Application de l'acide rétinoïque pour obtenir des cultures de ostéocytes de primaires ostéoblastes de souris

Traitement des ostéoblastes primaires de souris avec de l'acide rétinoïque produit une population homogène de cellules ramifiés portant des caractères morphologiques et moléculaires des ostéocytes. La méthode permet de surmonter la difficulté d'obtenir et de maintenir ostéocytes primaires en culture, et peut être avantageux d'étudier les cellules dérivées de modèles transgéniques.

La nécessité pour les cultures de ostéocytes est bien connu de la communauté des chercheurs d'os; isolement des ostéocytes primaire est difficile et produit un faible nombre de cellules. Par conséquent, le système cellulaire le plus largement utilisé est la lignée de cellules ostéocytes MLO-Y4-like.

Le procédé décrit ici se réfère à l'utilisation de l'acide rétinoïque pour générer une population homogène de cellules ramifiées ayant des caractéristiques morphologiques et moléculaires ostéocytes.

Après isolement des ostéoblastes à partir de calvaria de souris, de l'acide tout-trans rétinoïque (ATRA) est ajouté au milieu de la cellule, et la surveillance de la cellule est réalisée tous les jours sous un microscope inversé. Premiers changements morphologiques sont détectables au bout de 2 jours de traitement et la différenciation est généralement complète en 5 jours, avec le développement progressif de dendrites, la perte de la capacité de produire la matrice extracellulaire, la régulation des marqueurs des ostéoblastes et la régulation des molécules spécifiques ostéocytes. contenu "> le suivi des cellules quotidien est nécessaire en raison de la variabilité inhérente de cellules primaires, et le protocole peut être adapté avec une variation minime de cellules obtenues à partir de différentes souches de souris et appliquées à des modèles transgéniques.

Le procédé est facile à réaliser et ne nécessite pas d'instruments spéciaux, il est hautement reproductible, et génère rapidement une population d'ostéocytes matures en absence totale de matrice extracellulaire, ce qui permet l'utilisation de ces cellules pour des applications biologiques illimitées.

Les ostéocytes, le type de cellules osseuses les plus abondants, sont définitivement différenciés, les cellules hautement ramifiés profondément situés à l'intérieur du squelette. Le corps de la cellule de ostéocytes matures sont contenues dans les lacunes de l'os et avoir des formes diverses; ostéocytes avec les corps cellulaires allongées sont trouvés dans l'os cortical, alors que les ostéocytes arrondis sont plus fréquents dans l'os trabéculaire ^1. Dendrites ramifiées s'étendent à partir du corps cellulaire et résident dans les canaux minuscules appelés canalicules, formant un réseau complexe qui fait plusieurs contacts non seulement avec d'autres ostéocytes, mais aussi avec d'autres types de cellules de l'os, la moelle osseuse, les vaisseaux sanguins et les péricytes associés. Par l'intermédiaire du liquide interstitiel contenu dans les lacunes et les canalicules, ostéocytes sont aussi en fin de compte connecté au système de circulation, ils peuvent donc influencer non seulement local, mais aussi les événements systémiques, et inversement leur comportement peut être régulée par les deux changements locaux et systémiques ^2.

Laétude des ostéocytes a récemment pris de l'ampleur, grâce à plusieurs avancées techniques, telles que la génération de tissus-et des animaux transgéniques spécifiques des cellules, l'utilisation de techniques de microscopie puissants et de criblage moléculaire à haut débit ^3,4. Cependant, la connaissance de ces cellules est encore incomplet, principalement en raison de la rareté relative des adéquate dans les modèles in vitro. En fait, les ostéocytes ont toujours été difficiles à obtenir et maintenir en culture en raison de l'emplacement de profondeur, et le faible niveau de la prolifération qui caractérise un tel type de cellule différenciée.

Au fil des années, un certain nombre de méthodes ont été développées pour isoler ostéocytes primaire ^5-7, si elles produisent généralement des rendements de cellules faibles et comportent le risque que même quelques fibroblastes contaminants seront rapidement envahir le ostéocytes ^8. Pour cette raison, le plus expérimental travaux in vitro ont été menées jusqu'à présent sur ​​la cellule de l ostéocyte bien établieine MLO-Y4 ^9.

Méthodologies complémentaires in vitro pourraient améliorer la possibilité d'étudier ces cellules et pourraient améliorer l'analyse des ostéocytes biologie et la physiopathologie. Pour être largement adoptées, ces méthodes doivent être faciles à reproduire, et ne requièrent pas d'instruments spéciaux ou très longs pour atteindre la maturation des cellules. Fait important, le cas échéant à des cellules primaires, ils rendraient possible de tirer parti des animaux transgéniques. Nous avons récemment décrit que le traitement de la lignée cellulaire ostéoblastique MC3T3-E1 et des ostéoblastes primaires avec l'acide rétinoïque induit un changement phénotypique rapide conduisant à l'élaboration d'une population homogène de cellules ramifiés portant des caractères morphologiques et moléculaires des ostéocytes ^10.

Tout-trans acide rétinoïque (ATRA) est un produit métabolique actif de la vitamine A, qui régule la transcription des gènes par les récepteurs nucléaires de l'acide rétinoïque (RAR) de liaison. RARlier à l'ADN comme hétérodimères avec les récepteurs X des rétinoïdes (RXR), conduisant finalement à la modulation de l'acide rétinoïque (RA) sensible gènes cibles ^11. ATRA a été montré pour moduler la différenciation et la maturation de plusieurs types cellulaires, parmi lesquels d'autres cellules ramifiées telles que des cellules neuronales ¹² et ¹³ podocytes.

Le procédé décrit ici est basé sur l'addition d'ATRA en ostéoblastes primaires. Pour être efficace, l'ATRA doit être ajoutée à un stade précis de maturation sur les cellules ensemencées à une densité définie; dans notre expérience, ces conditions sont essentielles pour obtenir le commutateur de phénotype de ostéoblastes ostéocytes.

Toutes les expériences animales ont été réalisées selon la réglementation en vigueur européennes concernant la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et ont été examinés et approuvés par le comité d'éthique de l'Université de Milan et national.

Une. Isolement des ostéoblastes primaires

Le procédé, avec des modifications mineures, suit le mode opératoire décrit par ¹⁴ Dodig et al.

1. Préparer digérer milieu, par addition de 0,1% de collagénase P et 0,05% de trypsine (à partir de 2,5% de trypsine 10X, sans rouge de phénol) de milieu HBSS (solution saline équilibrée de Hanks, pas de calcium, de magnésium, ou du rouge de phénol).
2. Utiliser des souris âgées de 3 à 4 jours (la procédure peut être appliquée à aussi peu que 1 souris).
3. Sacrifiez par décapitation. Vaporiser la tête avec 70% d'éthanol et de garder sur la glace. Enlever les couches de la peau et des muscles par une pince à épiler et dissection / ciseaux chirurgicaux.
4. Retirez délicatement les os pariétaux etséparer par la suite de la suture sagittale en deux moitiés. Assurez-vous que les os sont libres de sutures et tous les tissus adhérents et placer des morceaux d'os individuels et des plaques contenant du milieu HBSS jusqu'à ce que la procédure est terminée.
5. Jeter HBSS et ajouter dans chaque puits moyen digérer pendant 15 min à 37 ° C.
6. Jeter le surnageant.
7. Ajouter à nouveau le milieu à digérer pendant 15 minutes à 37 ° C.
8. Cette fois sauver le surnageant et le placer dans l'alpha-MEM (milieu essentiel minimum) complété avec 10% de FBS (sérum bovin fœtal) et 1% de la streptomycine / pénicilline.
9. Répétez les étapes 1.7 et 1.8 2x.
10. Mettre en commun les trois fractions recueillies, les cellules de spin par centrifugation à 425 g pendant 5 minutes, jeter le surnageant, ajouter 3 ml d'alpha-MEM supplémenté pour remettre en suspension le culot de cellules, et le transfert à un ballon de 25 ² cm.
11. Changer le milieu après 24 heures pour enlever les débris et les cellules mortes.
12. Ajouter 50 pg / ml d'acide ascorbique (AA) et 3 mM glyCerol 2-phosphate de l'hydrate de sel de disodium (GP) dans le milieu alpha-MEM.
13. Par la suite, changer le milieu (alpha-MEM ainsi que AA / GP) tous les deux jours.

2. Protocole ATRA

1. Effectuer toutes les expériences à l'ATRA (all-trans acide rétinoïque) dans une pièce sombre pour éviter l'inactivation.
2. Préparer une solution de trypsine 1X dans un milieu HBSS et maintenir à 37 ° C jusqu'à utilisation.
3. Retirez le support de cellules confluentes et soigneusement les laver avec du HBSS.
4. Ajouter 1 ml de trypsine, tourner doucement le flacon pour permettre toutes les cellules à être couverts par la trypsine, et incuber pendant 3 min à 37 ° C.
5. Vérifiez le détachement réel de cellules sous un microscope inversé.
6. Ajouter 3 ml de milieu alpha-MEM pour inactiver la trypsine.
7. Récupérer les cellules et centrifuger pendant 15 min à 425 g.
8. Remettre en suspension le culot cellulaire dans du milieu frais.
9. Déposer une goutte dans une chambre hématimètre de comptage, laisser reposer pendant quelques minutes et de compter le CEnombre de ll.
10. La place des cellules en flacons de 25 ^cm2 à une densité de 10 000 cellules / cm ² avec des alpha-MEM ainsi que AA / GP. Soyez conscient que la densité cellulaire est pertinent pour le développement optimal des processus cellulaires et des contacts intercellulaires. Une densité de départ supérieur à 10 000 cellules / cm ² compromet le bon développement de processus cellulaires, mais les nombres de cellules plus faibles entraînent la mort prématurée des cellules, en raison de l'absence de contacts intercellulaires.
11. Ajouter 5 uM ATRA au milieu toutes les 24 heures.
12. Surveiller les cellules quotidien pour évaluer la morphologie: changements morphologiques sont généralement observés après 48 heures. Si, après le 24-48 premières heures, les cellules sont encore prolifèrent, Réensemencement à la densité ci-dessus. Une population homogène de ostéocytes mature est présente au bout de 4-5 jours. Selon les besoins, utiliser des cellules à tout point dans le temps, à 12-15 jours.
13. Lorsque les cellules sont étalées sur d'autres supports (tels que des lamelles ou le bien-plaques), assurez-vous que la densité ci-dessus est maintenue etcontinuer à ajouter ATRA toutes les 24 heures jusqu'à utilisation. Laisser les cellules d'adhérer à la nouvelle prise en charge pendant au moins 24 heures avant l'expérience.

3. Immunocoloration

1. Pour immunologique, plaquer les cellules sur des lamelles et suivre les méthodes établies (voir par exemple Burry ^15).
2. Par exemple, pour l'immunofluorescence indirecte, fixer dans du paraformaldéhyde 4% à froid ou de l'acétone, de manière séquentielle incuber avec l'anticorps primaire à température ambiante pendant 1 heure dans une chambre humidifiée, puis avec l'anticorps secondaire marqué par fluorescence dans l'obscurité, à température ambiante pendant 30 min, dans une chambre humidifiée.
3. Utilisez DAPI ou analogues pour contre-coloration nucléaire, et monter dans le milieu anti-décoloration.

4. Alizarine Rouge coloration et Extraction

1. Plaquer les cellules sur des lamelles.
2. Fixer les cellules par immersion de la lamelle couvre-objet dans l'éthanol 70% pendant 10 min.
3. Couvrir les cellules avec quelques gouttes d'une solution de coloration au rouge d'alizarine (1 mg / ml, pH 5,5)pendant 30 min.
4. Lavez les lamelles avec de l'eau du robinet. Monter avec une goutte de glycérine sur des lames de verre et de prendre des photos en utilisant un microscope droit à 10X et 20X grossissement.
5. Après la procédure ci-dessus, de récupérer les lamelles en immergeant les lames dans l'eau du robinet.
6. Mettez chaque lamelle dans une plaque bien.
7. Ajouter de l'acide perchlorique à 60% (la quantité doit être suffisante pour couvrir complètement les cellules) et laisser O / N à 4 ° C avec agitation douce.
8. Lire la densité optique du surnageant par spectrophotométrie à 450 nm de longueur d'onde.
9. Pour normaliser les valeurs pour le nombre de cellules, ajouter Janus vert (solution à 0,2% dans du PBS) pour couvrir la préparation de cellules pendant 10 min.
10. Laver soigneusement avec de l'eau ultrapure.
11. Ajouter HCl 0,5 N (la quantité doit être suffisant pour couvrir toutes les cellules) et secouez doucement la main pendant quelques secondes.
12. Lire l'absorbance à 615 nm par spectrophotométrie.

Les résultats ont été obtenus de 5 à 10 expériences indépendantes.

Morphologie des cellules

AA / GP traité cellules primaires ont des caractéristiques principalement pavées comme, caractéristique des ostéoblastes matures. Cellules ramifiées entrecoupées (comme indiqué par les flèches rouges dans la figure 1A) peut être trouvé, qui représentent probablement des ostéocytes.

Avec un traitement ATRA, les cellules commencent rapidement afficher ramifications, qui sont généralement observés après 2 jours. Comme le montre la figure 1B, les cellules ramifiées besoin d'espace pour étendre leurs dendrites. Comme le traitement à l'ATRA produit, ramifications augmentent progressivement en nombre et en complexité, les figures 1C et 1D. La coloration de l'actine filamenteuse par phalloidin marqué à la rhodamine en évidence les processus cellulaires, qui sont marqués par phalloidin, Figure 2.

Matrice de production

ostéoblastes primaires de produire de grandes quantités de matrice calcifiée, qui s'accumule sur et entre les cellules et peut être visualisé par coloration au rouge alizarine, la figure 3A. Ostéocytes ne produisent pas de matrice extracellulaire calcifiée, et les résultats de coloration rouge alizarine complètement négatifs dans les cellules ATRA incubés, la figure 3B. En conséquence, aucune ou une quantité minimale d'alizarine rouge peuvent être mesurées après l'opération d'extraction, la figure 3C.

Marqueurs et produits ostéocytes

Sclerostin est exprimée par les cellules traitées par l'ATRA, la figure 4. Immunocoloration révèle l'expression cytoplasmique intense et la présence de points positifs le long processus cellulaires. Par immunofluorescence, une forte positivité de FGF23 est détectable dans les cellules traitées par l'ATRA, la figure 5, soit dans le corps de la cellule ou le long des processus cellulaires.

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Figure 1. Microscopie optique. Ostéoblastes primaires montrent un aspect cubique prédominant après 5 jours d'incubation avec AA / GP (A) (barre d'échelle 100 um). Cellules ramifiées clairsemées peuvent être identifiés (A) (flèches). Après 2 jours de traitement ATRA (B) (barre d'échelle de 100 um), les cellules présentent une forme plus allongée et dendrites apparaissent clairement détectable. Seulement arborisée cellules peuvent être observées après 5 jours de ATRA incubation (C) (barre d'échelle de 100 um), et sont mieux détectable à plus fort grossissement (D) (barre d'échelle 50 pm).

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Figure 2. Filaments d'actine coloration. Filaments d'actine sont identifiés par une coloration à la rhodamine falloidin. La figure montre un résultat représentatif obtenu à partir de cellules traitées par l'ATRA pendant 3 jours. Déjà à ce point de temps, l'actine filamenteuse apparaît comme une composante majeure de développement de processus cellulaires. Barre d'échelle: 50 um.

Figure 3. Des dépôts calcifiés. Alizarine coloration rouge diffuse observée dans les ostéoblastes après 5 jours d'incubation avec AA / GP (A) (barre d'échelle 100 um), alors est négative dans les cellules ATRA incubés (B) (barre d'échelle de 50 um). Une profonde différence peut être mesurée par SPECTroscopie après l'extraction de l'alizarine (C).

Figure 4. Sclerostin. Sclerostin positivité est détectée dans le cytoplasme et le long des processus cellulaires des cellules incubées avec l'ATRA (barre d'échelle 50 um).

Figure 5. FGF23. FGF23 immunologique est intense dans les cellules traitées par l'ATRA (barre d'échelle 50 um).

Dans les dernières années, le ostéocyte a émergé comme la cellule la plus centrale dans l'os. progrès de la recherche sont progressivement révèlent un certain nombre de propriétés de ostéocytes insoupçonnées ou non prouvées, qui sont d'une valeur inestimable pour la conception de nouveaux et de meilleurs traitements pour une variété de maladies osseuses. Toutefois, l'enquête de ostéocyte biologie a souffert de la disponibilité limitée des modèles in vitro à un point tel que les ostéoblastes ont été utilisées comme cellules de remplacement sur ​​une longue période avant la lignée cellulaire ostéocyte comme MLO-Y4 a été mis à disposition. Plus récemment, une lignée cellulaire immortalisée conditionnelle a été introduite par le même groupe ^16, qui peut être distinguée à ramifié ostéocytes fin exprimant sclérostine et FGF23. Bien que la valeur extrême de ces lignées cellulaires n'est pas en question, il est très bien connu que les cellules primaires ressemblent davantage la situation in vivo et offrent la possibilité d'obtenir ostéocytes primaire franimaux transgéniques om pour effectuer des études fonctionnelles sur les voies moléculaires spécifiques.

Isolement et culture des ostéocytes primaires, première obtenues à partir d'os chiches ^5,6 puis de rats et de souris os ^17,7, sont extrêmement utiles, mais leur isolement génère seulement un petit nombre de cellules par la procédure, et la pureté de la cellule repose dans une large mesure sur l'expertise individuelle. Par conséquent, le procédé est actuellement utilisé seulement par un nombre limité de laboratoires.

D'autres groupes de recherche ont obtenu ostéocytes matures en induisant la différenciation terminale des ostéoblastes par intégration progressive dans les matrices minéralisées en trois dimensions ^18,19, qui constituent un environnement plus physiologique, mais qui sont un obstacle aux demandes de recherche ultérieurs. Il est vrai que la minéralisation de la matrice ^20, ainsi qu'une faible tension d'oxygène ^{de 21,} sont des déclencheurs physiologiques de la maturation des ostéocytes. Cependant, un rencontréhodology éviter ces deux conditions pourrait augmenter faisabilité et d'étendre l'utilisation des cellules. Notre méthode proposée ^10, qui consiste à ajouter de l'acide rétinoïque à des ostéoblastes matures, est simple, très reproductible, et permet d'éviter la transfection de cellules ²² ou de l'utilisation de facteurs de croissance ²³ coûteux.

Avec une série d'expériences préliminaires, nous avons déterminé que le nombre de cellules de départ est une étape, un conditionnement approprié critique de formation de dendrites et de multiples contacts intercellulaires. Une densité cellulaire de placage trop élevé affecte la complexité et l'extension de processus cellulaires, tandis que trop faibles nombres se traduisent par une perte d'adhérences intercellulaires, ce qui conduit à la souffrance cellulaire et la mort.

Surtout, l'ajustement de la posologie ATRA et un suivi quotidien de la morphologie des cellules est fortement recommandé, en raison de la variabilité inhérente des cellules primaires qui peuvent affecter la sensibilité à l'ATRA. Ces aspects peuvent devenir EPM particulièrement pertinentn la méthode est appliquée à des modèles transgéniques.

Le développement de procédés de cellules peut être contrôlée par la coloration de l'actine, parce que les dendrites sont riches en actine filamenteuse.

Il est bien connu que les ostéocytes ne produisent pas de matrice calcifiée, et ATRA incubation abolit rapidement, comme illustré par la réduction progressive jusqu'à négativité complète de la coloration rouge alizarine. Pendant ce temps, l'ATRA induit l'expression de marqueurs de ostéocytes bien connus, notamment sclérostine ^24, et assure la production de FGF23, un facteur de croissance fondamental impliqué dans les os et la manipulation ²⁵ phosphate systémique. Par conséquent, d'autres études visant à étudier le rôle fonctionnel de FGF23 et sclérostine en ostéocytes seront facilitées par la production endogène de ces molécules.

En résumé, on montre que le traitement par l'acide rétinoïque génère une population homogène de ostéocytes matures à partir de cellules primaires calvaria, l'Refore permettant la préparation simple et rapide des ostéocytes à la fois de type sauvage et des animaux transgéniques. Comparé à d'autres méthodes, notre protocole semble présenter plusieurs avantages, principalement l'application simple et la grande reproductibilité. Le processus de maturation ostéocyte peut être étudiée dans un nombre suffisant de cellules de la diffusion initiale des processus en plusieurs étapes qui se produisent dans un cadre de 5 jours. Comme autre avantage, les ostéocytes matures sont obtenus en l'absence totale de matrice minéralisée environnante, ce qui permet l'application d'essais moléculaires et fonctionnels illimitées.

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Le financement a été fourni par "Progetto un concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010» de MD, et Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano