Method Article
Kırık iyileşmesi kemik progenitör fonksiyonunun kantitatif ölçümü yüksek çözünürlüklü seri görüntüleme teknolojisini gerektirir. Burada, protokoller görseli sırayla ve kemik kırığı tamir sürecinde endojen osteojenik kök / progenitör hücrelerin hareketi, çoğalması ve farklılaşması ölçmek için intravital mikroskopisi ve osteo-dizi izleme kullanarak verilmiştir.
Kemik sürekli devrediyor ve yüksek rejeneratif yaralanma takip ediyor. Osteojenik kök / progenitor hücreler uzun zaman var olduğu öne sürülmüştür, ancak bu hücrelerin in vivo gösteri ancak son zamanlarda elde edilmiştir. Burada, in vivo görüntüleme teknikleri, endojen osteojenik kök / progenitör hücrelerin rolünü (OSPCs) ve kemik tamir kendi soyu araştırmak için temin edilmiştir. Modelleri ve kalvarial kemik uyarılan mesafeli mikro Intravital görüntüleme izleme osteo-soy hücre kullanarak, OSPCs doğrudan erken onarım sürecinde kritik olaylar meydana geldiği yaralanma sonrası ilk birkaç gün boyunca görülebilir. Yaralanma siteleri sırayla OSPCs, yaralanma taşınmaya sayısındaki artış ve kemik oluşturan osteoblastlar farklılaştığı ortaya görüntülü olabilir. Bu yöntemler kemik rejenerasyonu ve onarımı için kök hücre-içsel ve dışsal moleküler düzenleyicilerin rolünü araştıran bir araç sunuyoruz.
Dejeneratif kemik hastalıkları ve osteoporotik kırık riski yüksek yol yaşa bağlı kemik kaybı halk sağlığı 1 önemli bir sorun haline gelmiştir. Kemik bakım kemik oluşturucu osteoblastlar ve kemik erimesi ile ilgili osteoklastı tarafından kontrol edilir. Kemik oluşturan hücreler kusurlar, yaşa bağlı kemik kaybı, dejeneratif kemik hastalıkları 2,3 bir ana nedenidir. Kapsamlı araştırma kırık iyileşme iyileştirilmesi odaklanmış olsa da, güvenilir ilaçların keşfi dejeneratif kemik hastalıkları tedavi ve osteoporotik kırıkların zayıflığını tersine çevirmek için önemli bir sorun olmaya devam etmek. Böylece, kemik rejenerasyonu ve onarımı, kemik oluşturan hücreler ve onların denetim mekanizmalarının kaynağını inceleyerek iskelet yenilenmesini artırmak ve kemik kaybı hastalıkları tersine çevirmek için yeni bir fikir verir.
Kemik iliğinde multipotent mezenkimal hücrelerin varlığı clonogenic popülasyonlarının tanımlanması göre önerilmiştir ki farklı olabilirOsteogenik içine sokularak, adipogenic ve kondrojenik soylar ex vivo 4.. Son zamanlarda birçok çalışma iskelet / mezenkimal kök hücreler (DGM / MKH) osteoblast bir doğal kaynaktır ve kemik döngüsü, yeniden ve kırık onarımı 5,6 için kritik olduğunu bildirdi . Buna ek olarak, bizim soy izleme çalışması olgun osteoblastlar beklenmedik bir şekilde kısa yarı ömrü (~ 60 gün) var ve sürekli olarak normal homeostatik ve kırık tamiri koşullarda 6 hem kendi kök / progenitör hücreler tarafından doldurulan olduğunu ortaya çıkardı. Bununla birlikte, in vivo kök hücre kimliği ve ne kadar bu gibi hücreler yaralanma parçalanması ve kemik oluşturan hücreler, belirsiz arz tepki. Bu nedenle, fizyolojik şartlar altında göç, çoğalmasını ve endojen DGM'ler / MKH'lerin farklılaşmasını analiz edebilir bir yöntem geliştirmek için önemlidir.
Kırık onarımı karmaşık bir dizi ile düzenlenen bir çok selüler ve dinamik bir süreçtirsitokinler ve büyüme faktörleri 7. Kırık çalışmaları için en popüler yaklaşım, uzun kemik kırığı olan bir hayvan modeli kullanmak ve kemik kesit ve imünoflöresan teknikleri 8-10 tarafından kemikleri analiz etmektir. Bu onarım işlemi mikro CT 11, yakın kızıl ötesi floresan 12 ve 13 kemilüminesans görüntüleme de dahil olmak üzere birden fazla görüntüleme teknikleri ile izlenebilir. Bununla birlikte, her bir teknik belirli sınırlamaları vardır ve in vivo olarak hücresel düzeyde DGM / MSC fonksiyonu izlemek için etkili bir yolu olmuştur. Son zamanlarda, konfokal / iki foton İntra vital mikroskopik geliştirilen ve hayvanlara 14, canlı da tek hücreli çözünürlükte kemik iliği mikro-bağlamında nakledilen kanser hücreleri ve hematopoietik kök hücreleri tespit etmek için kullanılmıştır. Soy izleme modelleri bir dizi ile bu teknolojiyi birleştirerek, osteojenik kök / progenitör hücreler genetik geçici ac ile işaretlenmiş olabilir tanımlamak başardıkmyxovirus direnç -1 (MX1) promoteri ve MX1 kaynaklı progenitörlerin tivasyon zaman içinde olgun osteoblastların çoğunluğu koruyabilir ama yetişkin fare 6 kondrositlerin nesil katılmazlar. Buna ek olarak, MX1 etiketli OSPCs kırık iyileşmesi 6 yeni osteoblastların çoğunluğu kaynağı olduğunu gösterdi.
Burada, osteo-dizi izleme modelleri ve intravital mikroskopi kullanılarak, bir protokol kırık onarımında MX1 + osteojenik kök / projenitör hücrelerin in vivo kinetiklerini belirlemek için sağlanır. Bu protokol kırık siteleri içine osteojenik kök / atalarıdır tehcir ve erken onarım süreci osteoprogenitör genişleme kantitatif ölçümünü izlemek için sıralı görüntüleme sunar. Bu yaklaşım, kemik onarım iyileştirmek için tedavi adayların değerlendirilmesi dahil olmak üzere birden bağlamlarda yararlı olabilir.
1.. Fareler ve Önkoşullama
Not: Tüm fareler patojen-serbest koşullarda muhafaza ve tüm protokolleri Massachusetts Genel Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Tüm cerrahi otoklava steril ekipman kullanılarak steril koşullarda yapılmalıdır. MX1-Cre 15, Rosa26-loxp-stop-loxp-EYFP (Rosa-YFP), ve Rosa26-loxp-stop-loxp-tdTomato (Rosa-Domates) idi Jackson Laboratories'den satın alınmıştır. Osteokalsin-GFP farenin Henry Kronenberg tarafından temin edildi. In vivo OSPC göç ve çoğalması kantitatif analiz için, MX1-Cre + Rosa-YFP + (tek renk-muhabir) fareler kullanıldı. Osteokalsin + olgun osteoblast onların farklılaşma daha ayrıntılı izleme için, kullanılan trigenic MX1-Cre + Rosa-Domates + Ocn-GFP +fareler.
2. Mohazirligi kullanın
3.. Mikrokırık Yaralanma
4. Intravital Görüntüleme
5.. Mesaj Operasyon Prosedürleri
Stabilize uzun kemik kırığı modeli kırık çalışmalarda popüler olmuştur. Ancak, uzun kemik kırığı veya büyük modeller birden fazla doku hasarına neden olabilir ve bu nedenle, kemik hücre fonksiyonu kantitatif ölçümü bir sınırlama var. Biz iğne delme (Şekil 1A-1C) ile kalvarial frontal kemiklerin üzerinde bir minimal invaziv yaralanma (dura mater içine az veya hiç işgali ile en az 1 mm çap) geliştirdi. Bu kemik (diğer dokuların müdahalesi olmadan net yaralı kemik görüntüleme, kemik hücreleri ve damarsal izin, kemik iliği ile düz ve ince kemik yapısına sahiptir çünkü mikro-kırık in vivo canlı görüntüleme için Kalvaryal frontal kemiklerin bir üst görünüşünü seçti Şekil 1C). Bu mikrofraktür mineral birikimi ve yeni kemik oluşumu (veriler gösterilmemiştir), ardından yumuşak bir yara dokusu formasyonu da dahil olmak üzere geniş bir kırılma yaralanma birçok özelliklere tekrarıdır görülmektedir.
MX1 + osteojenik kök progenitör hücrelerin in vivo görüntüleme "> Sıralı. Bu yöntem kırık iyileşmesi sırasında belirli bir osteojenik hücre popülasyonu izleme yeteneğine sahip olup olmadığını Biz sonraki test. Önce, tarafından trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP çift muhabiri fareler geliştirdi Rosa26-Domates muhabir ve osteokalsin-GFP farelerde (Şekil 2A) ile MX1-Cre fareler kapısı 6.. Bu modelin avantajı osteojenik kök / atalarıdır ve olgun osteoblastlar diferansiyel etiketleme olduğunu. PIPC idaresi tarafından, MX1 + OSPCs özel etiketli domates ifade ile, olgun osteoblastlar MX1 kaynaklı OSPCs ayırt oysa Domates ve GFP ifade. MX1 gelen Ancak, önceden varolan osteoblastlar ve olgun osteoblastlar olmayan uyarılabilir atalarıdır (Şekil 2B) yalnız GFP ifade. ışınlama ve kemik iliği değiştirildikten sonra, biz homoBu farelerin frontal kemikler üzerinde iki mikro çatlaklar ×. Her kırık alanı bizim 30x amacı ile görüş tek bir alan tarafından tespit edildiğini doğruladı. Mikro-kırık Sıralı 3D-İntravital görüntüleme günde 2 kırık ve 5. günde kendi genişleme sitesinde Domates + OSPCs tehcir gösterdi. Hiçbir veya belirlenemeyen GFP + osteoblast bu zamanda vardı. 12. günde, kırılma yüzeyine yakın osteoprogenitors bir alt osteoblastlar (Domates + GFP +) farklılaşmasını başlattı. Daha sonra, yeni Osteoblastlann birikimi ve (mavi ikinci harmonik üretimi ile analiz) yeni kemik oluşumu osteogenik progenitör hücrelerin göç ve çoğalması kırık iyileşmesi (Şekil katılan yeni osteoblastları tedarik için önemli bir mekanizma olduğunu belirten, 21. günde belli idi 2C).Kırık onarım osteojenik kök / atalarıdır kinetiği. Te içinst bizim yöntem kırık iyileşmesi sırasında osteoprogenitör numaraları tutarlı ve kantitatif çıkışı sağlar mı, basit bir soy izleme model olarak Mx1/YFP fare kullanılır ve erken kırık onarımında MX1 + OSPCs izlenir. MX1 + kemik iliği hücreleri vahşi tip iliği tarafından değiştirildi sonra, biz Mx1/YFP fare kafatası üzerinde altı bağımsız mikro çatlaklar (iki / fare) oluşturulur. Mx1/YFP + OSPCs yaralanma sonrası 14 gün boyunca takip edildiğinde, biz sürekli atalarıdır küçük sayılar tarafından 3 gün yaralanma yerinde tespit edildiği gözlenmiştir. Sayılar sürekli olarak 10. günde en yüksek nüfus ulaşan ve 14 gün (Şekil 3A) ile sürdürmek, 7. günde artmıştır. Biz YFP sinyal yoğunluğu (görüntü işleme ve ImageJ programı ile analiz) ölçerek osteoprogenitör sayılar kinetik sayılabilir. Biz bizim yaklaşımımız (Şekil 3B) tutarlılık düşündüren, benzer bir çıkışı ile bu deneyi tekrarladı.
ss = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always">
Fare (CS) koronal ve sagital sütür (SS) ve ardışık Intravital görüntüleme kavşak yakınında fare frontal kemikler üzerinde mikro-kırık Şekil 1.. In vivo fare Kalvaryal yaralanma görüntüleme. (A) şematik gösterimi. (B) Cerrahi maruziyet kalvari yaralanma önce. (C) Intravital görüntüleme için fare kafatası üzerinde Temsilcisi mikrofraktür yaralanmalar. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
51289fig2.jpg "/>
Trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP fare Şekil 2.. Yaralanma sitelerinde OSPCs in vivo izleme. (A) şematik gösterimi. (B) Bu diyagram trigenic Mx1/Tomato yaralanması sitelerinde görünmesini mümkün floresan hücre popülasyonları gösterir / Ocn-GFP fare. Kırmızı Domates ifade MX1 + OSPCs temsil eder. Sarı yeşil önceden var olan osteoblastlar (GFP +) ya da uyanlabilir MX1 olmayan (MX1 -) yeni osteoblastlar temsil etmektedir MX1 + OSPCs farklılaşmış olgun osteoblastlar (Domates GFP + +) göstermektedir. Progenitorlar MX1 OSPCs + (C) Sıralı intravital görüntüleme ve yaralanma sitelerinde osteoblastlar. Domates + osteoprogenitors ve Mx1/Tomato/Ocn-GFP fare kafatası üzerinde yaralanma yakın GFP + osteoblast hemen yaralanma (gün 0) sonra t görüntülendiO yaralanma sonrası kez göstermektedir. Oklar MX1 + OSPCs (sarı) türetilen osteoblastları göstermektedir. Mavi, kemik. Noktalı daire tüm (tek) kırık bölgesini temsil eder. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3.. Kırık iyileşmesi sırasında MX1 kaynaklı OSPCs tutarlı ve kantitatif ölçümü. (A) Mx1/YFP fare kafatası üzerinde üç bağımsız Sakatlıklar sırayla hemen yaralanma (gün 0) sonra ve yaralanma sonrası belirtilen zamanlarda görüntülendi. (B) Kantitatif MX1 + osteojenik kök / progenitör hücrelerin ölçümü. MX1 + OspC kinetiğiyaralanma sitelerinde genişletme ImageJ kullanarak YFP sinyal yoğunluğu ölçüldü. Grafikler, her bir deney içinde altı yaralanma ortalama iki bağımsız deney gösterir. Mavi, kemik; yeşil, MX1 + osteojenik kök / progenitör hücreleri; kırmızı, damar (Q-nokta). Ölçek çubukları 100 mikron (A) vardır. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Iskelet kök hücrelerin düzenlenmesi kemik rejenerasyonu elde etmek için daha iyi yöntemler tanımlanması için büyük önem olabilir. Hücresel düzeyde nicel ve sıralı görüntüleme teknik açıdan zorlayıcı olmuştur. Fare uzun kemik kırığı modeli yaygın olarak kullanılan ve biyomekanik çalışmalar 17 için uygun olmasına rağmen, derin doku konumu, düzensiz kırık boyutu, yumuşak doku hasarı ve stabilize fiksatör uygulama sıralı Intravital görüntüleme sınırlıdır. Burada, konfokal / iki foton intravital mikroskopi ve bir fare kalvaryal kırılma modeli kombinasyonu ile, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için bir yöntem sağlanmaktadır. Osteojenik kök / progenitör soy takibi ile bu yaklaşım, kırık onarımında osteojenik kök / atalarıdır in vivo görüntüleme, gerçek zamanlı kapasitesini göstermektedir.
Bu yöntemde önemli bir teknik sorun zamanla tutarlı ve yüksek kaliteli görüntüler elde etmektir. Yüksek kaliteli immaksimum görüntüleme derinliği ile yaşları floresan gazetecilere ve görüntüleme alanının doku durumun parlaklığına bağlıdır. Buna ek olarak, doku hasarı ve photobleaching önlemek için laser maruz kalmayı minimuma indirerek uzun süreli sıralı görüntüleme için önemlidir. Video oranı platformunu kullanarak hızlı tarama, bu amaç için yararlı olduğunu. Görünümünde bir tek alan bütün hasarı kapsamaz yapamıyorsanız, bölge kırık sitelerin çoğunu kapsayacak montaj görüntüleri alarak eşlenebilir. Bu Z-yığını kalitesi ve tüm görüntüleme oturumu sırasında edinilen bilgilerin miktarı arasında uzlaşma önemlidir. Örneğin, birçok dilimleri (örneğin 1-2 um adımlar) ve yüksek çözünürlüklü Z-yığınları daha fazla analiz etmek daha kolaydır; ancak, lazer kaynaklı ışıkla ağartma daha yüksek bir derecesi için uzun vadeli bir lazer maruz gerektirir.
Kırık yaralanma in vivo görüntüleme ardışık deri ve kemik yüzeyinin tekrarlanan cerrahi açılmasını gerektirir, bu yanacalvaria yüzeyinde fibrotik skar oluşumu derin doku görüntüleme keser ve yüksek arka plan floresans verimleri yaygın bir sorundur. Nitelikli sütür teknikleri ve minimum kanama skar oluşumunu azaltmak için çok önemlidir. Genel olarak, 3-5 kez tekrar görüntüleme görüntü kalitesi önemli bir kayıp olmadan elde edilebilir.
Tekrar görüntüleme, kırık boyutu, kolay ve tam kontrol ve onarım kinetik tutarlılık olasılığı göz önüne alındığında, bu yöntem, kırık iyileşmesi, osteoporoz ve iskelet kası gibi diğer doku rejenerasyonu için terapötik hedefleri test etmek için uygun bir araç sağlayabilir.
Yazarlar, hiçbir rakip mali İlgi olmadığını beyan ederim.
Biz el yazması okumak için C. Park teşekkür ederim. Bu çalışma Ödül sayısı K01AR061434 ve DP'ye bir Lösemi ve Lenfoma Derneği Bursu Ödülü (5127-09) altında NIAMS tarafından desteklenen ve içeriği CPL ve DTS için Ulusal Sağlık Enstitüleri hibe değil sadece yazarların sorumluluğundadır ve yok edildi mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
Methocel 2% | OmmiVision | ||
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
Radius-635 HeNe laser | Coherent |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır