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Quantitative Messung der Knochenvorläuferfunktion in Frakturheilung erfordert hohe Auflösung Serienbildtechnologie. Hier werden Protokolle für die Verwendung von Intravitalmikroskopie und Osteo-Linie Tracking Bild sequentiell und Quantifizierung der Migration, Proliferation und Differenzierung der knochenbild endogene Stammzellen / Vorläuferzellen in den Prozess der Reparatur von Knochenbrüchen vorgesehen ist.
Knochen dreht sich ständig und ist sehr regenerative nach Verletzungen. Osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen haben die Hypothese aufgestellt worden, lange zu existieren, aber in vivo Nachweis solcher Zellen wurde erst kürzlich erreicht. Dabei sind in vivo bildgebende Verfahren, die Rolle von endogenem osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen (OSPCs) und deren Nachkommen in Knochenreparatur zu untersuchen ist. Mit Osteo-Linie Zellverfolgung Modelle und Intravital Bildgebung von induzierten Mikrofrakturen im Knochen Schädel kann OSPCs direkt während der ersten paar Tage nach der Verletzung, in der kritische Ereignisse in der frühen Reparaturprozess auftreten beobachtet werden. Verletzungsstellen nacheinander abgebildet werden enthüllt, dass OSPCs verlagern, um der Verletzung, vermehren und differenzieren sich in knochenbildenden Osteoblasten. Diese Methoden bieten ein Mittel zur Untersuchung der Rolle von Stammzellen-intrinsische und extrinsische molekulare Regulatoren für die Knochenregeneration und Reparatur.
Degenerative Knochenerkrankungen und altersbedingten Knochenverlust führt zu einem hohen Risiko für osteoporotische Fraktur zu einer großen Herausforderung für die öffentliche Gesundheit ein. Knochenerhalt wird von knochenbildenden Osteoblasten und Osteoklasten Knochen gesteuert. Mängel der knochenbildenden Zellen sind die Hauptursache der altersbedingten Knochenverlust und degenerative Knochenerkrankungen 2,3. Während umfangreiche Forschung hat sich auf die Verbesserung der Frakturheilung konzentriert, um die Entdeckung der zuverlässige Medikamente degenerative Knochenerkrankungen zu heilen und die Schwäche der osteoporotischen Frakturen umkehren bleibt ein wichtiges Thema. So studieren die Quelle der knochenbildenden Zellen und ihre Kontrollmechanismen in der Knochenregeneration und Reparatur stellt eine neuartige Einblicke in Skelett-Regeneration zu verbessern und umzukehren Knochenverlust Krankheiten.
Das Vorhandensein von multi mesenchymalen Zellen im Knochenmark wurde basierend auf der Identifikation von klonogenen Populationen vorgeschlagen, könnten unterschiedlicheiate in osteogene, chondrogene adipogene und Ex-vivo-Linien 4. kurzem mehrere Studien haben berichtet, dass Skelett / mesenchymale Stammzellen (SSC / MSC) sind eine natürliche Quelle von Osteoblasten und sind entscheidend für die Knochenumsatz, Umbau-, Reparatur-und Bruch 5,6 . Darüber hinaus unsere Linie-Tracing-Studie ergab, dass reife Osteoblasten haben eine unerwartet kurze Halbwertszeit (~ 60 Tage) und werden kontinuierlich durch ihre Stammzellen / Vorläuferzellen in beiden normalen homöostatischen und Bruchreparaturbedingungen 6 aufgefüllt. Die in vivo-Identität von Stammzellen und wie solche Zellen reagieren jedoch um Verletzungen zu zerbrechen und liefern knochenbildenden Zellen sind unklar. Daher ist es wichtig, eine Methode, die in der Lage, die Migration, Proliferation und Differenzierung endogener SSC / MSCs in unter physiologischen Bedingungen zu analysieren entwickeln.
Bruchreparatur ist ein vielzelliger und dynamischer Prozess durch eine Anordnung von komplexen geregeltZytokine und Wachstumsfaktoren 7. Die beliebteste Ansatz für die Bruch Studien ist es, ein Tiermodell mit langKnochenBruch zu nutzen und Knochen durch Knochen Schnitte und Immunfluoreszenz-Techniken 10.08 analysieren. Dieses Reparaturverfahren kann von mehreren Bildgebungstechniken einschließlich Mikro-CT 11, Nah-Infrarot-Fluoreszenz 12 und Chemilumineszenz Abbildungs 13 überwacht werden. Jedoch hat jede dieser Techniken bestimmte Beschränkungen und es wurde keine wirksame Möglichkeit, SSC / MSC-Funktion auf zellulärer Ebene in vivo zu überwachen. Kürzlich, konfokale / Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie wurde entwickelt und verwendet werden, um Krebszellen und transplantierten hämatopoetischen Stammzellen auch bei Single-Cell-Auflösung in lebenden Tieren 14 zu erfassen im Rahmen der ihr Knochenmark-Mikroumgebung. Durch die Kombination dieser Technologie mit einer Reihe von Linienverfolgungsmodelle, waren wir in der Lage, festzulegen, dass osteogene Stammzellen / Vorläuferzellen genetisch durch transiente ac gekennzeichnetvierung des Myxovirus Widerstand -1 (MX1)-Promotor und Mx1-induzierte Vorläuferzellen können die Mehrheit der reifen Osteoblasten im Laufe der Zeit zu halten, aber nicht in der Erzeugung von Chondrozyten in der erwachsenen Maus 6 zu beteiligen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Mx1-markierten OSPCs liefern die Mehrheit der neuen Osteoblasten in Frakturheilung 6.
Hier mit Osteo-Linie Verfolgungsmodelle und Intravitalmikroskopie wird ein Protokoll vorgesehen, um die in vivo-Kinetik Mx1 + osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchreparatur zu definieren. Dieses Protokoll bietet sequentielle Bildgebung, um die Verlagerung von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchstellen und die quantitative Messung der Osteoprogenitorzellen Expansion in der frühen Reparaturprozess zu verfolgen. Dieser Ansatz kann sinnvoll in mehreren Zusammenhängen einschließlich der Bewertung der therapeutischen Kandidaten für die Knochenreparatur zu verbessern.
1. Mäuse und Präkonditionierung
Hinweis: Alle Mäuse wurden in keimfreien Bedingungen gehalten und alle Protokolle wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) am Massachusetts General Hospital genehmigt. Alle Operation sollte unter sterilen Bedingungen mit sterilen autoklaviert Ausrüstung durchgeführt werden. Mx1-Cre 15, Rosa26-loxP-Stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP) und Rosa26-loxP-Stop-loxP-tdTomato (Rosa-Tomate), waren von Jackson Laboratories. Osteocalcin-GFP-Mäuse wurden durch Dr. Henry Kronenberg zur Verfügung gestellt. Für die quantitative Analyse der OSPC Migration und Proliferation in vivo wurden Mx1-Cre + Rosa-YFP + (einfarbig-Reporter)-Mäusen verwendet. Für detaillierte Verfolgung von deren Differenzierung in Osteocalcin + reifen Osteoblasten, verwendeten wir trigenic Mx1-Cre + Rosa-Tomate + OCN-GFP +Mäusen.
2. MoVorbereitung nutzen
3. Microfracture Injury
4. Intravital Imaging
5. Beitrag Operation Procedures
Die stabilisierte lange Knochenbruch-Modell wurde populär in der Bruchstudien. , Lange Knochen oder große Bruch Modelle führen jedoch mehrere Gewebeschäden und daher eine Beschränkung in der quantitativen Messung der Knochenzellfunktion. Wir entwickelten eine minimal invasive Schädigung (weniger als 1 mm Durchmesser mit minimaler oder ohne Eindringen in die Dura mater) am Schädelknochen frontal mit Nadelbohrung (Fig. 1A-1C). Wir wählten eine Draufsicht auf die Schädelstirnbein für in vivo-Bildgebung von Live-Mikrofrakturen, weil dieser Knochen hat eine flache und dünne Knochenstruktur mit Knochenmark, wodurch klare Bilder von verletzten Knochen, Knochenzellen und Gefäßsystem ohne die Einmischung anderer Gewebe ( Figur 1C). Wir beobachteten, dass diese Mikrofraktur rekapituliert viele Eigenschaften von großen Bruchverletzungen einschließlich alkoholHornHautBildung, gefolgt von Mineralabscheidung und Knochenneubildung (Daten nicht gezeigt).
"> Sequential in-vivo-Bildgebung von Mx1 + osteogene Stammzellen Vorläuferzellen. Nächstes testeten wir, ob diese Methode in der Lage, die Verfolgung eines bestimmten osteogenen Zellpopulation während der Frakturheilung ist. Zuvor die trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP Dual Reporter Mäuse entwickelten wir durch Kreuzung Mx1-Cre Mäusen mit Rosa26-Tomate Reporter und Osteocalcin-GFP Mäusen (2A) 6. Vorteil dieses Modells ist der Differenz Kennzeichnung von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen und reife Osteoblasten. Durch Pipc Verwaltung, MX1 + OSPCs sind speziell gekennzeichnet von der Tomate Ausdruck, während reife Osteoblasten aus Mx1-induzierte OSPCs differenziert ausdrücken Tomaten und GFP. jedoch bereits bestehenden reifen Osteoblasten und Osteoblasten aus nicht-induzierbaren Mx1 Vorläuferzellen exprimieren GFP allein (Abbildung 2B). Nach der Bestrahlung und Knochenmark-Ersatz, wir GenerATED zwei Mikrofrakturen an den Stirnknochen dieser Mäuse. Wir bestätigten, daß die Fläche jeder Fraktur durch einen einzigen Sichtfeld mit unseren 30x Ziel detektiert. Sequential 3D-Bildgebung von Intravitalmikrofrakturen zeigten die Verlagerung von Tomato + OSPCs in der Website der Fraktur an Tag 2 und ihrer Expansion an Tag 5. Es gab zu dieser Zeit keine oder nicht nachweisbar GFP + Osteoblasten. Am Tag 12 wird eine Teilmenge der osteoprogenitors nahe der Bruchfläche hat die Differenzierung von Osteoblasten (Tomate GFP + +). Anschließend wird die Akkumulation von neuen Osteoblasten und die Knochenneubildung (durch Erzeugung der zweiten Harmonischen analysiert, blau) waren offensichtlich am Tag 21, was anzeigt, dass die Migration und Proliferation von osteogenen Vorläuferzellen ist ein wichtiger Mechanismus, um neue Osteoblasten, die an der Frakturheilung (Abbildung liefern 2C).Kinetik der osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruch Reparaturen. Um test, ob unsere Methode bietet eine konsistente und quantitative Leistung von Osteoprogenitorzellen Zahlen während der Frakturheilung, die Mx1/YFP Maus verwendeten wir als einfache Linie-Tracking-Modell und verfolgt Mx1 + OSPCs in der frühen Frakturheilung. Nachdem Mx1 + Markzellen von Wildtyp-Knochenmark ersetzt erzielten wir sechs unabhängigen Mikrofrakturen (zwei / Maus) auf Mx1/YFP Maus Schädeldecke. Wenn Mx1/YFP + OSPCs wurden für 14 Tage nach der Verletzung verfolgten wir konsequent beobachtet, dass eine kleine Anzahl von Vorläuferzellen wurden an der Verletzungsstelle um 3 Tagen nachgewiesen. Die Zahlen fortlaufend erhöht am Tag 7, wobei Spitzenpopulation am Tag 10 und 14 erhalt Tage (Fig. 3A). Wir quantifizieren die Kinetik der Osteoprogenitorzellen Zahlen durch Messung YFP Signalintensität (Bildverarbeitung und Analyse mit dem ImageJ-Programm). Wir wiederholten das Experiment mit einem ähnlichen Ausgang, was die Konsistenz unseres Ansatzes (Abbildung 3B).
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1. In-vivo-Bildgebung von Maus-Schädelverletzung. (A) Schematische Darstellung der Mikrorisse auf der Maus frontalen Knochen in der Nähe der Kreuzung der koronalen (CS) und sagittalen Naht (SS) und sequentieller intravitalen Imaging. (B) der chirurgischen Freilegung der Maus Schädeldecke vor Verletzungen. (C) Repräsentative Mikrofraktur Verletzungen am Schädeldecke Maus für Intravital-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. In vivo Verfolgung von OSPCs an den Verletzungsstellen. (A) Schematische Darstellung der trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP Maus. (B) Das Diagramm veranschaulicht mögliche fluoreszierenden Zellpopulationen, die an Verletzungsstellen von trigenic Mx1/Tomato erscheinen / Ocn-GFP-Maus. Rot steht für Mx1 + OSPCs ausdrücken Tomaten. Gelb steht für reife Osteoblasten (Tomate + GFP +) aus Mx1 + OSPCs differenziert wohingegen Grün stellt neue Osteoblasten, die aus bereits bestehenden Osteoblasten (GFP +) oder nicht-induzierbaren Mx1 (MX1 -). Vorläuferzellen (C) Sequential Intravital-Bildgebung von Mx1 + OSPCs und Osteoblasten an den Verletzungsstellen. Tomate + osteoprogenitors und GFP + Osteoblasten in der Nähe der Verletzung auf Mx1/Tomato/Ocn-GFP Maus Schädeldecken wurden unmittelbar nach der Verletzung (Tag 0) und bei t abgebildeter angegebenen Zeiten nach der Verletzung. Die Pfeile zeigen die Osteoblasten aus Mx1 + OSPCs (gelb) abgeleitet. Blau, Knochen. Die gestrichelte Kreis stellt die gesamte (Einzel-) Fraktur. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Konsequente und quantitative Messung der Mx1-induzierte OSPCs während der Frakturheilung. (A) Drei unabhängige Verletzungen am Mx1/YFP Maus Schädeldecken wurden nacheinander unmittelbar nach der Verletzung (Tag 0) und zu den angegebenen Zeiten nach der Verletzung abgebildet. (B) Quantitative Messung der Mx1 + osteogene Stammzellen / Vorläuferzellen. Die Kinetik der Mx1 + OSPCExpansion an Verletzungsstellen wurde von YFP Signalintensität mit ImageJ gemessen. Diagramme zeigen zwei unabhängigen Experimenten mit dem Durchschnitt von sechs Verletzungen in jedem Experiment. Blau, Knochen; grün, Mx1 + osteogene Stammzellen / Vorläuferzellen; rot, Gefäßen (Q-Punkte). Maßstabsbalken sind 100 um (A). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Regulierung der Skelett Stammzellen von großer Bedeutung für die Definition bessere Methoden, um die Knochenregeneration zu erreichen. Quantitative und sequentielle Bildgebung auf zellulärer Ebene ist technisch anspruchsvoll gewesen. Obwohl die Maus Röhrenknochenfrakturmodell wurde weit verbreitet und eignet sich für biomechanische Studien 17, haben ihre tiefe Gewebestelle, unebene Bruch Größe, Weichteilschaden, und die Anwendung der stabilisierenden Fixateur sequentielle Bildgebung Intravital begrenzt. Hier wird ein Verfahren, diese Einschränkungen durch die Kombination der konfokalen / Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie und eine Mausschädelbruch Modell überwunden wird. Dieser Ansatz mit osteogenen Stammzellen / Vorläufer Linie Tracking demonstriert seine Fähigkeit zur Echtzeit-, in-vivo-Bildgebung von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen in Bruchreparatur.
Eine große technische Herausforderung bei dieser Methode ist es, konsistente und qualitativ hochwertige Bilder über die Zeit zu erhalten. Hohe Qualität imAlter bei maximaler Bildtiefe abhängig von der Helligkeit der Fluoreszenzreporter und dem Gewebezustand des Bilderzeugungsbereichs. Darüber hinaus ist die Laserbelichtung zu minimieren, um Gewebeschäden zu vermeiden und Bleichen wichtig für die langfristige sequentiellen Bildgebung. Schnelles Scannen mit der Videorate Plattform ist hilfreich für diesen Zweck. Wenn eine einzelne Sichtfeld können ganze Verletzungen nicht aus, kann der Bereich, indem Montagebilder, die meisten der Bruchstellen decken abgebildet werden. Es ist wichtig, zwischen der Qualität der Z-Stapel und der Menge an Informationen, die während der gesamten Abbildungssitzung erfasst beeinträchtigen. Beispielsweise sind Z-Stapel mit vielen Schichten (z. B. 1-2 &mgr; m-Schritten) und High-Definition einfacher, weiter zu analysieren; sie erfordern jedoch langfristig die Laserbelichtung, die zu einem höheren Grad der laserinduzierte Photobleichen.
Da sequentielle Bildgebung in vivo Bruchschäden erfordert die wiederholte chirurgische Eröffnung der Haut und Knochenoberfläche,fibrotische Narbenbildung auf der Oberfläche der Schädeldecke ist ein häufiges Problem, das tiefe Gewebe-Bildgebung unterbricht und ergibt hohe Blüte Hintergrund. Handnahttechniken und minimale Blutung ist entscheidend, um die Narbenbildung zu verringern. In der Regel drei bis fünf Zeitwiederholungs Bildgebung ohne wesentlichen Verlust der Bildqualität erreicht werden.
Angesichts der Möglichkeit der Wiederholung Bildgebung, die eine einfache und genaue Steuerung der Bruch Größe und Konsistenz der Reparatur Kinetik kann dieses Verfahren eine hinreichend sichere Mittel zum Testen therapeutische Ziele für die Frakturheilung, Osteoporose und anderen Geweberegeneration, wie Skelettmuskel.
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen zu haben.
Wir danken C. Park zum Lesen des Manuskripts. Diese Arbeit wurde durch die Auszeichnung unter NIAMS Anzahl K01AR061434 und Leukemia & Lymphoma Society Fellowship Award (5127-09) zu DP unterstützt und Zuschüsse von den National Institutes of Health zu CPL und DTS Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung der National Institutes of Health.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) | 000664 | |
Ketamine Hydrochloride Injection | Bionichepharma | 67457-001-10 | Vial size: 10 ml (50 mg/ml) |
Xylazine Sterile Solution | Lloyd Inc. | NADA# 139-236 | |
Buprenorphine Hl | BEDFORD LAB | NDC 55390-100-10 | Vial: 0.3 mg/ml, Doses: 0.05-0.1 mg/kg |
DPBS, 1X | CORNING cellgro | 21-031-CV | |
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl alcohol) | Kendall WEBCOL | 5110 | |
Fine Surgical Scissor | F.S.T | 14568-09 | |
Extra fine Forceps | F.S.T | 11150-10 | |
VICRYL*Plus Suture | Ethicon | VCP490G | |
Qtracker 705 non-targeted quantum dot | Invitrogen | Q21061 | |
Methocel 2% | OmmiVision | ||
pIpC (Polyinosinic-polycytidylic acid) | Sigma | P0913-50MG | 100 μl (2.5 mg/ml in PBS) for 10 g of mouse |
Mai Tai Tunable Ultrafast Lasers | Spectra Physics | ||
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS laser | Cobolt AB | ||
Radius-635 HeNe laser | Coherent |
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