יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

טיפול בosteoblasts עכבר העיקרי עם חומצה רטינואית מייצר אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes. השיטה מתגברת על הקושי בהשגה ושמירה על osteocytes העיקרי בתרבות, ויכולה להיות יתרון ללמוד תאים הנגזרים ממודלים מהונדסים.

הצורך בתרבויות osteocyte ידוע לקהילת חוקרי עצם; בידוד של osteocytes העיקרי הוא קשה ומייצר מספרי תא נמוכים. לכן, המערכת הסלולרית הנפוצה ביותר היא שורת התאים כמו osteocyte-MLO-Y4.

השיטה שתוארה כאן מתייחסת לשימוש של חומצה רטינואית ליצירת אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים עם תכונות osteocyte מורפולוגיים ומולקולריים.

לאחר הבידוד של osteoblasts ממכסה גולגולת עכבר, חומצה רטינואית כל טרנס (ATRA) הוא הוסיף למדיום סלולרי, ותא ניטור מתבצע מדי יום תחת מיקרוסקופ הפוכה. שינויים מורפולוגיים הראשונים הם לגילוי לאחר 2 ימי טיפול והבידול הוא בדרך כלל מלא ב5 ימים, עם התפתחות הדרגתית של דנדריטים, אובדן היכולת לייצר מטריצה ​​תאית, למטה רגולציה של סמני תא עצם ועד הוויסות של מולקולות osteocyte ספציפי. תוכן "> יש צורך בניטור תא היומי בגלל ההשתנות הפנימית של תאים ראשוניים, והפרוטוקול יכול להיות מותאם עם וריאציה מינימאלית לתאים המתקבלים מזנים שונים עכבר וליישם מודלים מהונדסים.

השיטה היא קלה לביצוע ואינו דורשת מכשור מיוחד, היא לשעתקו מאוד, ומהירות יוצרת אוכלוסיית osteocyte בוגרת בהיעדר המטריצה ​​תאית מלא, המאפשרת שימוש בתאים אלה ליישומים ביולוגיים בלתי מוגבלים.

Osteocytes, סוג תא עצם הנפוץ ביותר, הוא הבדיל סופני, תאים מסועפים מאוד עמוק הנמצאים בתוך השלד. גוף התא של osteocytes הבוגר כלולים בחסר עצם ויש צורות מגוונות; osteocytes עם גופי תא מוארכים נמצא בקליפת מוח העצם, ואילו osteocytes המעוגל הם תכופים יותר בעצמות הטרבקולות ^1. דנדריטים מסועפים להאריך מגוף התא ומתגוררים בערוצים זעירים המכונים נקבות, ויוצרים רשת סבוכה שגורמת לאנשי קשר מרובים לא רק עם osteocytes אחר, אלא גם עם סוגים אחרים של תאי עצם, מח עצם, כלי דם וpericytes הכרוך בכך. באמצעות נוזל ביניים הכלולים בקונות ונקבות, osteocytes גם סופו של דבר מחובר למערכת במחזור, ולכן הם יכולים להשפיע לא רק מקומיים, אלא גם אירועים מערכתיים, ולהיפך ההתנהגות שלהם יכולה להיות מוסדרת על ידי שני שינויים מערכתיים והמקומיים ^2.

מחקר של osteocytes לאחרונה צבר תאוצה, הודות לכמה חידושים טכנולוגיים, כגון הדור של רקמות ובעלי חיים מהונדסים תא ספציפי, השימוש בשיטות מיקרוסקופיה רבות עוצמה ושל הקרנה מולקולרית תפוקה גבוהה ^3,4. עם זאת, ידע של תאים אלה עדיין לא הושלם, בעיקר בשל מיעוט היחסי של דגמים מתאימים במבחנה. למעשה, osteocytes היה תמיד קשה להשיג ולשמור על בתרבות בגלל המיקום העמוק, והרמה הנמוכה של ריבוי המאפיין את סוג תא מובחן כזה.

לאורך השנים, במספר השיטות פותחו כדי לבודד osteocytes העיקרי ^5-7, למרות שהם בדרך כלל לייצר תשואות תא נמוכות ולשאת את הסיכון שאפילו כמה fibroblasts זיהום יהיה במהירות לגדול osteocytes ^8. מסיבה זו, רוב ניסיוני בעבודה חוץ גופית כבר נערך עד כה על ליטר תא osteocyte המבוסס היטבine MLO-Y4 ^9.

במבחנה מתודולוגיות נוספות יכולה לשפר את האפשרות ללמוד את התאים האלה ויכולות לשפר את הניתוח של הביולוגיה osteocyte והפתופיזיולוגיה. להיות במידה רבה אימצו, שיטות כאלה צריכה להיות קלים לשחזר, ולא דורשות מכשור מיוחד או פעמים רבות מאוד כדי להגיע להבשלת תא. חשוב לציין, אם רלוונטי לתאים ראשוניים, הם היו מאפשרים לנצל בעלי חיים מהונדסים. לאחרונה תוארו כי טיפול של הקו הסלולרי osteoblast MC3T3-E1 ושל osteoblasts העיקרי עם חומצה הרטינואית גורם לשינוי פנוטיפ מהיר שמוביל להתפתחות של אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes ^10.

כל טרנס החומצה רטינואית (ATRA) היא מוצר מטבולים פעיל של ויטמין A המסדיר שעתוק הגנים על ידי קשירה לקולטנים החומצה הרטינואית הגרעיניים (Rars). Rarsנקשרים ל-DNA כheterodimers עם קולטנים X retinoid (RXRs), סופו של דבר מוביל לאפנון של חומצה רטינואית (RA) מגיב לגני המטרה ^11. ATRA הוכח לווסת את התמיינות והתבגרות של כמה סוגי תאים, ובהם תאים מסועפים אחרים, כגון תאים עצביים ¹² וpodocytes ^13.

השיטה שתוארה כאן מתבססת על תוספת של ATRA לosteoblasts העיקרי. כדי להיות יעיל, ATRA יש להוסיף בשלב הבשלה מדויק על תאים מצופים בצפיפות מוגדרת; בניסיון שלנו בתנאים אלה הם קריטיים כדי להשיג את מתג פנוטיפ מosteoblasts לosteocytes.

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם ללאומי ותקנות הנוכחיות באירופה בנוגע להגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות ונבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מילאנו.

1. בידוד של Osteoblasts הראשי

השיטה, עם שינוי קל, כדלקמן ההליך שתואר על ידי Dodig et ¹⁴ אל.

1. הכן לעכל בינוני, על ידי הוספת 0.1% Collagenase P ו0.05% טריפסין (החל מ2.5% טריפסין 10X, לא פנול אדום) עד בינוני HBSS (תמיסת מלח מאוזנת הנקס, לא סידן, מגנזיום, או פנול אדום).
2. השתמש ישנים עכברי 3-4 יום (ההליך יכול להיות מיושם על כמה כמו עכבר 1).
3. להקריב על ידי עריפת ראש. לרסס את הראש עם 70% אתנול ולשמור על קרח. הסרת שכבות עור ושריר על ידי פינצטה ומספריים כירורגיות לנתח /.
4. להסיר בעדינות את העצמות הקודקודית ולהפריד ביניהם על ידי ביצוע תפר sagittal בשני חצאים. הפוך עצמות בטוחים הן ללא תפרים וכל רקמה חסיד ומניח את חתיכות עצם בודדות בגם צלחות המכילות בינוני HBSS עד ההליך הושלם.
5. בטל HBSS ולהוסיף לכל אחד גם בינוני לעכל במשך 15 דקות ב37 ° C.
6. בטל supernatant.
7. להוסיף שוב בינוני לעכל במשך 15 דקות ב37 ° C.
8. הפעם להציל את supernatant ולמקם אותו באלפא-ממ (בינוני Essential Minimum) בתוספת 10% FBS (בסרום שור עוברי) ו -1% סטרפטומיצין / פניצילין.
9. חזור על שלבים 1.7 ו1.8 2x.
10. בריכת שלושה שברים שנאספו, תאי ספין על ידי צנטריפוגה ב425 גרם במשך 5 דקות, לבטל את supernatant, להוסיף 3 מיליליטר של אלפא-ממ בתוספת לresuspend התא גלולה, ולהעביר לבקבוק ² 25 סנטימטר.
11. שינוי הבינוני לאחר 24 שעות כדי להסיר שאריות ותאים מתים.
12. הוסף 50 חומצת מיקרוגרם / מיליליטר אסקורבית (AA) ו3 מ"מ גלאימימה cerol 2 פוספט מלח disodium (GP) למדיום אלפא-ממ.
13. לאחר מכן, לשנות את המדיום (אלפא-ממ AA פלוס / GP) בכל יום אחר.

2. ATRA פרוטוקול

1. לנהל את כל הניסויים עם ATRA (All-Trans חומצה הרטינואית) בחדר חשוך כדי למנוע איון.
2. הכן פתרון טריפסין 1X במדיום HBSS ולשמור על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. הוצא את המדיה מתאי subconfluent ובזהירות לשטוף אותם עם HBSS.
4. הוספת טריפסין 1 מיליליטר, בעדינות לסובב את הבקבוק כדי לאפשר לכל התאים להיות מכוסים על ידי טריפסין, ודגירה במשך 3 דקות על 37 ° C.
5. הגעה לניתוק בפועל של תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה.
6. הוסף 3 מיליליטר של מדיום אלפא-ממ כדי להשבית טריפסין.
7. לשחזר את התאים ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב425 גרם.
8. Resuspend התא גלולה במדיום חדש.
9. מניחים ירידה בחדר ספירת hemocytometer, לאפשר להתיישב לכמה דקות ולספור את הספירהמספר ll.
10. תאי מקום ב25 סנטימטר ² צלוחיות בצפיפות של 10,000 תאים / ² סנטימטר עם אלפא-ממ AA פלוס / GP. להיות מודע לכך צפיפות תאים היא רלוונטית להתפתחות האופטימלית של תהליכים בתא ואנשי קשר אינטר. צפיפות התחלה גבוהה יותר מאשר 10,000 תאים / ² סנטימטר פוגע בהתפתחות תקינה של תהליכים בתא, אבל מספרים סלולריים נמוכים יותר לגרום למוות של תאים מוקדמים, בשל העדרו של קשר אינטר.
11. הוסף 5 מיקרומטר ATRA למדיום כל שעה 24.
12. לפקח על התאים מדי יום כדי להעריך את המורפולוגיה: שינויים מורפולוגיים הם נצפו בדרך כלל לאחר 48 שעות. אם לאחר שעה 24-48 הראשונה, תאים עדיין מתרבים, replate בצפיפות לעיל. אוכלוסייה הומוגנית של osteocytes הבוגר נמצאת אחרי 4-5 ימים. בהתאם לצרכים, להשתמש בתאים בכל נקודת זמן, עד 12-15 ימים.
13. כאשר תאים מצופה על תומך אחר (כגון coverslips או גם צלחות), כדי להיות בטוח כי הצפיפות מעל מתוחזק וממשיך להוסיף ATRA כל שעה 24 עד לשימוש. לצאת מתאים לדבוק בתמיכה החדשה עבור לפחות 24 שעות לפני הניסוי.

3. Immunostaining

1. עבור immunostaining, צלחת התאים על coverslips ובצע מתודולוגיות הוקמו (ראה למשל ¹⁵ בארי).
2. לדוגמא, עבור immunofluorescence העקיף, לתקן paraformaldehyde 4% או אצטון הקר, דגירה ברצף עם הנוגדן הראשוני ב RT עבור שעה 1 בתא humidified, ולאחר מכן עם הנוגדנים שכותרתו המשניים ניאון בחושך, על RT במשך 30 דקות, בתא humidified.
3. השתמש DAPI או אנלוגים לcounterstaining גרעיני, ולעגן באנטי הדהיה בינונית.

4. אליזרין אדום מכתים והפקה

1. פלייט התאים על coverslips.
2. תקן את התאים על ידי טבילת coverslip ב70% אתנול ל10 דקות.
3. לכסות את התאים עם כמה טיפות של פתרון מכתים אדום אליזרין (1 מ"ג / מיליליטר, pH 5.5)ל30 דקות.
4. שטוף את coverslips עם מי ברז. הר עם ירידה של גליצרול על שקופיות זכוכית ולקחת את התמונות באמצעות מיקרוסקופ זקוף ב10X והגדלה 20X.
5. לאחר ההליך הנ"ל, לשחזר את coverslips ידי טבילת השקופיות במים ברז.
6. שים את כל coverslip בצלחת היטב.
7. הוסף 60% חומצת perchloric (הכמות צריכה להיות מספיק כדי לכסות את התאים לחלוטין) ולעזוב O / N ב 4 ° C עם תסיסה עדינה.
8. קראו את הצפיפות האופטית של supernatant ידי spectrophotometry ב450 אורך גל.
9. לנרמל את הערכים עבור מספר תאים, להוסיף יאנוס גרין (פתרון 0.2% ב-PBS) כדי לכסות את הכנת התא ל10 דקות.
10. לשטוף בזהירות עם מים ultrapure.
11. הוסף 0.5 N HCl (הכמות צריכה להיות מספיק כדי לכסות את כל התאים) ולנער בעדינות ביד במשך כמה שניות.
12. קראו את הספיגה ב 615 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר.

תוצאות התקבלו 5-10 ניסויים בלתי תלויים.

מורפולוגיה של תאים

AA / GP טופל יש תאים ראשוניים תכונות בעיקר כמו מרוצפות, אופייני לosteoblasts הבוגר. ניתן למצוא תאים מסועפים ביניהם (כפי שצוין על ידי חצים אדומים באיור 1 א), שסביר להניח שמייצגים חלק osteocytes.

עם טיפול ATRA, תאים במהירות להתחיל בו מוצגות השלכות, שהם נצפו בדרך כלל לאחר 2 ימים. כפי שניתן לראות באיור 1, תאים מסועפים דורשים שטח כדי להרחיב את הדנדריטים שלהם. כטיפול בתמורת ATRA, השלכות להגדיל בהדרגה במספר ובמורכבות, דמויות 1C ו1D. הכתמה של אקטין פילמנטיות ידי phalloidin rhodamine שהכותרת מדגישה תהליכים בתא, שמסומנים על ידי phalloidin, איור 2.

מטריקס הפקה

סמני osteocyte ומוצרים

Sclerostin מתבטא בתאים שטופלו ATRA, איור 4. Immunostaining מגלה ביטוי cytoplasmic אינטנסיבי והנוכחות של נקודות חיוביות לאורך תהליכים בתא. על ידי immunofluorescence, חיוביות FGF23 חזקה היא לזיהוי בתאים שטופלו ATRA, איור 5, או בגוף התא או לאורך תהליכים בתא.

er.within-page = "תמיד">
איור 1. במיקרוסקופ אור. Osteoblasts הראשי להראות מראה cuboidal השולט לאחר דגירה 5 ימים עם AA / GP (מיקרומטר סרגל קנה מידה 100) (). ניתן לזהות תאים מסועפים דלילים (א) (חיצים). לאחר 2 ימי טיפול ATRA (ב) (סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר), תאים להציג צורה מוארכת יותר ודנדריטים מופיעים באופן ברור לזיהוי. ניתן להבחין בתאי arborized רק לאחר 5 ימים של הדגירה ATRA (סרגל קנה מידה 100 מיקרומטר) (ג), וניתנים לאיתור טוב יותר בהגדלה גבוהה יותר (D) (סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר).

jpg "src =" / files/ftp_upload/51465/51465fig2.jpg "/>
איור 2. מכתים נימה אקטין. סיבי אקטין הם זוהו על ידי צביעת Rhodamine-falloidin. הנתון מראה תוצאת נציג המתקבלת מהתאים שטופלו ATRA במשך 3 ימים. כבר בנקודה זו בזמן, אקטין פילמנטיות מופיע כמרכיב עיקרי בפיתוח תהליכים בתא. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.

איור 3. פיקדונות מסוידים. צביעה אדומה אליזרין הוא ציין באריכות בosteoblasts לאחר דגירה 5 ימים עם AA / GP (מיקרומטר סרגל קנה מידה 100) (א), ואילו היא שלילי בתאי הודגרו-ATRA (ב) (סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר). הבדל עמוק ניתן למדוד על ידי SPECTroscopy לאחר מיצוי אליזרין (C).

איור 4. חיוביות Sclerostin. Sclerostin הוא זוהה בציטופלסמה ולאורך תהליכים בתא של תאים הודגרו עם ATRA (סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר).

איור 5. FGF23. Immunostaining FGF23 הוא אינטנסיבי בתאים שטופלו ATRA (סרגל קנה מידה 50 מיקרומטר).

בשנים האחרונות osteocyte התפתחה כתא המרכזי ביותר בעצמות. התקדמות במחקר בהדרגה מגלה מספר מאפייני osteocyte בלתי צפויים או בלתי מוכחים בעבר, שהם בעלי ערך עצום לעיצוב חדשני וטיפול טוב יותר עבור מגוון רחב של מחלות עצם. עם זאת, חקירה של הביולוגיה osteocyte כבר סובלת מהזמינות המוגבלת של במבחנה מודלים במידה כזו שosteoblasts שימש כתאים פונדקאיות במשך תקופה ארוכה לפני ששורת התאים כמו osteocyte-MLO-Y4 הייתה זמינה. לאחרונה, שורת תאים הונצחה על תנאי הוצגה על ידי אותה הקבוצה ^16, אשר יכול להיות מובחנת למסועפים osteocytes מאוחר להביע sclerostin וFGF23. למרות הערך הקיצוני של שורות תאים אלה אינו בשאלה, זה ידוע היטב כי תאים ראשוניים דומים יותר vivo מצב ובמציעים את האפשרות להשיג fr osteocytes העיקריבעלי חיים מהונדסים אום לבצע מחקרים תפקודיים על מסלולים מולקולריים ספציפיים.

בידוד והתרבות של osteocytes העיקרי, שהושג ראשון מעצמות אפרוח ^5,6 ולאחר מכן מעצמות חולדה ועכבר ^17,7, הם מאוד שימושיים, אבל הבידוד שלהם מייצר רק מספר קטן של תאים לכל הליך, וטוהר תא מסתמך במידה רבה על המומחיות של פרט. לכן, השיטה משמשת כיום רק על ידי מספר מצומצם של מעבדות.

קבוצות מחקר אחרות לא השיגו osteocytes הבוגר על ידי גרימת בידול מסוף של אוסטאובלסטים דרך הטבעה מתקדמת במטריצות תלת ממדיות mineralized ^18,19, המהוות סביבה פיזיולוגית יותר, אך הן מכשול ליישומי מחקר שלאחר מכן. זה נכון שמינרליזציה המטריצה ^​​20, כמו גם מתח חמצן נמוך ^21, הם גורמים פיסיולוגיים של התבגרות osteocyte. עם זאת, פגשhodology הימנעות שני תנאים אלה יכולים להגדיל את הכדאיות ולהרחיב את השימוש בתאים. השיטה שלנו הציעה ^10, אשר מורכבת של הוספת חומצה הרטינואית להבשיל osteoblasts, היא פשוטה, לשעתקו מאוד, ונמנע מהתא transfection ²² או השימוש בצמיחה יקרה גורמי ^23.

בסדרה של ניסויים ראשוניים, קבענו כי מספר התא מתחיל הוא במערך נכון צעד, אוויר קריטי של דנדריטים מרובים וקשר אינטר. צפיפות תאי ציפוי גבוהה מדי משפיעה על מורכבות והרחבה של תהליכים בתא, בעוד שמספרים נמוכים מדי יגרמו לאובדן של הידבקויות אינטר, שמוביל לסבל ולמוות של תאים.

חשוב לציין, התאמה של מינון ATRA וניטור היומיומי של מורפולוגיה של תאים הם מומלצים מאוד, בגלל השונות הטבועות בתאים ראשוניים שיכול להשפיע על הרגישות לATRA. היבטים אלה יכולים להיות רלוונטי במיוחד when המתודולוגיה מוחלת על מודלים מהונדסים.

הפיתוח של תהליכים בתא יכול להיות במעקב על ידי צביעה אקטין, כי דנדריטים עשירים ביקטינו פילמנטיות.

זה ידוע היטב כי osteocytes אינו מייצר מטריצה ​​מסויד, ודגירת ATRA מהירות מבטלת אותו, כפי שמוצג על ידי הפחתה הדרגתית עד שלילי של מכתים אדום אליזרין מלא. בינתיים, ATRA גורם ביטוי של סמני osteocyte ידועים, בעיקר sclerostin ^24, ומבטיח ייצור של FGF23, גורם גדילה בסיסי המעורב בעצמות ופוספט המערכתי טיפול ^25. לכן, מחקרים נוספים שנועדו לבחון את התפקיד הפונקציונלי של FGF23 וsclerostin בosteocytes יהיו בהנחייתם של הייצור אנדוגני של מולקולות אלה.

לסיכום, אנו מראים כי טיפול בחומצה רטינואית יוצרת אוכלוסייה הומוגנית של osteocytes הבוגר מתאי מכסה גולגולת ראשוניים,refore מאפשר הכנה פשוטה ומהירה של osteocytes מסוג שני בר ובעלי חיים מהונדסים. בהשוואה לשיטות אחרות, נראה הפרוטוקול שלנו להציג מספר יתרונות, בעיקר יישום פשוט ושחזור הגבוה. התהליך של התבגרות osteocyte ניתן ללמוד במספרים מספקים של תאים מראשוניים הפצה של תהליכים דרך מספר שלבים המתרחשים במסגרת של 5 ימים. כיתרון נוסף, osteocytes הבוגר מתקבלות בהעדר המקיף מטריצת mineralized מלא, המאפשר היישום של מבחני מולקולריים ופונקציונליים בלתי מוגבלים.

יש המחברים אין לחשוף.

מימון ניתן על ידי "Progetto Fondazione IRCCS Ospedale מאג'ורה Policlinico concorso 2009-2010" לMD, וAssociazione מבין Nefropatico ABN Onlus, מילאנו