Applicazione di acido retinoico per ottenere colture osteocytes da principale del mouse osteoblasti

Trattamento di osteoblasti di topo primari con acido retinoico produce una popolazione omogenea di cellule ramificate recanti caratteristiche morfologiche e molecolari di osteociti. Il metodo supera la difficoltà di ottenere e mantenere osteociti primari in coltura, e può essere vantaggioso per studiare cellule derivate da modelli transgenici.

La necessità di culture osteociti è ben noto alla comunità dei ricercatori ossee; isolamento di osteociti primario è difficile e produce il numero di cellule bassi. Pertanto, il sistema cellulare più usato è la linea cellulare MLO-Y4 osteociti-like.

Il metodo qui descritto si riferisce all'uso di acido retinoico per generare una popolazione omogenea di cellule ramificate con caratteristiche osteociti morfologici e molecolari.

Dopo l'isolamento degli osteoblasti da calvaria topo, acido all-trans retinoico (ATRA) viene aggiunto a un terreno cella, e di monitoraggio delle cellule viene effettuato giornalmente al microscopio invertito. I primi cambiamenti morfologici sono rilevabili dopo 2 giorni di trattamento e differenziazione, è completa in 5 giorni, con progressivo sviluppo dei dendriti, perdita della capacità di produrre matrice extracellulare, down-regulation dei marcatori osteoblasti e up-regolazione di molecole specifiche per osteociti. contenuto "> monitoraggio delle cellule giornaliero è necessaria a causa della variabilità intrinseca delle cellule primarie, e il protocollo può essere adattato con minime variazioni di cellule ottenute da diversi ceppi di topi e applicate ai modelli transgenici.

Il metodo è di facile esecuzione e non richiede strumenti speciali, è altamente riproducibile, e genera rapidamente una popolazione osteociti maturo in completa assenza di matrice extracellulare, permettendo l'uso di queste cellule per applicazioni biologiche illimitati.

Osteociti, il più abbondante tipo cellule ossee, sono terminalmente differenziate, cellule altamente ramificati localizzati in profondità all'interno dello scheletro. Il corpo cellulare dei osteocytes mature sono contenute nelle lacune di osso e hanno forme diverse; osteociti con corpi cellulari allungati si trovano nell'osso corticale, osteociti arrotondati che sono più frequenti nell'osso trabecolare ^1. Dendriti ramificati estendono dal corpo cellulare e risiedono in piccoli canali chiamati canalicoli, formando una rete complessa che rende più contatti non solo con altri osteociti, ma anche con altri tipi di cellule di midollo, midollo osseo, vasi sanguigni e periciti associati. Attraverso il fluido interstiziale contenuta in lacune e canalicoli, osteociti sono anche definitiva collegato al sistema di circolazione, quindi possono influenzare non solo locale ma anche eventi sistemici, e viceversa il loro comportamento può essere regolata da variazioni sia locali che sistemici ^2.

Ilstudio di osteociti ha recentemente acquisito slancio, grazie a diversi miglioramenti tecnici, quali la generazione di tessuti e animali transgenici cellula-specifici, l'uso di potenti tecniche di microscopia e di high throughput screening molecolare ^3,4. Tuttavia, la conoscenza di queste cellule è ancora incompleta, principalmente a causa della relativa scarsità di adeguati modelli in vitro. In realtà, osteociti sono stati sempre difficili da ottenere e mantenere in coltura a causa della posizione profonda, e il basso livello di proliferazione che caratterizza tale tipo di cellula differenziata.

Nel corso degli anni, un certo numero di metodi sono stati sviluppati per isolare osteociti primario ^5-7, se generalmente producono produzioni di cellule basse e comportano il rischio che anche alcuni fibroblasti contaminanti saranno rapidamente invadere il osteociti ^8. Per questo motivo, più sperimentale in opera vitro è stato condotto finora sulla cella osteociti consolidata line MLO-Y4 ^9.

Metodologie aggiuntive in vitro potrebbero aumentare la possibilità di studiare queste cellule e potrebbero migliorare l'analisi della osteociti biologia e fisiopatologia. Per essere ampiamente adottati, tali metodi dovrebbero essere facili da riprodurre, e non richiederebbero particolari strumentazioni o tempi molto lunghi per raggiungere la maturazione delle cellule. Importante, se applicabile a cellule primarie, che consentirebbero di sfruttare animali transgenici. Recentemente abbiamo descritto che il trattamento della linea cellulare osteoblastica MC3T3-E1 e di osteoblasti primari con acido retinoico induce un cambiamento fenotipo rapido portando allo sviluppo di una popolazione omogenea di cellule ramificate recanti caratteristiche morfologiche e molecolari di osteociti ^10.

All-trans retinoico (ATRA) è un prodotto del metabolismo attivo della vitamina A che regola la trascrizione genica legandosi ai recettori dell'acido retinoico nucleari (ARSA). RARslegarsi al DNA come eterodimeri con i retinoidi X recettori (RXRs), portando in definitiva a modulazione di acido retinoico (RA)-reattiva geni bersaglio ^11. ATRA è stato dimostrato che modulano la differenziazione e la maturazione dei diversi tipi di cellule, tra i quali altre cellule ramificate come le cellule neuronali ¹² e podociti ^13.

Il metodo qui descritto è basato sulla aggiunta di ATRA di osteoblasti primari. Per essere efficace, ATRA deve essere aggiunto in una fase di maturazione preciso su cellule piastrate ad una densità definita; nella nostra esperienza queste condizioni sono fondamentali per ottenere l'interruttore fenotipo di osteoblasti a osteocytes.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo la normativa vigente europee relative alla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici e sono stati esaminati e approvati dal comitato etico dell'Università di Milano e nazionali.

1. Isolamento di osteoblasti primari

Il metodo, con lievi modifiche, segue la procedura descritta da Dodig et al ^14.

1. Preparare digerire medio, aggiungendo 0,1% collagenasi P e 0,05% tripsina (partendo dal 2,5% tripsina 10X, senza rosso fenolo) per mezzo HBSS (Hanks Balanced Salt Solution, senza calcio, magnesio, o rosso fenolo).
2. Utilizzare 3-4 giorni di età topi (il procedimento può essere applicato a appena 1 mouse).
3. Sacrifica per decapitazione. Spruzzare la testa con il 70% di etanolo e tenere in ghiaccio. Togliere la pelle e muscoli strati da pinzette e dissezione / forbici chirurgiche.
4. Rimuovere delicatamente le ossa parietali esepararli seguendo la sutura sagittale in due metà. Assicurarsi che le ossa sono liberi di suture e di eventuali tessuti aderenti e posizionare singoli pezzi ossei in piastre a pozzetti contenenti HBSS medio fino a quando la procedura è completata.
5. Scartare HBSS e aggiungere a ciascun pozzetto il mezzo digerire per 15 min a 37 ° C.
6. Scartare il surnatante.
7. Aggiungere nuovamente il mezzo digerire per 15 min a 37 ° C.
8. Questa volta salvare il surnatante e trasferirla in alfa-MEM (Medium Minimum Essential) supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e l'1% di streptomicina / penicillina.
9. Ripetere i punti 1.7 e 1.8 2x.
10. In comune le tre frazioni raccolte, le cellule di spin mediante centrifugazione a 425 g per 5 minuti, scartare il surnatante, aggiungere 3 ml di INTEGRAZIONI alfa-MEM per risospendere il pellet cellulare, e trasferirli in un pallone di 25 centimetri ^2.
11. Cambia il mezzo dopo 24 ore per rimuovere i detriti e le cellule morte.
12. Aggiungi l'acido 50 mg / ml ascorbico (AA) e 3 mm Glycerol 2-fosfato idrato sale disodico (GP) al mezzo alfa-MEM.
13. Successivamente, cambiare il mezzo (alfa-MEM più AA / GP) a giorni alterni.

2. ATRA protocollo

1. Condurre tutti gli esperimenti con ATRA (acido all-trans retinoico), in una stanza buia per evitare inattivazione.
2. Preparare una soluzione di tripsina 1X in HBSS medio e mantenerlo a 37 ° C fino all'utilizzo.
3. Rimuovere il supporto da cellule subconfluenti e accuratamente lavarli con HBSS.
4. Aggiungere 1 ml di tripsina, ruotare delicatamente il pallone per consentire tutte le celle da coprire con tripsina, e incubare per 3 min a 37 ° C.
5. Controllare il distacco effettivo di cellule al microscopio invertito.
6. Aggiungere 3 ml di alfa-MEM per inattivare la tripsina.
7. Recuperare le cellule e centrifugare per 15 minuti a 425 g.
8. Risospendere il pellet di cellule in terreno fresco.
9. Mettere una goccia in una camera di conteggio emocitometro, lasciare riposare per un paio di minuti e contare il cell numero.
10. Cellule posto a 25 centimetri ² palloni con una densità di 10.000 cellule / cm ² con alfa-MEM più AA / GP. Essere consapevoli del fatto che la densità cellulare è rilevante per lo sviluppo ottimale dei processi cellulari e contatti intercellulari. Una densità iniziale superiore a 10.000 cellule / cm ² compromette il corretto sviluppo di processi cellulari, ma il numero di cellule inferiori provocare la morte prematura delle cellule, a causa dell'assenza di contatti intercellulari.
11. Aggiungere 5 mM ATRA al mezzo ogni 24 ore.
12. Monitorare le cellule quotidianamente per valutare la morfologia: cambiamenti morfologici sono generalmente osservati dopo 48 ore. Se, dopo le prime 24-48 ore, le cellule sono ancora proliferano, replate alla densità sopra. Una popolazione omogenea di osteocytes matura è presente dopo 4-5 giorni. A seconda delle esigenze, utilizzare cellule in qualsiasi punto di tempo, fino a 12-15 giorni.
13. Quando le cellule vengono piastrate su altri supporti (come coprioggetto o piastre a pozzetti), assicurarsi che la densità sopra è mantenuta econtinuare ad aggiungere ATRA ogni 24 ore fino al momento dell'uso. Lasciare cellule di aderire al nuovo supporto per almeno 24 ore prima dell'esperimento.

3. Immunostaining

1. Per immunostaining, piastra le cellule su vetrini e seguire le metodologie stabilite (si veda ad esempio Burry ^15).
2. Ad esempio, per immunofluorescenza indiretta, fissare in paraformaldeide al 4% o acetone freddo, incubare sequenzialmente con l'anticorpo primario a temperatura ambiente per 1 ora in una camera umidificata, poi con l'anticorpo secondario marcato fluorescente al buio, a temperatura ambiente per 30 min, in una camera umidificata.
3. Utilizzare DAPI o analoghi per contrasto nucleare, e montare anti-fading medio.

4. Alizarina rossa colorazione e estrazione

1. Piastra le cellule su vetrini.
2. Fissare le cellule immergendo il vetrino in etanolo al 70% per 10 min.
3. Coprire le cellule con alcune gocce di soluzione colorante rosso alizarina (1 mg / ml, pH 5,5)per 30 minuti.
4. Lavare i coprioggetti con acqua di rubinetto. Montare con una goccia di glicerolo su vetrini e prendere le immagini utilizzando un microscopio verticale a 10X e 20X di ingrandimento.
5. Dopo la procedura di cui sopra, recuperare i coprioggetto immergendo i vetrini in acqua di rubinetto.
6. Mettere ogni vetrino in una piastra ben.
7. Aggiungere acido perclorico al 60% (la quantità deve essere sufficiente a coprire completamente le cellule) e lasciare O / N a 4 ° C con agitazione.
8. Leggere la densità ottica del surnatante mediante spettrofotometria a 450 nm.
9. Per normalizzare i valori per numero di cellule, aggiungere Janus verde (soluzione allo 0,2% in PBS) per coprire il preparato cellulare per 10 min.
10. Lavare accuratamente con acqua ultrapura.
11. Aggiungere 0,5 N HCl (la quantità deve essere sufficiente a coprire tutte le cellule) e agitare delicatamente a mano per pochi secondi.
12. Leggere l'assorbanza a 615 nm mediante spettrofotometria.

Risultati sono stati ottenuti da 5 a 10 esperimenti indipendenti.

Morfologia cellulare

AA / GP trattati con cellule primarie hanno caratteristiche prevalentemente di ciottoli simili, caratteristici degli osteoblasti maturi. Cellule ramificate intervallati (come indicato dalle frecce rosse in figura 1A) possono essere trovati, che probabilmente rappresentano alcuni osteocytes.

Con il trattamento ATRA, le cellule in rapida iniziare a visualizzare ramificazioni, che sono generalmente osservati dopo 2 giorni. Come mostrato nella Figura 1B, cellule ramificate richiedono uno spazio di estendere i loro dendriti. Poiché il trattamento con i proventi ATRA, ramificazioni progressivamente aumentano di numero e complessità, Figure 1C e 1D. La colorazione di actina filamentosa da phalloidin rodamina marcato evidenzia processi cellulari, che vengono etichettati da falloidina, Figura 2.

Matrix Produzione

osteoblasti primari producono grandi quantità di matrice calcificata, che si accumula sopra e tra le cellule e può essere visualizzato da alizarina colorazione rossa, figura 3A. Osteocytes non producono matrice extracellulare calcificata, ei risultati alizarina colorazione rossa completamente negativi nelle cellule ATRA-incubate, figura 3B. Di conseguenza, nessuna o una minima quantità di rosso alizarina possono essere misurati dopo la procedura di estrazione, Figura 3C.

Marcatori osteociti e Prodotti

Sclerostina è espressa dalle cellule trattate con ATRA, Figura 4. Immunocolorazione rivela intensa espressione citoplasmatica e la presenza di punti positivi lungo processi cellulari. Mediante immunofluorescenza, una forte positività FGF23 è rilevabile in cellule trattate con ATRA, figura 5, sia nel corpo cellulare o lungo processi cellulari.

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Figura 1. Microscopio ottico. Osteoblasti primari mostrano un aspetto cubico predominante dopo 5 giorni di incubazione con AA / GP (A) (bar scala di 100 micron). Cellule ramificate Sparse possono essere identificati (A) (frecce). Dopo 2 giorni di trattamento ATRA (B) (bar scala di 100 micron), le cellule mostrano una forma più allungata e dendriti appaiono chiaramente rilevabile. Solo le cellule arborized possono essere osservati dopo 5 giorni di incubazione ATRA (C) (bar scala di 100 micron), e sono più rilevabili a maggior ingrandimento (D) (barra della scala 50 micron).

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Figura 2. Actina filamenti colorazione. I filamenti di actina sono identificati mediante colorazione rodamina-falloidin. La figura mostra un risultato rappresentativo ottenuto da cellule trattate con ATRA per 3 giorni. Già a questo punto di tempo, actina filamentosa appare come una componente importante dello sviluppo di processi cellulari. Scala bar: 50 micron.

Figura 3. Depositi calcificati. Alizarin colorazione rosso è diffuso osservato in osteoblasti dopo 5 giorni di incubazione con AA / GP (A) (bar scala di 100 micron), mentre è negativo in cellule ATRA-incubate (B) (bar scala 50 micron). Una profonda differenza può essere misurata con SPECTroscopy dopo l'estrazione alizarina (C).

Figura 4. Sclerostina. Sclerostina positività è stata rilevata nel citoplasma e lungo processi cellulari di cellule incubate con ATRA (bar scala 50 pm).

Figura 5. FGF23. FGF23 immunoistochimica è intensa nelle cellule trattate con ATRA (barra della scala 50 micron).

Negli ultimi anni il osteociti è emerso come la cella più centrale nell'osso. Progressi della ricerca stanno progressivamente rivelando un certo numero di proprietà osteociti insospettabili o non provati, che sono di enorme valore per la progettazione di nuovi e migliore trattamento per una varietà di malattie delle ossa. Tuttavia, indagini di biologia osteociti è stato colpito dalla limitata disponibilità di modelli in vitro a tal punto che osteoblasti sono state usate come cellule surrogati per un lungo periodo prima che la linea cellulare osteociti simile MLO-Y4 è stato reso disponibile. Più recentemente, una linea cellulare condizionale immortalata è stato introdotto dallo stesso gruppo ^16, che può essere differenziata per ramificata osteocytes fine esprimendo sclerostin e FGF23. Anche se il valore estremo di queste linee cellulari non è in discussione, è molto ben noto che le cellule primarie assomigliano di più la situazione in vivo ed offrono la possibilità di ottenere osteocytes primaria franimali transgenici OM per eseguire studi funzionali sulle vie molecolari specifici.

Isolamento e coltura di osteociti primari, prima di ossa pulcino ^5,6 e successivamente di ratto e di topo ossa ^17,7, sono estremamente utili ma il loro isolamento genera solo un piccolo numero di cellule per procedura, e la purezza delle cellule dipende in larga misura sulla competenza individuale. Pertanto, il metodo è attualmente utilizzato solo da un numero limitato di laboratori.

Altri gruppi di ricerca hanno ottenuto osteocytes maturi inducendo la differenziazione terminale degli osteoblasti attraverso la progressiva inclusione nel tridimensionali matrici mineralizzate ^18,19, che costituiscono un ambiente più fisiologico, ma sono un ostacolo per applicazioni di ricerca successive. È vero che la mineralizzazione matrice ^20, così come bassa tensione di ossigeno ^21, sono trigger fisiologiche di osteociti maturazione. Tuttavia, un incontratohodology evitando queste due condizioni potrebbe aumentare fattibilità e estendere l'uso delle cellule. Il nostro metodo proposto ^10, che consiste nell'aggiungere acido retinoico maturare osteoblasti, è semplice, altamente riproducibile, ed evita cella trasfezione ²² o l'uso di costosi fattori di crescita ^23.

Con una serie di esperimenti preliminari, abbiamo determinato che il numero di cellule di partenza è un punto critico, condizionata corretta formazione di molteplici dendriti e contatti intercellulari. Una troppo elevata densità cellulare placcatura colpisce complessità ed estensione dei processi cellulari, mentre i numeri troppo bassi provocano la perdita di adesioni intercellulari, portando a sofferenza e morte cellulare.

È importante sottolineare che la regolazione di ATRA dosaggio e il monitoraggio quotidiano della morfologia delle cellule sono altamente raccomandato, a causa della variabilità intrinseca delle cellule primarie che possono influenzare la sensibilità ATRA. Questi aspetti possono diventare whe particolarmente rilevanten Il metodo si applica ai modelli transgenici.

Lo sviluppo di processi cellulari può essere monitorato mediante colorazione actina, perché dendriti sono ricche di actina filamentosa.

E 'ben noto che osteociti non producono matrice calcificata e ATRA incubazione abolisce rapidamente, come illustrato da una riduzione progressiva fino completa negatività di alizarina colorazione rossa. Nel frattempo, ATRA induce l'espressione di marcatori osteociti noti, in particolare sclerostina ^24, e garantisce la produzione di FGF23, un fattore di crescita fondamentale coinvolti nelle ossa e fosfato sistemica movimentazione ^25. Pertanto, ulteriori studi volti a indagare il ruolo funzionale di FGF23 e sclerostin in osteociti saranno facilitati dalla produzione endogena di queste molecole.

In sintesi, si dimostra che il trattamento con acido retinoico genera una popolazione omogenea di osteociti maturi dalle cellule calvaria primarie, larefore consentendo la preparazione semplice e rapida di osteociti sia wild type e animali transgenici. Rispetto ad altri metodi, il nostro protocollo sembra presentare diversi vantaggi, soprattutto la semplice applicazione e l'alta riproducibilità. Il processo di osteociti maturazione può essere studiato in un numero sufficiente di cellule dall'iniziale diffusione dei processi attraverso una serie di passaggi che si verificano in un telaio 5 giorni. Come ulteriore vantaggio, osteociti maturi si ottengono in totale assenza di circostante matrice mineralizzata, permettendo l'applicazione di saggi molecolari e funzionali illimitati.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il finanziamento è stato fornito da "Progetto di un concorso Fondazione IRCCS Ospedale Maggiore Policlinico 2009-2010" per MD, e Associazione Bambino Nefropatico ABN Onlus, Milano