Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

The ubiquitous second messenger c-di-GMP controls growth and behavior of many bacteria. We have developed a novel Capture Compound Mass Spectrometry based technology to biochemically identify and characterize c-di-GMP binding proteins in virtually any bacterial species.

Kayda değer bir ilerleme, ikinci haberci, c-di-GMP sentezi (diguanylate siklazlar) ve ayrışma (fosfodiesteraz) yer alan enzimler üzerindeki tanımı ve karakterizasyonu için doğru, son on yıl içinde yapılmıştır. Buna karşılık, az bilgi bu sinyal molekülü hücresel süreçlerin çeşitli bir yelpazede düzenleyen hangi aracılığıyla moleküler mekanizmalar ve hücresel bileşenleri ile ilgili mevcuttur. Bilinen efektör proteinlerin çoğu Pilz ailesine ait veya kataliz vazgeçmiş ve efektör fonksiyonunu benimsemiş diguanylate siklazlar veya fosfodiesterazları dejenere edilmektedir. Bu nedenle, daha iyi bir deneysel yöntemler siliko tahminler güvenilir başarısız olduğu için yeni etkenleri tanımlamak ve doğrulamak için gerekli olan bakterilerin geniş bir aralıkta hücre C-di-GMP ağ tanımlamak için kullanılır.

Biz son zamanlarda güçlü bir araç olarak bir roman Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre (MERNİS) tabanlı teknoloji geliştirdikbiyokimyasal tespit ve c-di-GMP bağlayıcı proteinler karakterize etmektedir. Bu teknik, daha önce organizmaların ¹ geniş uygulanabilir olduğu bildirilmiştir. Burada biz böyle sinyal bileşenlerini prob kullanan protokol ayrıntılı bir açıklamasını verir. Bir örnek olarak, Pseudomonas aeruginosa, C-di-GMP hastalık oluşturma ve biyofilm kontrolünde önemli bir rol oynadığı bir fırsatçı patojendir kullanın. MTSK C-di-GMP ağ bilinen ya da tahmin edilen bileşenlerin% 74 (38/51) tespit edilmiştir. Bu çalışma detaylı MTSK prosedürü açıklar ve küçük molekül sinyalizasyon dahil yeni bileşenleri tanımlamak için güçlü ve çok yönlü bir araç olarak kurar.

c-di-GMP onların büyüme ve davranış çeşitli yönlerini kontrol etmek için en bakteriler tarafından kullanılan bir anahtar ikinci habercidir. Örneğin, Cı-di-GMP hücre döngüsü ilerlemesini, motilite ve eksopolisakaridlerin ve yüzey adhesinler ^2-4 ekspresyonunu düzenler. Bu işlemler, koordinasyonu yoluyla, c-di-GMP biyofilm oluşumunu, patojenik bakterilerin ⁵ bir dizi kronik enfeksiyonlar ile ilişkili olan bir süreci desteklemektedir. c-di-GMP katalitik GGDEF alanı ⁴ liman diguanylate siklazlar (KEGM) olarak adlandırılan enzimler tarafından sentezlenmiş edilir. Bazı KEGM aşağı c-di-GMP bağlanması üzerine siklaz aktivitesini düzenleyen bir inhibitör sitesine sahip. C-di-GMP bozulması katalitik EAL veya HD-GYP ya etki ^6,7 barındıran fosfodiesteraz iki farklı sınıflarına (PDE) ile katalize edilmektedir.

doğrudan, c-di-GMP bağlayan bilinen efektör proteinlerin çoğunluğu protein sadece üç sınıftan birine ait: katalitiğimüttefiki inaktif GGDEF veya EAL etki ve Pilz alanları, c-di-GMP ⁸ bağlanması üzerine yapısal değişikliklere uğrarlar küçük moleküler anahtarlar. KEGM, KDD ve Pilz proteinleri iyi karakterize edilir ve onların etki nispeten güvenli silico tahmin edilebilir. Belirli bir ilgi şimdi c-di-GMP efektörlerinin yeni sınıfların belirlenmesi üzerine odaklanmıştır. Farklı bağlama motifleri ile Bazı c-di-GMP efektörleri Burkholderia cenocepacia CRP / FNR protein ailesi Bcam1349 veya P. transkripsiyonel regülatör FleQ olarak son zamanlarda böyle tarif edildi aeruginosa ^9,10. Buna ek olarak, c-di-cGMP-spesifik riboswitches son zamanlarda belirlenen ve bir C-di-GMP-bağımlı bir şekilde ¹¹ içinde gen ekspresyonunu kontrol etmek için gösterilmiştir. Farklı etkileyicilerin c-di-GMP bağlama motifleri sadece kötü korunmuş tür proteinlerin biyoinformatik tahminleri zor yapıyoruz. Bu sorunu çözmek için, bir C-di-GMP SPE kullanımına dayanan bir biyokimyasal yöntemler geliştirilmiştir, spesifik yakalama Bileşik kütle spektrometresi ^1,12,13 ile birlikte.

Biz son zamanlarda (CDG-CC, Şekil 1) yeni bir üç değerlikli c-di-GMP Yakalama Bileşik tasarladık ^1. Bu kimyasal iskele oluşmaktadır: bağlayıcı proteinleri, c-di-GMP yakalamak için yem olarak kullanılan 1), bir c-di-GMP kısım, 2) bir UV ışıkla reaktif grup bağlantı geçmek için kullanılan bağlı proteinlere CdG-CC ve 3) ise biotin streptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak çekilen proteinleri izole etmek. CdG-CC doğrudan olarak ve özellikle hücre lizatları gibi makromoleküllerin kompleks bir karışımdan, c-di-GMP efektör yakalamak için kullanılabilir. Yakalama Bileşik bazlı ve kimyasal proteomik temelli yaklaşımlar, daha önce organizmaların geniş bir yelpazede için geçerli olduğu bildirilmiştir, örneğin Caulobacter crescentus, Salmonella enterica serovar typhimurium ve S. aeruginosa ^1,14.

Bu metodolojik yazıda,Biz P. özler kullanılarak MTSK prosedürü derinliği açıklamasında bir sağlamak Örneğin, aeruginosa. Bu çalışma, biyokimyasal küçük molekül sinyalizasyon dahil yeni bileşenleri tanımlamak için güçlü ve çok yönlü bir araç olarak CCMS kurar.

1. Lizat Hazırlık

1. P büyütün İstenen OD LB aeruginosa hücreleri.
   NOT: rehberlik için: log fazı kültürleri için sabit faz kültürler için ≈ 100 ml kültür / örnek ve ≈ 500 ml cultur / örnek (OD _600Nm = 0.5) kullanın.
2. 5.000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj ile pelet.
3. Süspanse 0.5-1 1 mi liziz tamponunda pellet g (6.7 mM MES, 6.7 mM HEPES, 200 mM NaCI, 6.7 mM kaç, DDT, 1 mM, pH 7.5) ve proteaz inhibitörü (tam mini, EDTA-içermeyen) ekleyin de DNasel olarak.
4. Lyse 20.000 psi bir Fransız basınç hücresi ile 3 pasajlar ile hücre, (Malzeme listesi bakınız).
5. Ultra santrifüj 4 ° C 'de, 1 saat boyunca 100,000 x g'de hücre lizatı.
6. Süpernatant kaydedin (2. adıma gidin).
7. Yukarı ve aşağı pipetleme lizis tamponu 1x 1 ml pelet yıkayın.
8. Ultrasantrifüj işlemi, 4 ° C'de 1 saat boyunca 100,000 x g'de.
9. Pelet flaş dondurmaMembran proteinlerinin (adım 3) yakalanması için kullanılana kadar -20 ° C'de, sıvı azot ve saklayın.

C-di-GMP Ücretsiz ve Diğer Nükleotidlerinin 2. Temizleme (Çözünür Kesir Sadece)

1. Soğuk lisiz tampon maddesi içinde 10 ml bir PD10 tuz giderme kolonu (bakınız Materyaller listesi) yıkayın.
2. Nükleotidleri gidermek amacıyla PD10 süpernatanların (≈ 1 mi) dökün.
3. 4 ml soğuk lisiz tamponu (500 ul aşama) ile yıkayın.
4. Bradford tahlili ile saptandığı haliyle en yoğun fraksiyonlar seçin ve bunları bir araya getirirler.

3. Pelet Tekrar Süspansiyonu ve Çözme (Membran Kesir Sadece)

1. (Deterjan olmadan) 1x yakalama tamponu 500 ila 1000 ul pelletini tekrar (Tablo 1).
   NOT: pelet tekrar süspansiyon zordur. Kabaca iyi çözüm homojenize bir şırınga 27 G kullanmak için, sonra pelet tekrar süspansiyon bir pipet ile ilk pipet yukarı ve aşağı tavsiye edilir.
2. % 1 ekleyin (a / h) n-dodesil-β-D-maltopiranozit (DDİ).
3. Dönen bir tekerlek üzerinde, en azından 2 saat (ya da O / N), 4 ° C'de inkübe edilir.
4. Ultrasantrifüj işlemi, 4 ° C'de 1 saat boyunca 100,000 x g'de.
5. Süpernatant Hasat.

4. Protein Konsantrasyon Ölçümü

1. (Membran fraksiyonunun BCA deneyi ile) Bradford tahlili ile protein konsantrasyonu ölçülür.
2. 10 mg / ml toplam protein konsantrasyonunu belirleyin.

5. Yakalama

1. GSYİH GTP, ATP, CTP 1 mM ve 5x yakalama tamponu (100 mM HEPES, 250 mM Kac, 50 mM MgAc,% 5 gliserol, pH 7.5) (Tablo 1) 20 ul protein 300 ug karıştırın. H ₂ O ile 100 ul reaksiyon ses seviyesini ayarlama
   NOT: Toplam hacmi rekabet kontrol durumunda CdG-CC ve c-di-GMP seviyesini içerir (adım 5.3 ve Tablo 2).
   Not: tüm deneyler 200 ve gerçekleştirildi# 181; l 12-tüp PCR şeritler (Thermo Scientific).
   NOT: zar kısmı için, her zaman kritik misel konsantrasyonu 8 M Üre protein çözündürme aşamasına kadar (7.1 Adım) (w / v% 0.01) Yukarıdaki DDM konsantrasyonunu tutmak için emin olun.
2. Dönen bir tekerlek üzerinde, 30 dakika boyunca 4 ° C'de inkübe edilir.
3. 10 uM CdG-CC (nihai konsantrasyon) eklenir.
   NOT: ("boncuk kontrolü" olarak anılacaktır) CDG-CC olmayan bir denetim ve 1 mM c-di-GMP ("yarışma kontrolü") ile desteklenmiş bir denetim vardır (Tablo 2).
   NOT: CdG-CC konsantrasyonu 1 ile 10 uM kadar ayarlanabilir.
4. Karanlıkta, dönen bir tekerlek üzerinde, en az 2 saat (O / N membran fraksiyonu), 4 ° C'de inkübe edilir.
5. Bir CaproBox kullanarak 4 dakika UV ışığı ile CDG-CC reaktif parçasının aktivasyonu ile kısa bir sıkma, çapraz bağ, sonra (kaynak = 310 nm, Işınım ≥10 mW / cm², mesafe Malzemeleri Listesi görmek λ = 2 cm). NOT: şeritleri önce çapraz bağlama kapağını kaldırın.
6. Hafifçe homojenize, 25 ul 5x yıkama tamponu (5 M NaCl, 250 mM Tris, pH 7.5) yeniden süspansiyon haline getirilmiş ve de streptavidin manyetik taneleri 50 ul ekle.
7. Dönen bir tekerlek üzerinde 1 saat süre ile 4 ° C'de inkübe edilir.

6. Yıkama adımları

NOT: (Mıknatıs: Malzeme Listesi'ne bakın). Mıknatıs ile PCR şerit kapağı manyetik boncuk yakalama, ile başlayın. Ardından bir sonraki yıkama çözeltisi içeren yeni bir PCR şerit değiştirin. Mıknatısı çıkarın ve boncuklar tekrar süspansiyon ve 2 dakika inkübe. Spin ve taze kapakla kapağı değiştirin.

1. Yıkama adımları (çözünebilir fraksiyon için)
   1. 200 ul 1x yıkama tamponu 6 kez yıkayın.
   2. 200 ul HPLC dereceli H ₂ O bir kez yıkayın
   3. 200 ul% 80 asetonitril içinde 6 kez yıkayın.
   4. 200 ul HPLC dereceli H ₂ O 2 kez yıkayın
2. Yıkama adımları (membrane fraksiyonu sadece)
   1. +% 0.1 DDM 200 ul 1x yıkama tamponu içinde 5 kez yıkayın.
   2. + 0.05% DDM 200 ul 1x yıkama tamponu 2 kez yıkayın.
   3. +% 0.025 DDM 200 ul 1x yıkama tamponu kez yıkayın.
   4. + 0.0125% DDM 200 ul 1x yıkama tamponu kez yıkayın.
   5. 200 ul 100 mM ABC 3 kez yıkayın (amonyum bikarbonat, NH ₄ CO ₃₎ + 2 M Üre.

7. MS Numune Hazırlama

1. 20 ul 100 mM ABC (membran fraksiyonu için + 8 M Üre 100 mM ABC) 'de (doğrudan kapakta) boncuk süspanse ve 1.5 ml tüpler içine aktarın.
2. Membran fraksiyonu, sadece 500 rpm'de çalkalanarak, 5 dakika boyunca 60 ° C'de inkübe edin.
3. 200 mM TCEP (tris (2-karboksietil) fosfin) ul 0.5 ekleyin ve 500 rpm 'de çalkalanarak 1 saat boyunca 60 ° C'de inkübe edin. 25 ° C'ye kadar soğutun.
4. Bir çalkalama, iyodoasetamid, taze hazırlanmış 400 mM, 0.5 ul ilave edilir ve 30 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe500 rpm ve karanlıkta t.
5. 0.5 ul 0.5 M N-asetil-sistein ilave edin ve 500 rpm'de çalkalanarak, 10 dakika boyunca 25 ° C'de inkübe edin.
6. Membran fraksiyonu, sadece: 1 ul Lys-C ekleyin ve 37 ° C, O / N inkübe edin.
7. 2 ug tripsin ekleyin ve 500 rpm (kurumasını önlemek için Parafilm olarak şal) sallayarak, 37 ° C'de O / N kuluçkaya yatmaktadır.
   Not: örnekler, bu aşamada -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.
   NOT: Membran fraksiyon sadece: tripsin eklenmesinden önce <2 M'ye üre konsantrasyonunu ayarlamak için 100 mM ABC ekleyin.
8. Kısaca tüpler aşağı spin ve mıknatıs ile boncuk toplamak.
9. Yeni 1.5 ml tüp içine süpernatant aktarın (boncuk bırakılırsa bu adımı tekrarlayın).
10. 5 ul% 5 TFA (trifloroasetik asit) + 1 ul 2 M HCI (membran fraksiyonunun 15 ul% 5 TFA + 5 ul 2 M HCI) ekleyin.
11. Durum C18 MicroSpin sütunları ul asetonitril 150 ile (Nest Grubu, MA, ABD) (spin 2,400 rpm'de 20 sn).
12. Equi% 0.1 TFA (spin 20 sn, 2.400 rpm) ul C18 sütunlar, 150 ile 2 kez librate.
13. Örnek yükleyin ve 2 dakika, 2.000 rpm döndürün.
14. Akış yoluyla kolonuna yükleyin ve sıkma aşamasına (2 dakika, 2000 rpm), tekrarlayın.
15. % 0.1 TFA ul 150 ile 3 kez yıkanır,% 5 asetonitril (20 sn, 2400 rpm).
16. Yeni bir tüp ve 150 ul% 0.1 TFA ile iki kez elüte,% 50 asetonitril (2 dakika, 2000 rpm).
17. Hızlı Vac peptidler kurulayın.
18. 40 ul% 98 _H2O,% 2 asetonitril,% 0.15 formik asit içinde süspanse.
19. Sonikasyon 20 sn (darbe döngüsü 0.5, genlik 100%; Malzeme Listesi) ve 5 sn, 12.000 rpm (tezgah üstü santrifüj) aşağı doğru döndürün. Vortex 10 sn ve 5 sn, 12.000 rpm aşağı doğru döndürün. LC-MS / MS analizi için bir HPLC vialinde aktarın.
20. -20 ° C'de dondurun.
    Not: örnekler, bu aşamada -20 ° C 'de muhafaza edilebilir.

8. LC-MS / MS Analizi

1. Nano-LC çalıştırın (nano-LC sistemleri) equippBir RP-HPLC kolonuna (75 mm x 37 cm) C18 reçine ile dolu olan baskı (sihirli C18 AQ 3 um),% 95 çözücü A'dan (% 0.15 formik asit,% 2 asetonitril) ile% 5 solvent B bir doğrusal eğimi kullanılarak ( 0.2 ul / dk'lık bir akış oranında 60 dakika boyunca% 35 çözücü B için% 98 asetonitril,% 0.15 formik asit).
2. (Elektropüskürtmeli bir iyon kaynağı ile bağlanmış bir çift basınç LTQ-Orbitrap Velos kütle spektrometresi), LC-MS / MS kullanılarak peptidleri analiz edin.
   NOT: veri toplama modu MS 20 en yoğun iyonların doğrusal iyon tuzağı MS / MS taramaları ardından 60.000 FWHM çözünürlükte kütle spektrometresi FT bölümünde tarama bir yüksek çözünürlük elde etmek için kurulmuştur. MS / MS girişimleri verimliliğini artırmak için, ücret devlet tarama modus atanmamış dışlamak için etkin ve tek iyonları şarj edildi. Haberci 100 iyon sayıları aşıldığında Hile bağlı ayrışma tetikledi. Dinamik dışlama süresi 30 saniye olarak ayarlandı. iyon birikimi süresi 300 ms (MS) ve 50 olarak ayarlandımilisaniye (MS / MS).

9. Veritabanı Arama

1. P İndir aeruginosa NCBI-veritabanı NCBI ana aracılığı ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ).
2. MassMatrix dönüştürme aracı (kullanarak maskotu jenerik dosyalarının içine MS ham spektrumları (mgf) dönüştürün http://www.massmatrix.net/mm-cgi/downloads.py ).
3. P. karşı MASCOT sürüm 2.3 kullanarak bu mgf dosyasını ara İleri içeren ve ters-tuzak protein girişleri aeruginosa NCBI-veritabanı.
4. İki tam Triptik peptitler de bölünmelere cevapsız tolere (prolin ardından sürece) lisin ve arginin sonra siliko tripsin sindirim bir gerçekleştirin.
5. Değişken değişiklikler ve sabit modifikasyon gibi sistein kalıntısı carboxyamidomethylation (+57.021464 Da) olarak oksitlenmiş metioninler (15,99491 Da) izin veritabanı arama parametrelerini ayarlayın. MASCOT bizi arar İçinyüksek çözünürlüklü taramalar ing, 15 ppm habercisi kitle toleransını ayarlamak ve Da 0.6 fragmanı kitle toleransını ayarlayın. Son olarak,% 1 protein FDR ayarlayın.
6. P. Maskot aramalar İthalat İskele (Proteomesoftware, Versiyon 3) içine aeruginosa MTSK deneyleri,% 1 protein FDR yakın edinmek ve toplam spektral sayıları ayıklamak için parametrelerini ayarlamak.
7. Temsilcisi sonuçları bu çalışmada sunulan için, rekabet kontrolü ile deney karşılaştırmak için eşleştirilmiş t testi kullanıldı ve sadece 0.1 altında bir p değeri ve 2 (spektral sayıları deneme / yarışma kontrol spektral üzerinde spektral sayım oranı ile hit kabul sayımları).
8. Veriler daha fazla analiz için herhangi bir elektronik tablo yazılımı ihraç edilebilir.

10. Etiket serbest Niceleme

1. Progenesis LC-MS yazılımı (Doğrusal Olmayan Dinamikleri, Sürüm 4.0) içine çiğ dosyalarını içe aktarın.
2. Varsayılan Setti LC-MS hizalama ve özellik algılama gerçekleştirinNGS.
3. Progenesis LC-MS mgf formatında veri ihracat.
4. NCBI P. karşı maskotu kullanan MS / MS spektrumları ara İleri içeren ve ters-tuzak protein girişleri aeruginosa veritabanı.
5. Progenesis LC-MS içine veritabanı arama sonuçlarını İthalat ve MS1 özellikleri peptidler kimlik haritası.
6. (: 0.1 altında q değeri, 2 üzeri spektral sayım oranı eşiği) veri değerlendirme (anlamlılık düzeylerinin hesaplanmasında, kat-değişim oranları) için SafeQuant ve ProteinSQAnalysis komut kullanılmıştır.

P. roman c--di-GMP efektörler belirlemek için aeruginosa sistematik P. Çözünür ve zar fraksiyonları analiz etmek için kullanılan CCMS Bir günlük faz kültüründen aeruginosa suşu PAO1 (= 0.5 OD _600). Burada özetlemek ve bu balıkçı sefer temsili sonuçlarını tartışmak. Dört bağımsız biyolojik kopyaları kullanılmıştır. Her deney için, iki farklı CdG-CC konsantrasyonu (5 uM, 10 uM) kullanılmıştır. Özgüllük için prob için, deneyler (Tablo 1) (örneğin, CdG-CC olmadan) bir kordon kontrolü ile, son olarak da, 1 mM rakip olarak c-di-GMP ve varlığı ya da yokluğu içinde gerçekleştirilmiştir.

(Şekil 2), yukarıda detaylı olarak tarif edilen yöntem, aşağıdaki zaman bir iskele biçimde ele proteinlerin bir listesi üretilir. Olası kirletici çıkarıldı. Bu ribozomal proteinler, streptavidin, tripsin, serum albümin, keratin ve diğer insan proteinleri içermektedir. proteinkimlik yanlış keşif oranı (FDR) İskele yazılımını kullanarak% 1 ayarlandı ve veri excel ihraç. İskele tarafından sağlanan erişim numarası Excel'de DÜŞEYARA fonksiyonunu kullanarak eğrisi numaraları dönüştürülebilir P. listesine bağlı aeruginosa odağı numaraları. Bu aşamada, isabet listesi çözünür kısmı için 768 protein ve membran kısmı için 433 proteinleri içerir. Ancak, çoğu proteinler anlamlı yakalama deneyinde zenginleştirilmiş değildir. Bu nedenle, muhtemelen spesifik olmayan yakalanır proteinler (boncuk kontrol pozitif veya sadece C-di-GMP yarışmacının varlığında) uzaklaştırılmıştır. Biz iki daha büyük bir oran ile yakalama deney ve rekabet kontrol ve sadece kabul proteinler arasında bir spektral sayım oranı hesaplanır. Ayrıca biz yakalama deney ve rekabet kontrol arasında bir anlam ölçüsünü sağlamak ve 0.1 keyfi eşiğini ayarlamak için spektral sayıları bir eşleştirilmiş t-testi kullanılmıştır. Son olarak, Hep birlikte alınan 2 yakalama bileşik konsantrasyonu için dört deneyde de, tanımlanmış en az dört peptidin sadece sağlam, hitler olarak hesaba. Bu kriterler ihtiyaçlarına göre ve doğrulanmış kullanarak ayarlanabilir ve c-di-GMP eşiğini ayarlamak için standart olarak bağlayıcı proteinlerin tahmin edilmelidir. Sıralama sonra, liste çözünür kısmı için 76 hit, ve membran kısmı için 133 proteinlere düşmüştür. Bu durum, çözünür 13 ve P ile 21 zar proteinleri dahil bilinen veya c-di-GMP (Tablo 2) bağlamak için öngörülen aeruginosa. Diğer çözünür 63 ve 112 zar proteinlerinin bilinen c-di-GMP bağlayıcı alanların birini içermeyen yeni varsayılan C-di-GMP bağlayıcı proteinlerdir. Bu hit onların spesifik c-di-GMP bağlanması test ederek valide şimdi var.

Bir önceki ekrana biz GlyA2 (PA2444), GlyA3 (PA4602) ve Gsp69 (PA1127) ¹ avlanır. Bu 3 proteinler, klonlanmış aşın ve saflaştırılmıştırE. coli ve ³³ P ile UV-çapraz bağlama deneylerinde c-di-GMP bağlamak için valide olabilir c-di-GMP ¹⁵ etiketli. _Kd s gerçekten yeni efektörler CCMS kullanılarak tespit edilebildiğini göstermektedir, sırasıyla 1.0, 2.0 ve 6.9 uM olduğu saptanmıştır.

Bu temsili örneğe ek olarak, değişik büyüme koşulları ile ilgili toplanan hücre özleri ve çeşitli hücre içi c-di-GMP konsantrasyonlarında (n = 24) ile birlikte, CCMS kullanılır. Genel bilinen 74% (38/51) yakalanan veya P. tahmin aeruginosa PAO1 C-di-GMP sinyal bileşenleri (24/32 çözünür proteinler, 14/19 membran proteinleri). Bu genlerin en az dokuz özel koşullar (oksidatif stres, çoğunluğu algılama, biyofilm) ¹⁶ altında transkripsiyonu gösterilmiştir göz önüne alındığında ve bazı tüm c-di-GMP bağlamaz ki, kapsama bu derece doygunluk yakın olabilir. Birlikte gözlem ile bu ki w bu bileşenlerin çoğuere yüksek özgüllük (Tablo 2) ile yakalanan şiddetle bu tekniğin etkili ve güçlü olduğunu savunuyor.

Şekil 1: C-di-GMP Yakalama bileşiğin kimyasal yapısı.

Şekil 2:. MTSK iş akışı özeti mekanik parçalanmasından sonra serbest nükleotidler bir PD10 dışlama kolon kullanılarak kaldırılır. Ya çözünebilir veya membran fraksiyonlarından Proteinler CdG-CC ile inkübe edilir ve karışım, çapraz bağ yakalanan proteinler, UV ışımasına maruz bırakılır. Sert yıkama Adımlar kaplı manyetik boncuk streptavidin bağlı bileşikler ile yapılmaktadır. Açık-boncuk triptik sindirme peptidleri içerir,Daha sonra boncuk ayrılır ve onların kütle spektrometresi tanımlanması için proton olan. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Şekil 3: P. Volcanoplots aeruginosa proteinleri önemli ölçüde CCMS tarafından zenginleştirilmiş. Metinde tarif edildiği gibi LC-MS / MS analizi ve etiket içermeyen miktar sonra, proteinler sıralanır. Yakalama ve rekabet deneyleri arasında saptanan peptid log2-yoğunluk oranı hesaplanır ve önemi analizi (modifiye t-istatistik, ampirik Bayes yöntemi ¹⁷⁾ elde edilen değerlere karşı çizilmiştir. P-değerleri <0.05 ve yoğunluk oranları> için anlam eşik dahilinde Proteinler 1.5 kat işaret değerleri vardırgri bir kutuda paketlenirler. 4, çözünebilir fraksiyon (A) ve membran fraksiyonunun (B), 10 uM C-di-GMP-KK varlığında yapılır ve 1 mM, c-di-GMP ile rekabet deneyi için çoğaltır. daire içine noktalar bilinen c-di-GMP bağlayıcı proteinlere karşılık gelmektedir. rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.

Tablo 1:. Tamponlar kompozisyon, kimyasal ve tedarikçilerin kompozisyon Özeti tamponlar. C-di-GMP yakalama bileşiği (rekabet kontrol), c-di-GMP streptavidin kaplı manyetik boncuklar, yakalama tampon ve yıkama tamponu caproKit dahildir.

Tablo 2:. Boncuk kontrolü için, reaksiyon karışımı yakalama Reaksiyon karışımı Özeti (örneğin yakalama bileşik olmadan), (c-di-GMP-CC), yakalama deneyi ve c- çok fazla miktarda içeren yarışma kontrolü di-GMP. C-di-GMP-CC nihai konsantrasyon ayarlanabilir, ve tipik olarak 5 ve 10 uM arasında yer almaktadır.

Tablo 3: P. metinde tarif edildiği gibi spesifik olarak ele bileşenleri işaret aeruginosa bilinen c-di-GMP. Tespit proteinler önce sıralanmış. Proteinler kendi adını ve odağı numarası ile özdeşleşmiş, ve biz onların mimari yakalama özgüllük ve tekrarlanabilirlik göstermek için (n = 4, CDG-CC = 5 uM veya 10 uM) NCBI Korunmuş Alan Veritabanı online araç ile tahmin işaret vardır Yöntemin.

Özel dikkat protokolünün çeşitli adımlarda alınmalıdır. Protein konsantrasyonu, 10 mg bir konsantrasyonda olan kritik bir parametredir / ml hücreleri özel büyüme koşulları altında (örneğin, biyofilm veya küçük koloni varyantları) altında yetiştirilir zaman erişilmesi zor olan. Bu nedenle, pelet yeniden süspansiyon lisis tamponu düşük bir hacme yapılmalıdır. Protein konsantrasyonları, 8 mg / ml'ye kadar azaltılabilir. Nesper ve diğ. ¹ tarafından yayınlanan yönteme karşılaştırıldığında, nükleotid bağlama proteinlerinin spesifik olmayan yakalama en aza indirmek için yakalama reaksiyonuna çeşitli nükleotidini ilave edildi. Nükleotidlerin eklenmesi özgüllük geliştirilmiş olsa da, aynı zamanda, aynı yerde farklı nükleotidleri bağlanan proteinlerin yakalama engelleyebilir. Örneğin, son olarak efektör FleQ, ATP bağlanma ve c-di-GMP ¹⁸ d artık daha önceki deney ^1'de ATP olmadığında özel olarak avlanır değil, o andakiata ATP bir fazlalığın mevcudiyeti içinde burada açıklanmıştır.

CdG-CC dikkatli bir şekilde ışıktan korunmalıdır. Ortam ışığı UV bölgesinin sadece küçük bir kısmını ihtiva etse de, alüminyum folyo içine sarılmış yakalama bileşik stokları, hem UV ışıması tarafından aktive edilmeden önce yakalama karışımı tutulması tavsiye edilir. takip yıkama adımları yakalanan proteinler kovalent CDG-CC bağlı olarak, özgüllüğünün artırmak için çok sıkı olabilir. LC-MS / MS analizi ile ilgili olarak, deneyler, temiz bir keratin ortamda yapılmalıdır. Ayrıca, HPLC uyumlu tamponlar, özellikle yıkama aşamalarından sonra, kullanılmalıdır. aday listesi, tipik olarak çoğaltır (örnek olarak Tablo 2 'ye bakınız) arasında düşük varyasyonlarıyla (bir dört kat için) 300 ila 800 proteinleri içerir.

Protein ve CDG-CC konsantrasyonu gibi bazı parametreler organizmalar bağlı olarak optimize edilmesi gerekebilirnalyzed. Sadece belirli koşullar altında ifade düşük bol protein ya da protein kolaylıkla atlanabilir yana, bakım kullanılan kültür koşullarına ilişkin alınmalıdır. Bu sorun, aynı kültür koşulları için toplanan küresel protein ATLAS bulunanlar listesine karşılaştırarak aşılabilir. Bu zar proteinleri çözmek için yeteneği açısından optimize edilmesi gerekmektedir ve aynı zamanda MS uyumlu olması gerekir Son olarak, deterjan optimizasyonu, zor olabilir.

Bir de iskele geri kalanı için bir riboz 2'OH grubu yoluyla bağlanmış olarak CC c-di-GMP molekülü kimyasal, modifiye olduğunu akılda tutmak gerekiyor. Bu değişiklik ve böylece yanlış negatif veren bazı efektörlere bağlanma yeteneğini değiştirebilir. Bu bağlamda biz bir EAL etki taşımazlar, ancak P. bir GGDEF alanı eksikliği proteinleri yakalanan asla dikkat çekicidir aeruginosa, EAL proteinler Caul gibi, diğer türler yakalanan rağmenobacter crescentus. Bu, kötü bir erişim ya da bağlanma bölgesine veya EAL proteinleri tarafından CdG-CC bozunmasına CdG-CC düşük afiniteli bir nedeni olabilir. Bunun aksine, çok sayıda nükleotid bağlayıcı proteinler, büyük bir dereceye kadar, muhtemelen yanlış pozitif olan bir nispeten düşük özgünlüğü çekilir ve edildi. Örneğin DRaCALA ²⁰ gibi teknikler kullanılarak C-di-GMP spesifik olarak daha fazla doğrulama UV ¹⁵ çapraz-bağlama, diferansiyel tarama fluorimetry (DSF) ^21, Mikro Termoforosis (MST) ^22, izotermal kalorimetrisi (ITC) ^23-24 ve ... böylece gerekli.

Bu yakalama bileşiğinin C-di-GMP parçasının bir kısmı hücre lizatından fosfodiesteraz ile indirgenir ve bu da mümkündür. Bu nedenle, çapraz bağlanma öncesi fosfodiesterazlar aktivitesi sınırlayıcı prosedür 4 ° C'de gerçekleştirilmesi gereken nedenlerinden biridir.

proceduyeniden bir çok bakteri türleri adapte edilebilir ve başarılı bir şekilde çok küçük değişikliklerle ¹ ile 3 farklı bakteri türü için kullanılmıştır. Yakalama Bileşik tabanlı teknoloji ayrıntılı yıkama ile yanlış-pozitif azaltabilir (örneğin, 1 M tuz, yüksek deterjan konsantrasyonu, zar proteinleri,% 80 asetonitril olması durumunda, 2 M üre) kovalent bağlanma dayanmamaktadır diğer teknikler ile karşılaştırıldığında. Adayların doğrulama sıkıcı ve zaman alıcı bir süreç olabilir göz önüne alındığında, bu esaslı kimyasal proteomik gibi alternatif yöntemlere büyük bir avantaj ¹⁴ yaklaşımları olduğunu.

Bu resimli görüntü yöntemi belirlemek ve küçük molekül sinyalizasyon dahil yeni bileşenleri karakterize için güçlü ve çok yönlü bir araç olarak CCMS kurar. Gelecekte diğer seçicilik grupları barındıran benzer yakalama bileşikler, yeni C-di-AMP efektör olarak küçük moleküllü sinyal vermesine dahil proteinleri, yakalamak için kullanılabilir.

The authors have nothing to disclose.

We thank Alberto Reinders for his work in optimizing the CCMS conditions for P. aeruginosa. We also thank Pablo Manfredifor the annotation of the P. aeruginosa proteins. This work was supported by the Swiss National Science Foundation (SNF) Sinergia grant CRSII3_127433.