İlköğretim Fare Osteoblastlar gelen osteositlere Kültürler Edinme Retinoik Asit Uygulama

Retinoik asit ile osteoblastların primer fare tedavisi kemik hücresinin morfolojik ve moleküler özellikler taşıyan dallanmış homojen bir hücreler popülasyonu üretir. Yöntem, elde edilmesi ve kültürü birincil kemik hücresinin korumanın zorluğu üstesinden gelir ve transjenik modelleri türetilen hücreler çalışma avantajlı olabilir.

Osteosit kültürleri için olan ihtiyaç iyi kemik araştırmacıların eden bilinmektedir; Birincil osteositlere izolasyonu zordur ve düşük hücre sayıları üretmektedir. Bu nedenle, en yaygın olarak kullanılan hücre sistemi osteosit benzeri MLO-Y4 bir hücre hattıdır.

Burada tarif edilen yöntem, morfolojik ve moleküler osteosit özelliklere sahip dallanmış homojen bir hücreler popülasyonunu üretmek üzere retinoik asidin kullanılması anlamına gelir.

Fare kafatası alınan osteoblastların izole edildikten sonra, bütün-trans retinoik asit (ATRA) hücre ortamına ilave edilir ve hücre izleme ters döndürülmüş bir mikroskop altında her gün yapılır. Üretim morfolojik değişimler tedavi ve farklılaşma 2 gün sonra tespit edilebilir dendrit hücre dışı matrisi üretme yeteneği kaybı, osteoblast belirteçlerin aşağı-regülasyonu ve ilerleyici gelişmesiyle birlikte, 5 gün içinde tamamlanır yukarı-regülasyonu osteosit özgü moleküllerin. içeriği "> günlük hücre izlenmesi için birincil hücrelerin doğal değişkenlik gereklidir ve protokol, farklı fare türlerinden elde edilen ve transjenik modelleri uygulanan hücrelere, minimal değişiklik gösteren uyarlanabilir.

Yöntem, gerçekleştirilmesi kolaydır ve özel aletler gerektirmez, bu yüksek oranda tekrarlanabilir olduğunu ve hızlı bir şekilde sınırsız biyolojik uygulamalarda bu hücrelerin kullanımına izin veren, hücre dışı matrisin tam yokluğunda olgun osteosit nüfus oluşturur.

Kemik hücresinin, en bol kemik hücre tipi, derin iskeleti içinde yer alan büyük ölçüde dallanmış hücreler, terminal olarak farklılaşmış bulunmaktadır. Olgun osteositler ait hücre vücut kemik boşluklar içerdiği ve çeşitli şekillere sahip olan; yuvarlak osteositlerde trabeküler kemikte ¹ daha sık iken uzun hücre organları ile osteositlerde, kortikal kemik bulunur. Dallı dendritler diğer kemik hücresinin ile değil, aynı zamanda diğer kemik hücre türleri, kemik iliği, kan damarları ve ilgili perisitlerin ile sadece birden fazla kişi karmaşık hale getiren bir ağ-yapının oluşturulması, kanalcığı adı verilen küçük kanallarda hücre gövdesinden uzanan ve bulunur. Boşluklar ve kanalcık içerdiği interstisyel sıvının sayesinde, osteositler nedenle lokal hem de sistemik etkinlik, ya da tam tersi davranışları hem lokal hem de sistemik değişikliklerle ² ile kontrol edilebilir, sadece etkileyebilir, aynı zamanda sonuçta dolaşım sistemine bağlanmıştır.

kemik hücresinin çalışması son zamanlarda, bu tür doku-ve hücreye özel transgenik hayvanların üretimi, güçlü mikroskopi teknikleri ve yüksek verimli tarama moleküler ^3,4 kullanımı gibi çeşitli teknik ilerlemeler, sayesinde ivme kazanmıştır. Bununla birlikte, bu hücrelerin bilgisi esas olarak vitro modellerde yeterli göreli azlığı, yine eksik. Aslında osteositlerde nedeniyle derin konumu elde etmek ve kültür korumak için her zaman zor olmuştur, ve böyle bir farklılaşmış hücre tipini karakterize çoğalma düşük seviye var.

Genellikle düşük verimli olduğu hücre ve hatta birkaç kirletici fibroblast hızla osteositler ⁸ büyümek doyurmaya riski taşıyan da yıllar boyunca, bir dizi yöntem, birincil kemik hücresinin ^5-7 izole etmek için geliştirilmiştir. Bu nedenle, in vitro çalışmalarında en deneysel köklü osteosit hücre l hakkında şu ana kadar yapılmıştırine MLO-Y4 ^9.

Ek in vitro metodolojiler bu hücreleri okuyan olasılığını artırabilir ve osteosit biyoloji ve patofizyolojinin analizini artırabilirsiniz. Büyük ölçüde kabul edilmesi, bu tür yöntemler çoğaltmak kolay olmalı ve hücre olgunlaşmasını ulaşmak için özel aletler ya da çok uzun bir süre gerektirecektir olmaz. Birincil hücreleri varsa da önemlisi, bu mümkün transgenik hayvanların yararlanmak olur. Yakın zamanda osteoblast hücre hattı MC3T3-E1 ve retinoik asit ile tedavi, birincil osteoblastların osteositler ¹⁰ morfolojik ve moleküler özellikler taşıyan dallanmış homojen bir hücreler nüfus gelişimine yol açan hızlı bir fenotip değişikliklerini oluşturmaktadır anlatılmıştır.

All-trans retinoik asit (ATRA), nükleer retinoik asit reseptörleri (RAR'lar) bağlanmak suretiyle gen transkripsiyonunu düzenler A vitamini aktif bir metabolizma ürünüdür. RAR'larsonuçta retinoik asit (RA)-duyarlı hedef genler ¹¹ modülasyonu yol açan, retinoid X reseptörleri (RXR'ler) ile heterodimerler olarak DNA'ya bağlanır. ATRA gibi nöronal hücre ¹² ve ¹³ gibi diğer podocytes dallanmış hücreler, aralarında, çeşitli hücre tiplerinin farklılaşmasını ve olgunlaşmasını modüle ettiği gösterilmiştir.

Burada tarif edilen yöntem, birincil osteoblastların için ATRA eklenmesi dayanmaktadır. Etkili olmak için, ATRA tanımlanmış bir yoğunlukta kaplama hücreleri üzerinde kesin bir olgunlaşma safhasında ilave edilmesi gerekir; deneyimlerimiz bu koşullar osteoblast gelen osteositlere için fenotip anahtarını elde etmek için önemlidir.

Tüm hayvan deneyleri Ulusal ve bilimsel amaçlar için kullanılan ve inceledim ve Milano Üniversitesi etik komitesi tarafından onaylanmış hayvanların korunmasına ilişkin Avrupa yürürlükteki mevzuata göre yapılmıştır.

İlköğretim Osteoblastlar 1. İzolasyon

Bir yöntem olup, küçük bir modifikasyonla, Dodig ve arkadaşları ¹⁴ tarafından tarif edilen prosedür takip eder.

1. % 0.1 kollajenaz P ve% 0.05 ekleyerek, orta sindirilmesi hazırlayın HBSS ortamı (Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi, herhangi bir kalsiyum, magnezyum, ya da fenol kırmızı) için (% 2.5 tripsin 10X, fenol kırmızı başlayarak) tripsin.
2. 3-4 gün eski fareler kullanın (prosedür 1 fare gibi kaç uygulanabilir).
3. Başları kesilerek kurban. % 70 etanol ile baş Sprey ve buz üzerinde tutmak. Cımbız ve diseksiyon / cerrahi makas ile deri ve kas tabakaları çıkarın.
4. Yavaşça parietal kemikleri kaldırmak veiki devrede de gol sagital sütür izleyerek onları ayrı. Emin kemikleri sütür ve herhangi yapışık doku ücretsiz yapmak ve prosedür tamamlanana kadar HBSS ortamı içeren plakalarda bireysel kemik parçaları yerleştirin.
5. HBSS atın ve her bir ekle 37 ° C de 15 dakika boyunca ortam sindirerek
6. Süpernatant atın.
7. Tekrar 37 ° C'de 15 dakika boyunca orta sindirerek ekleme
8. Bu kez süpernatan kaydetmek ve% 10 FBS (Fetal Sığır Serumu) ve% 1 streptomisin / penisilin ile desteklenmiş a-MEM (Minimum Essential Medium) yerleştirin.
9. Tekrar 1.7 ve 1.8 2x adımları.
10. 5 dakika boyunca 425 g'de santrifüj ile üç toplanan fraksiyonları, spin hücreleri havuzda toplayın, süpernatantı atmak hücre pelletini için katkılı a-MEM içinde 3 ml ekleyin ve transferi 25 ^cm2 şişeye.
11. Enkaz ve ölü hücreleri çıkarmak için, 24 saat sonra ortam değiştirin.
12. 50 ug / ml, askorbik asit (AA) ve gly 3 mM eklemegliserin 2-fosfat disodyum tuzu, alfa-MEM ortamına hidrat (GP).
13. Bundan sonra, her gün (alfa-MEM artı AA / GP) orta değiştirmek.

2.. ATRA Protokol

1. Etkisiz hale getirilmesini önlemek için, karanlık bir odada ATRA (all-trans retinoik asit) tüm deneyler.
2. HBSS ortamı içinde, 1X Tripsin çözeltisi hazırlandı ve kullanılana kadar 37 ° C'de tutun.
3. Birlikte akan hücreler arasındaki orta çıkarın ve dikkatli bir şekilde HBSS ile yıkayınız.
4. 1 ml tripsin ekleyin, yavaşça tüm hücreler, tripsin ile kaplı izin vermek için şişeyi döndürmek ve 37 ° C'de 3 dakika boyunca inkübe
5. Bir ters mikroskop altında hücre gerçek ayrılması için kontrol edin.
6. Tripsin inaktive alfa-MEM ortam maddesi 3 ml ilave edilir.
7. Hücreleri yeniden elde etmek ve 425 g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
8. Taze ortam içinde hücre pelletini.
9. Bir hemositometre sayım odasında bir damla yerleştirin, birkaç dakika boyunca yerleşmek için izin ve ce saymakll numarası.
10. 10,000 hücre / alfa-MEM plus AA / GP ile ² cm 'lik bir yoğunlukta 25 ^cm2 şişelerde yer hücreler. Hücre yoğunluğu hücre süreçlerinin ve hücreler arası temasların optimum gelişimi ile ilgili olduğunu unutmayın. Bir başlangıç ​​yoğunluğu daha yüksek 10,000 hücre / cm ² hücre süreçlerini uygun gelişimine zarar, ancak daha düşük hücre sayıları nedeniyle arası temasların olmadığı için, prematüre hücre ölümüne neden olabilir.
11. Her 24 saat ortama 5 uM ATRA ekleyin.
12. Morfolojik değişiklikler genellikle 48 saat sonra gözlenir: morfolojisini değerlendirmek için günlük hücreleri izleyin. Ilk 24-48 saat sonra, hücreler hala çoğaldığında,, yukarıdaki yoğunlukta replate. Olgun osteositler homojen bir popülasyon 4-5 gün sonra da rastlanmaktadır. Ihtiyaçlarına bağlı olarak, 12-15 gün öncesine kadar, herhangi bir zaman noktasında hücreleri kullanır.
13. Hücreleri (örneğin lamelleri ya da plakalar gibi) başka destekler üzerine plakalanır edildiği zaman, yukarıda yoğunluğu muhafaza emin olmak vekullanıma kadar ATRA her 24 saatte eklemeye devam. Deneyden önce en az 24 saat boyunca yeni destek uymak hücreleri bırakın.

3. İmmünoboyama

1. Immün için, lamelleri hücreleri plaka ve (Burry ¹⁵ örneğin bakınız) kuruldu metodolojileri izleyin.
2. Örneğin dolaylı immünofloresans için, 30 dakika boyunca, oda sıcaklığında, karanlıkta, ikincil floresan etiketli antikor ile daha sonra, nemli bir bölmede 1 saat boyunca oda sıcaklığında primer antikor ile inkübe sekans,% 4 paraformaldehit veya soğuk aseton içinde çözmek nemlendirilmiş bir odada.
3. Nükleer counterstaining için DAPI veya analogları kullanın ve orta anti-solmaya montaj.

4. Alizarin Red Boyama ve Ekstraksiyon

1. Lamelleri hücreleri plaka.
2. 10 dakika boyunca% 70 etanol içinde lamel içine daldırarak hücreleri sabitleyin.
3. Alizarin kırmızı boyama çözeltisi bir damla (1 mg / ml, pH 5.5) ile hücrelerin Kapak30 dakika karıştırıldı.
4. Musluk suyu ile lamelleri yıkayın. Cam slaytlar gliserol bir damla ile montaj ve dik bir 10X olarak mikroskop ve 20X büyütme ile görüntü alabilir.
5. Yukarıdaki prosedür sonra, musluk suyu içindeki slaytlar daldırarak lamelleri geri.
6. Bir oyuklu bir plaka içerisinde her bir lamel koyun.
7. % 60 perklorik asit (miktar tamamen hücreleri karşılamak için yeterli olması gerekir) ekleyin ve hafif çalkalama ile 4 ° C'de O / N bırakın.
8. 450 nm dalga boyunda spektrofotometri ile süpernatantın optik yoğunluk okuyun.
9. Hücre sayısı değerlerini normalize etmek için, 10 dakika boyunca bir hücre preparatının kapsayacak şekilde Janus Green (PBS içinde% 0.2 çözelti) ekleyin.
10. Ultra-saf su ile dikkatlice yıkanır.
11. 0.5 N HCI (miktar tüm hücreleri karşılamak için yeterli olması gerekir) ekleyin ve bir kaç saniye boyunca elle hafifçe çalkalanır.
12. Spektrofotometre ile 615 nm'de emicilik ile oku.

Sonuçlar 5 ila 10 bağımsız deneyler için kullanılmıştır.

Hücre Morfoloji

AA / GP birincil hücreler çoğunlukla arnavut kaldırımı gibi özellikler, olgun osteoblastlar özelliği var tedavi. Serpiştirilmiş dallanmış hücreleri (Şekil 1A kırmızı oklarla gösterildiği gibi) büyük olasılıkla bir kemik hücresinin temsil ettiği, bulunabilir.

ATRA tedavisi ile, hücreler hızla genellikle 2 gün sonra gözlenen etkileri, görüntülemeye başlayın. Şekil 1B 'de gösterildiği üzere, dallanmış hücreler, dendrit genişletmek alanı gerektirir. ATRA gelirleri ile tedavi olarak, etkileri giderek sayısı ve karmaşıklığı artırmak, 1C ve 1D Rakamlar. Rodamin etiketli Phalloidin ile ipliksi aktin lekelenmesi falloidin, Şekil 2 ile etiketlenir hücre süreçleri vurgulamaktadır.

Matrix Üretimi

İlköğretim osteoblastlar üzerinde ve hücreleri arasında birikir ve kırmızı lekelenme, Şekil 3A alizarin tarafından görülebilmesi kalsifiye matriks, büyük miktarlarda üretmek. Osteositler kalsifiye hücre dışı matrisi üretmek ve ATRA-inkübe edilen hücrelerde, Şekil 3B'de tamamen negatif alizarin kırmızı boyama sonuçları yoktur. Bu duruma göre, alizarin kırmızı hiçbiri veya düşük bir miktar çıkarma prosedürü, Şekil 3C'de sonra ölçülebilir.

Osteosit İşaretleyiciler ve Ürünleri

Sklerostin ATRA ile muamele edilmiş hücreler tarafından ifade edilmektedir, Şekil 4,. Immün yoğun sitoplazmik ifadesi ve hücre süreçlerinin boyunca pozitif nokta varlığını ortaya koymaktadır. Immünofloresan ile, güçlü bir FGF23 pozitif hücre gövdesinde ya da hücre süreçleri boyunca da, ATRA ile muamele edilmiş hücreler, Şekil 5 'de tespit edilebilir.

er.within-page = "always">
Şekil 1. Işık mikroskopisi. Primer osteoblastlar AA / GP (A) (ölçek çubuğu 100 um) ile birlikte 5 gün inkübasyondan sonra, bir baskın kübik bir görünüm gösterir. Seyrek dallanmış hücreler (A), (oklar) tespit edilebilir. ATRA tedavi (B) (ölçek çubuğu 100 um) 2 gün sonra, hücreler daha uzun bir şekle görüntü ve dendrit açıkça tespit görünür. Sadece arborized hücreler ATRA inkübasyon (C) (ölçek çubuğu 100 mikron) 5 gün sonra görülen ve yüksek büyütme (D) (ölçek çubuğu 50 mikron) daha iyi saptanabilir olabilir.

jpg "src =" / files/ftp_upload/51465/51465fig2.jpg "/>
Şekil 2,. Actin filament boyama. Aktin filamanlar Rhodamine-falloidin lekeleme ile tespit edilir. Şekil 3, gün boyunca ATRA ile muamele edilen hücrelerden elde edilen temsili bir sonuç göstermektedir. Zaten bu zaman noktasında, lifli aktin hücre süreçlerini geliştirmek önemli bir bileşeni olarak görülmektedir. Ölçek çubuğu: 50 mikron.

Şekil 3.. Calcified mevduat. ATRA-bekletilen hücreler (B) (ölçek çubuğu 50 mikron) negatif ise Alizarin kırmızısı boyama diffüz, AA / GP (A) (ölçek çubuğu 100 mikron) ile 5 gün inkübasyondan sonra osteoblastlarda görülmektedir. Bir derin bir fark SPECT ile ölçülebilirroscopy alizarin ekstraksiyon (C) sonra.

Şekil 4.. Sklerostin. Sklerostin pozitifliği siloplazmasında ve ATRA (ölçek çubuğu 50 mikron) ile inkübe hücreleri hücre süreçlerinin birlikte tespit edilir.

Şekil 5.. FGF23. FGF23 İmmünbüyanmanın ATRA ile tedavi edilen hücreler (ölçek çubuğu 50 mikron) yoğun.

Son yıllarda osteosit kemiğin en merkezi hücre olarak ortaya çıkmıştır. Araştırma gelişmeler kademeli kemik hastalıklarının çeşitli için yeni ve daha iyi tedavi tasarımı için çok büyük bir değer olan, daha önce ya da umulmadık kanıtlanmamış osteosit özellikleri, bir çok açıklayıcıdır. Bununla birlikte, osteosit biyoloji araştırılması osteosit benzeri hücre hattı MLO-Y4 yayınlanmadan önce osteoblastlar, uzun bir süre boyunca taşıyıcı hücre olarak kullanılmış olduğu bir düzeye kadar in vitro modellerin sınırlı sayıda acı edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, bir şartlı ölümsüzleştirdi hücre hattı sklerostin ve FGF23 ifade geç osteositlere alt başlıklarında farklılaşmış olabilir aynı grup ¹⁶ tarafından tanıtıldı. Bu hücre çizgilerinin uç değerler söz altında olmasa da, bu çok iyi bir birincil hücreler daha fazla in vivo durumu benzer ve birinci osteositler fr elde etme ihtimalini sunmaktadır bilinmektedirom transgenik hayvanlar spesifik moleküler yolları üzerinde fonksiyonel çalışmalar yapmak.

İzolasyon ve ^5,6 ve daha sonra ilk olarak sıçan ve fare kemik ^17,7 ikinci civciv kemiklerden elde edilen primer kemik hücresinin, kültür, son derece yararlıdır ancak izolasyon prosedürüne uygun hücrelerin sadece küçük bir sayı üretir ve hücre saflık büyük ölçüde dayanır bireysel uzmanlık. Bu nedenle, yöntem, şu anda sadece sınırlı laboratuarlarda sayısına göre kullanılır.

Diğer araştırma grupları daha fizyolojik bir ortam oluşturduğunu, ancak daha sonraki araştırma uygulamaları için bir engel olan üç boyutlu mineralize matrisler ^18,19, ilerici gömme yoluyla osteoblast terminal farklılaşmasını uyararak olgun osteositlere almış. Bu matris mineralizasyon ^20, hem de düşük oksijen basıncı ²¹ osteositlerin olgunlaşma fizyolojik tetikleyiciler olduğu doğrudur. Ancak, bir araya geldihodology bu iki koşul kaçınarak fizibilitesini artırmak ve hücrelerin kullanımını genişletmek olabilir. Osteoblastlar olgun retinoik asit ilave oluşur Bizim Önerilen yöntem, ^10, basit, yüksek tekrarlanabilir olduğunu ve hücre transfeksiyonu ²² ya da pahalı büyüme faktörleri kullanımı ²³ önler.

Ön deneylerde, bir dizi ile, Başlangıç ​​hücre sayısı birden dendritler ve hücreler arası temasların kritik bir adım, klima doğru oluşumu olduğu belirlenmiştir. Çok düşük sayılar arası yapışıklıklar kaybına neden ise bir çok yüksek kaplama hücre yoğunluğu hücre acı ve ölüme, karmaşıklığı ve hücre süreçlerinin uzantısı etkiler.

Önemli olarak, ATRA dozaj ve hücre morfolojisi günlük izleme ayarlama yüksek, çünkü ATRA'ya karşı hassasiyetini etkileyebilir birincil hücrelerin doğal değişkenlik, tavsiye edilir. Bu açıdan özellikle ilgili whe olabilirn metodoloji transjenik modelleri uygulanır.

Dendritler lifli aktin açısından zengin olduğu için, hücre işlemlerinin geliştirilmesi, aktin boyama ile izlenebilir.

Biliyorsunuz osteositlerde kireçlenmiş matris üretmek olmadığı bilinmektedir ve alizarin kırmızı boyanması tam olumsuzluk kadar ilerleyici azalma ile gösterildiği gibi ATRA inkübasyon hızla, onu ortadan kaldırmaktadır edilir. Bu arada, ATRA özellikle ²⁴ sklerostin iyi bilinen osteosit belirteçleri ekspresyonunu indükler ve FGF23, kemik ve ²⁵ taşıma sistemik fosfat ile ilgili bir temel büyüme faktörünün üretimini sağlar. Bu nedenle, osteositlere FGF23 ve sklerostine işlevsel rolünü araştırmak, ileri çalışmalar bu moleküllerin endojen üretimi ile sağlanacaktır.

Özet olarak, retinoik asit ile tedavi, birincil kalvaryal hücrelerden olgun osteositler homojen bir popülasyon olduğunu göstermektedir oluşturur,yabani tipteki ve transjenik hayvanlar hem de kemik hücresinin, basit ve hızlı bir şekilde hazırlanmasına imkan veren refore. Diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, protokol çeşitli avantajlar, esas olarak basit bir uygulama ve yüksek tekrarlanabilirliği mevcut görünmektedir. Osteosit olgunlaşma süreci 5 günlük bir çerçeve içinde meydana gelen çok sayıda adımları süreçlerin yayılmasını ilk gelen hücrelerinin yeterli sayıda incelenebilir. İlave bir avantaj olarak, olgun osteositler sınırsız moleküler ve fonksiyonel testlerin uygulanmasını sağlayan, mineralize matris çevreleyen tam yokluğunda elde edilir.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Finansman "Progetto bir Concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" MD, ve Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano tarafından sağlandı