal olarak mevcut değildir, çünkü azid biyo-diklik ve alkin grupları özel olmayan lekelenme engeller. DNA ortaya reaksiyon için sırayla denatüre olması gerekmez, çünkü aynı zamanda, bundan başka DNA'ya bağımlı analizi kolayca gerçekleştirilebilir 27 olabilir.
Bu yöntemin bir içsel sınırlılığı, küçük boyutlu ve parçaları kullanılmıştır olduğuzebra ispinoz embriyoların ility. Dikkatli yapılmadıysa 15 22 zararlı embriyonik yapıların neden olabilir - embriyoların vitellin membran Çıkarma 1. aşamaları. Ancak, bu protokol, araştırmacılar daha önceden derinlemesine incelenmemiştir yapısal anomaliler ve gen ifadesini incelemek için erken embriyonik aşamalarında kullanmak için izin, diseksiyon yöntemini kolaylaştırır. Bu protokol, araştırmacılar yetişkin fenotipleri gelişimsel kökenlerini belirlemek sağlayacak hücresel-moleküler deneyleri bir bolluk için yolu açar. Örneğin, gen ifadesi çeşitli çevre koşullarında vokal öğrenme karıştığı veya geliştirme 28, 29,30,31 ve erken aşamalarında farmakolojik tedavi aşağıdaki incelemek mümkün olacaktır. Bu çalışmada gösterilememiştir rağmen, bu metot potansiyel zebra ispinoz doku bölümleri ve elektroporasyon / ov situ hibridizasyon gibi radyoaktif gibi diğer işlemler için izin veriro cerrahi 32, 33,34. Zebra ispinoz edebiyatının bir büyük gövdesi içinde önemli bir model organizma olarak kurulmuş olduğu göz önüne alındığında, bu tür çalışmalar, yetişkin fizyolojisi ve davranışları ile gelişim mekanizmalarını bağlantı dilinde 7, 9 özellikle geliştirme kullanılmayan fırsatlar sağlar.
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Yazarlar kendi finansman kaynaklarını, William ve Mary Koleji Howard Hughes Tıp Enstitüsü Lisans Fen Eğitimi Programı teşekkür ediyorum; Hibe sponsoru: NIH (MSS); Hibe numarası: R15NS067566. Onlar da hayvan bakımı ile ilgili yardım için Fen William ve Mary Koleji, Biyoloji Bölümü ve College destek için minnettarım.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
Ethanol (EtOH) | |||
50 ml Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
Microcentrifuge eppe tube (1.5 ml) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
Modeling Clay | Any brand | ||
Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 ml 8% PFA (32 g paraformaldehyde, 350 ml sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400 ml sdd H2O), 20 ml 2x PBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
Phosphate buffered saline (1x PBS): 200 ml 10x PBS, 1,800 ml Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
Phosphate buffered saline (10x PBS): 800 ml Barnstead, 2.013 g KCL, 80.063 g NaCl, 2.722 g KH2PO4 monobasic, 14.196 g Na2HPO4 dibasic, 200 ml Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1x PTw): 1,800 ml Barnstead H2O, 200 ml 10x PBS, adjust pH to 7.4, 2 ml Tween-20 | |||
35 ml Plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
plastic wrap | Any brand | ||
Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Reaction Mix: 875 μl 1xPBS, 100 mM 20 μl CuSO4 (Kit Component E), 5 μl Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100 μl diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
sdd H2O | |||
Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
Stainless steel scalpel | |||
Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
4 ml, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
4 x 4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır