顺序

在骨折愈合的骨祖细胞功能的定量测量需要高分辨率串行成像技术。这里，提供了用于使用活体显微镜和骨谱系追踪以顺序图像和量化修复骨骨折的处理内源性骨干/祖细胞的迁移，增殖和分化的协议。

骨归连续且高度再生损伤后。成骨细胞的干细胞/祖细胞长期被假设为存在，但在这些细胞的体内示范最近才实现的。这里，所提供的体内成像技术来探讨内源性骨干/祖细胞的作用（OSPCs）及其在骨修复后代。使用骨系细胞追踪模型和颅盖骨诱导微裂缝的活体成像，OSPCs可以直接在受伤后的最初几天，在这在早期修复过程中的关键事件发生时观察到。损伤部位可连续拍摄显露OSPCs搬迁到伤害，增加数量和分化为成骨成骨细胞。这些方法提供了调查的干细胞内在和外在的分子调节剂对骨再生和修复的作用的​​手段。

骨退行性疾病和与年龄相关的骨质流失，导致骨质疏松性骨折的高风险已成为公共卫生¹的一大挑战。骨的维护是由骨形成的成骨细胞和骨吸收的破骨细胞控制。骨形成细胞的缺陷是与年龄相关的骨丢失和退行性骨疾病^2,3的一个主要原因。虽然大量研究都集中在骨折愈合的改善，可靠的药物的发现治愈骨退行性疾病和扭转骨质疏松性骨折的弱点仍然是一个重要的问题。因此，研究骨形成细胞和它们的控制机制在骨再生与修复的来源提供了一种新颖的见解，以加强骨骼的再生和反向骨质流失的疾病。

基于克隆种群的鉴定已经提出了多能间质细胞在骨髓中的存在可能不同黄昏时分为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞系体外^4。近年来，多个研究报告称，骨骼/间充质干细胞（精原干细胞/干细胞）是成骨细胞的天然来源和对骨转换，重构，骨折修复^5,6至关重要。此外，我们的谱系追踪研究显示，成熟的成骨细胞有一个意外的半衰期很短（〜60日），并通过他们的干/祖细胞在正常内环境稳定及骨折修复条件⁶不断补充。然而，干细胞在体内的同一性和细胞是如何起反应，例如破裂损伤，并提供骨形成细胞也不清楚。因此，开发一种方法，能够分析迁移，增殖和内源性精原干细胞/干细胞的分化在生理情况下，它是非常重要的。

骨折修复是通过复杂的阵列调节的多细胞和动态的过程细胞因子和生长因子^7。对于骨折研究最流行 ​​的方法是使用具有长骨骨折的动物模型，并通过骨切片和免疫荧光技术^8-10来分析骨。此修复过程可以由多个成像技术包括显微CT ^11，近红外荧光的^12，和化学发光成像¹³进行监测。然而，每个技术都有一定的局限性，出现了以监测在体内细胞水平的SSC / MSC功能没有有效的方法。最近，共聚焦/双光子活体显微镜已开发和使用，即使在单细胞分辨率来检测移植的肿瘤细胞和造血干细胞在它们的骨髓微环境的上下文中活体动物^14。通过这种技术结合了一系列谱系追踪模式，我们能够定义成骨干/祖细胞可以被遗传标记的瞬态交流该粘病毒抵抗 -1（ 的Mx1）启动子和的Mx1诱导祖细胞tivation能保持大多数成熟的成骨细胞的过度时间，但不参与软骨细胞的产生在成年小鼠^6。此外，我们证明了的Mx1标记OSPCs供给广大的骨折愈合^6个新的成骨细胞。

这里，用骨谱系追踪模式和活体显微镜，一个协议被提供给限定在骨折修复的Mx1 ⁺骨干/祖细胞的体内动力学。该协议提供了连续的成像技术来跟踪搬迁成骨干/祖细胞的成骨折部位和骨原扩张的早期修复过程的定量测量。这种方法可能在多个上下文，包括治疗候选人，以提高骨修复的评价是有用的。

1，老鼠和预处理

注：所有小鼠均保持在无病原体条件和所有的协议获得批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在马萨诸塞州总医院。所有手术应在无菌条件下用高压灭菌消毒设备的Mx1-Cre重组酶 ¹⁵进行。，ROSA26-loxP位一站式的loxP-EYFP（罗莎-YFP）和ROSA26-loxP位一站式loxP的tdTomato（罗莎-番茄），分别为从杰克逊实验室购买。 骨钙素-GFP小鼠由亨利科罗伦贝格博士提供。为OSPC迁移和增殖的体内定量分析， 的Mx1-Cre重组 ⁺ 罗莎-YFP ^+（单一颜色记者）小鼠。对于其分化更详细的跟踪到骨钙素⁺成熟的成骨细胞，我们用trigenic 的Mx1-Cre重组⁺罗莎-西红柿⁺ OCN-GFP ⁺小鼠。

1. 要标记的Mx1 ⁺细胞在体内 ，在无菌PBS溶液准备聚肌胞苷酸（PIPC，2.5毫克/毫升），并注入200微升20克的Mx1-Cre重组⁺鼠标记者每隔一天连续10天腹腔注射一次。
2. 消除居民的Mx1 ⁺造血细胞，照射小鼠9.5 Gy的单剂量。照射后，移植野生型骨髓细胞（1×10 ^6个细胞/鼠）静脉注射¹⁶的24小时。注意：由于的Mx1诱导的细胞包括造血干细胞和造血来源的破骨细胞，消除的Mx1 ⁺造血细胞的提高的Mx1 ⁺成骨细胞的成像质量和定量。
3. 骨髓移植后，监测动物的四到六周，以达到供体骨髓细胞的成功复育。

2，莫使用准备

1. 腹腔注射50微升氯胺酮/甲苯​​噻嗪（100毫克/千克，甲苯噻嗪12毫克/公斤体重）的使用IACUC批准的程序，麻醉鼠标。注：效果持续时间可能氯胺酮/甲苯​​噻嗪的附加剂量进行扩展。
2. 判断鼠标是由缺乏应对脚趾和/或尾捏的完全麻醉。 （可选）当鼠标被麻醉，用胶带固定在鼻子的异氟醚防毒面具。调节异氟醚的水平，以确保动物是完全镇静。
3. 使用电动剪或小剪刀修剪的头皮头发。除去毛碎片和消毒暴露的皮肤用70％酒精棉签。适用撕胶，以防止角膜脱水。

3，微骨折损伤

1. 后确保动物是完全麻醉的，使一个单一的倒L形切口以打开头皮的皮肤。简单地说，使第一横向切口（小于1厘米）starti从一只耳朵ng到另一个耳朵。转〜60℃，并继续朝着切开鼻子，直到〜2-3毫米远离鼻子。注意：该切口最小化疤痕组织的形成将被成像的区域的上方。
2. 用钳子拉向两边分开皮瓣。既额骨和矢状面和冠状缝交点应清楚暴露。
3. 通过用无菌PBS和温柔擦拭用无菌纱布或棉签清洁冲洗的开放面，直到所有剩余的头发被淘汰。
4. 产生对颅骨微裂缝，按住鼠标头部用一只手和一个30号针头与另一只手。通过插入一个30号针头的尖端轻轻压和扭转运动使微穿刺（约0.2​​毫米直径的使用<1毫米深的伤口），左侧额骨矢状面和冠状缝的交叉点附近。注意：为了避免针头穿透进入大脑，从而最大限度地减少bleedi这是至关重要的纳克和组织损伤。
5. 切换到一个更大的针（20或25克）和扭针（约0.5毫米直径）扩大穿刺孔。
6. 重复步骤3.3-3.5生成第二穿刺对侧额骨。
7. 全歼受伤的斑点由PBS的连续下探，直到出血停止。
   注：在出血骨折部位会干扰适当的成像和诱导瘢痕形成。
8. 适用于无菌生理盐水溶液或2％甲基纤维素的头骨上的下降，以避免干燥。注意：不要让颅骨表面干燥，这将降低图像的清晰度。使用凝胶或盐水的量足以覆盖面积是非常重要的。

4，活体成像

1. （可选）成像之前，一些老鼠被注射了血管染料以可视化的血管。注入眼窝用20μl非目标Qtracker 705（在50毫米硼酸盐缓冲2微米的解决方案）稀释80米微升PBS。使用胰岛素注射器，以减少试剂的浪费。如果信号不够明亮，额外金额可能是必需的。
2. 打开扫描仪​​。注：基于多边形的激光扫描仪允许在视频速率同步多路图像采集（每秒30帧）。视频速率扫描是活的动物成像非常重要的。
3. 开启多光子激光（飞秒钛：蓝宝石激光器）。波长设置为880 nm和调节功率为骨二次谐波成像（440纳米）。对于GFP和tdTomato激励，打开491 nm和561 nm的固体激光器。
4. 打开PMT（光电倍增管），检测器为每个信号（435±20n​​m的带通滤波器，用于产生二次谐波，一个528±19 nm的带通滤波器的GFP，和590±20对tdTomato。）（可选）使用638纳米的氦氖激光器和一个光电倍增管具有695±27.5 nm的带通滤波器来检测Qtracker 705信号。
5. 的PlacE在一个XYZ轴电动显微镜阶段的动物。按住鼠标中最舒服的姿势有电加热垫，以帮助维持体温（这会降低动物损失的风险）。使用磁带来保存鼠标成像过程中尽量减少运动，以保持成像区域尽可能的水平。
6. 适用于暖2％甲基纤维素凝胶或生理盐溶液的头骨上一滴，以避免干燥。把盖玻片上的成像区域。使用低倍率镜头（30倍水浸泡的目的与0.9 NA）扫描颅骨。
7. 使用XYZ轴控制器，发现颅骨的表面由从骨头检测SHG信号，并确定一个关键界标位置，如在矢状缝和冠状缝之间的交点。获取图像并记录的XYZ坐标。
8. 继续通过观察二次谐波和荧光信号要搜索的损伤的位置。
9. 当损伤部位或区域Õf息被发现，获得含SHG和荧光信号从感兴趣的细胞的最佳焦点平面的图像。保存XYZ坐标和矢状面和冠状缝的交叉点的距离来定义他们的精确位置为下轮成像。
10. 为了收集骨折损伤三维细胞和骨骼结构，记录图像的Z-堆栈（2 - 5微米的间隔）与〜100微米的骨内膜表面的深度。在完成损伤的一侧的成像后，重复成像过程下一损伤部位。

5，岗位操作流程

1. 成像后，冲洗成象部位用无菌生理盐水溶液，以从头骨移除甲基纤维素凝胶。用消毒棉签，应用在表面上有少量三联抗生素软膏。覆盖皮瓣，并经手术缝合重新关闭头皮。这可以用一个低过敏性缝合线（可吸收聚乳糖苏来完成TURE）和5-0大小的缝合针。注意：好缝合技术减少疤痕形成。
2. 对待所有动物腹腔注射0.05-0.1毫克/公斤丁丙诺啡，每12小时48小时手术后。饲养动物在温暖的恢复室，直到他们重新获得足够的意识。后3〜5天，重新缝合，并重复活体成像的步骤来跟踪骨折愈合过程中的细胞变化。

稳定的长骨骨折模型已经流行在断裂的研究。然而，长骨​​或大骨折模型导致多个组织的损伤，因此，在骨细胞功能的定量测量的限制。我们用针打孔（ 图1A-1C），开发了一种微创损伤（小于1mm直径与最小或没有侵入硬脑膜）上颅骨额骨。我们选择了颅骨额骨用于体内活微裂缝的成像的顶视图，因为这骨有一个平而薄的骨结构与骨髓，允许成像清晰受伤的骨，骨细胞和脉管系统没有其它组织的干扰（ 图1C）。我们观察到这种微创概括大断裂损伤的许多特征，包括软骨痂形成后跟矿物沉积和新骨的形成（数据未显示）。

在骨折修复骨干/祖细胞的动力学。给TEST是否我们的方法提供了骨原号码的骨折愈合过程中一致的和定量的输出中，我们使用Mx1/YFP鼠标作为一个简单的谱系跟踪模型和跟踪的Mx1 ⁺ OSPCs在早期骨折修复。之后的Mx1 ⁺骨髓细胞所取代野生型骨髓，我们对Mx1/YFP小鼠颅骨产生六个独立的微裂缝（2 /鼠标）。当Mx1/YFP ⁺ OSPCs被伤后追踪14天，我们始终如一地观察到，在损伤部位3日再发现少量的祖细胞。数字会连续增加7天，达到人口高峰在10天及14天（ 图3A）维持。我们通过测量YFP的信号强度（图像处理和分析与ImageJ的程序）量化的骨号码的动力学。我们重复了这个实验，一个类似的输出，这表明我们的方法（ 图3B）的一致性。

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鼠标鼠标额骨冠（CS）和矢状缝（SS）和连续活体成像的交叉点附近微裂缝的图1， 在小鼠体内颅骨损伤的影像学（A）示意图。（二）手术风险颅骨受伤之前。（C）对小鼠颅骨的活体成像代表微创受伤。 请点击此处查看该图的放大版本。

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的trigenic Mx1/Tomato/Ocn-GFP鼠标图2。 体内跟踪OSPCs在损伤部位的（A）示意图（B）该图说明了出现在trigenic Mx1/Tomato的损伤部位可能的荧光细胞群/ OCN-GFP的鼠标。红色代表的Mx1 ⁺ OSPCs表达番茄。黄色代表的Mx1 ⁺ OSPCs分化，而 ​​绿色代表从预先存在的成骨细胞（GFP ^+）或的Mx1非诱导性（ 的Mx1 ^{- ）}新的成骨细胞的成骨细胞的成熟（西红柿⁺ GFP ^+）祖细胞的Mx1 ⁺ OSPCs（三）连续活体成像和成骨细胞在损伤部位。西红柿⁺骨原细胞和GFP ⁺附近的Mx1/Tomato/Ocn-GFP小鼠颅骨损伤成骨细胞成像损伤（0天）后在t立即他受伤后表示次。箭头所示为的Mx1 ⁺ OSPCs（黄色）成骨细胞。蓝色，骨骼。虚线圆圈代表整个（单）骨折部位。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3。骨折愈合过程中的Mx1诱导OSPCs的一致性和定量测量。（一）对Mx1/YFP小鼠颅骨三个独立的伤伤（0天）后，并在伤后指定的时间马上依次成像（B）定量测量的Mx1 ⁺成骨干/祖细胞。 的Mx1 + OSPC动力学扩张损伤部位是由使用ImageJ YFP的信号强度测量。图显示了带6的伤害在每个实验的平均2次独立实验。蓝色，骨骼;绿色的Mx1 ⁺骨干/祖细胞;红色，血管（Q-点）。比例尺是100微米（A）。 请点击此处查看该图的放大版本。

骨骼干细胞的调控可能是非常重要的定义更好的方法来实现骨骼再生。在细胞水平定量和序列成像一直是技术上的挑战。虽然小鼠长骨骨折模型已被广泛使用，并适合于生物力学研究^17，它的深部组织的位置，不均匀断裂大小，软组织损伤，和稳定固定器的应用限制了连续的活体成像。这里，提供了一种通过共聚焦/双光子活体显微镜和鼠标颅骨​​骨折模型的组合来克服这些限制的方法。这种方法与成骨干/祖谱系跟踪显示其对实时性， 在骨折修复骨干/祖细胞的体内成像。

在此方法的一个主要的技术挑战是随着时间的推移，以取得一致的和高质量的图像。高品质的即时通讯年龄与最大成像深度依赖于荧光报告和成像区域的组织状态的亮度。此外，最大限度地减少激光曝光，以避免组织损伤和光漂白是用于长期连续成像重要。使用视频速率平台快速扫描是用于此目的的帮助。如果视图中的单个字段不能覆盖整个受伤，该地区可以通过采取蒙太奇图像覆盖大部分的骨折部位进行映射。它的Z堆栈的质量和整个成像会议期间获得的信息量之间的妥协是很重要的。例如，Z-堆栈的许多切片（ 例如 1-2微米级）和高清晰度易于进一步分析;然而，它们需要长期的激光曝光，导致更高程度的激光诱导的光漂白的。

由于连续的骨折损伤体内成像就必须皮和骨表面的重复手术开幕，颅骨表面纤维化瘢痕形成的是中断深层组织成像，并产生高背景荧光的通病。熟练的缝合技术和最低出血是至关重要的，以减少瘢痕形成。一般来说，三五时间重复成像，而不显著损失图像质量来实现。

给定重复成像，容易和准确地控制裂缝的大小和修复动力学的一致性的可能性，这种方法可以提供用于测试对骨折愈合，骨质疏松症和其他组织的再生，例如骨骼肌的治疗目标的合理的手段。

作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。

我们感谢C.公园阅读的手稿。这项工作是由NIAMS下奖号码K01AR061434和白血病和淋巴瘤协会奖学金奖（5127-09），以支持DP与健康，以CPL和DTS全国学院授予的内容完全是作者的责任，并且不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。