Secuencial

La medición cuantitativa de la función de progenitores de médula en la curación de la fractura requiere alta resolución tecnología de imágenes en serie. Aquí, se proporcionan protocolos para el uso de microscopía intravital y seguimiento osteo-linaje secuencialmente imagen y cuantificar la migración, proliferación y diferenciación de osteogénicas células madre / progenitoras endógenas en el proceso de reparación de fractura ósea.

Hueso vuelca continuamente y es muy regenerativa tras una lesión. Células madre / progenitoras osteogénicas larga han sido la hipótesis de existir, sino con demostración in vivo de tales células sólo recientemente se ha alcanzado. En este caso, se proporcionan en las técnicas de imagen in vivo para investigar el papel de las células madre / progenitoras osteogénicas endógenos (OspC) y su progenie en la reparación ósea. El uso de células osteo-linaje modelos de rastreo y de imagen intravital de microfracturas inducidas en calota, OspC se puede observar directamente durante los primeros días después de la lesión, en la que se producen los eventos críticos en el proceso de reparación temprana. Lesiones sitios se pueden obtener imágenes de forma secuencial revela que OspC reubicar a la lesión, aumenta en número y se diferencian en osteoblastos que forman los huesos. Estos métodos ofrecen un medio para investigar el papel de los reguladores moleculares de células madre-intrínsecos y extrínsecos para la regeneración ósea y la reparación.

Enfermedades óseas degenerativas y la pérdida ósea relacionada con la edad que conduce a un alto riesgo de fractura por osteoporosis se ha convertido en un reto importante en la salud pública ^1. Mantenimiento óseo está controlado por los osteoblastos forman el hueso y los osteoclastos de resorción ósea. Los defectos de las células formadoras de hueso son una causa principal de la pérdida ósea relacionada con la edad y las enfermedades óseas degenerativas ^2,3. Si bien una amplia investigación se ha centrado en la mejora de la curación de la fractura, el descubrimiento de fármacos fiables para curar enfermedades degenerativas del hueso y para revertir la debilidad de las fracturas osteoporóticas sigue siendo un problema importante. Por lo tanto, el estudio de la fuente de células formadoras de hueso y sus mecanismos de control en la regeneración ósea y la reparación proporciona una nueva visión para mejorar la regeneración del esqueleto y revertir enfermedades de pérdida ósea.

La existencia de células mesenquimales multipotentes en la médula ósea se ha propuesto sobre la base de la identificación de poblaciones clonogénicas que podía diferenteIATE en osteogénico, linajes adipogénicos y condrogénicas ex vivo ^4. Recientemente, varios estudios han informado de que las células madre del esqueleto / mesenquimales (SSC / MSC) son una fuente natural de los osteoblastos y son fundamentales para la renovación ósea, remodelación y reparación de la fractura ^5,6 . Además, nuestro estudio de trazado de linaje revelado que los osteoblastos maduros tienen una vida media corta inesperadamente (~ 60 días) y se reponen continuamente por sus células madre / progenitoras en ambas condiciones homeostáticas y reparación de fracturas normales ^6. Sin embargo, la identidad in vivo de células madre y cómo tales células reaccionan a la fractura lesión y suministrar las células formadoras de hueso no son claras. Por lo tanto, es importante desarrollar un método que es capaz de analizar la migración, proliferación y diferenciación de las ESC endógenos / MSC en bajo circunstancias fisiológicas.

Reparación de la fractura es un proceso de múltiples celular y dinámica regulada por una matriz de complejocitocinas y factores de crecimiento ^7. El enfoque más popular para los estudios de fractura es el uso de un modelo animal con la fractura de los huesos largos y para analizar los huesos por seccionamiento hueso y técnicas de inmunofluorescencia ^8-10. Este proceso de reparación puede ser supervisada por múltiples técnicas de imagen incluyendo micro-CT ^11, la fluorescencia del infrarrojo cercano ^12, y de formación de imágenes de quimioluminiscencia ^13. Sin embargo, cada técnica tiene ciertas limitaciones y no ha habido manera efectiva de controlar la función ESC / MSC a nivel celular in vivo. Recientemente, confocal / de dos fotones microscopía intravital se ha desarrollado y utilizado para detectar células de cáncer trasplantado y las células madre hematopoyéticas en el contexto de su microambiente de la médula ósea, incluso con una resolución de una sola célula en animales vivos ^14. Mediante la combinación de esta tecnología con una serie de modelos de rastreo de linaje, hemos sido capaces de definir que las células madre osteogénico / progenitoras se pueden marcar genéticamente por ac transitoriavación de la resistencia myxovirus -1 (Mx1) promotor y progenitores inducida Mx1-puede mantener la mayoría de los osteoblastos maduros con el tiempo, pero no participar en la generación de condrocitos en el ratón adulto ^6. Además, hemos demostrado que OspC etiquetados-MX1 suministran la mayoría de los nuevos osteoblastos en la curación de fracturas ^6.

En este caso, el uso de modelos de seguimiento de osteo-linaje y microscopía intravital, se proporciona un protocolo para definir la cinética in vivo de ⁺ células madre / progenitoras osteogénicas Mx1 en la reparación de fracturas. Este protocolo ofrece imágenes secuenciales para seguir la reubicación de osteogénicas madre / progenitoras en los sitios de fractura y la medición cuantitativa de expansión osteoprogenitoras en el proceso de reparación temprana. Este enfoque puede ser útil en varios contextos, incluyendo la evaluación de candidatos terapéuticos para mejorar la reparación del hueso.

1. Los ratones y precondicionamiento

Nota: Todos los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos y todos los protocolos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Hospital General de Massachusetts. Toda la cirugía debe realizarse en condiciones estériles utilizando material estéril en autoclave. Mx1-Cre ^15, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP (Rosa-YFP), y Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Rosa-Tomate), fueron compraron de Jackson Laboratories. ratones osteocalcina-GFP fueron proporcionados por el Dr. Henry Kronenberg. Para el análisis cuantitativo de OSPC migración y proliferación in vivo, se utilizaron ⁺ (solo color-reportero) ratones Mx1-Cre ⁺ Rosa-YFP. Para un seguimiento más detallado de su diferenciación en osteoblastos osteocalcina ⁺ maduros, utilizamos trigénico Mx1-Cre ⁺ Rosa-Tomate ⁺ OCN-GFP ⁺ratones.

1. Para marcar las células Mx1 ⁺ in vivo, preparar ácido poliinosínico-policitidílico (PIPC, 2,5 mg / ml) en solución de PBS estéril e inyectar 200 l por 20 g de Mx1-Cre ⁺ reportero de ratón por vía intraperitoneal una vez cada dos días durante 10 días.
2. Para eliminar las células Mx1 ⁺ hematopoyéticas residentes, irradiar ratones con una sola dosis de 9,5 Gy. Después de 24 horas de irradiación, las células de tipo salvaje de trasplante de médula ósea (1x10 ⁶ células / ratón) por vía intravenosa ^16. Nota: Puesto que las células Mx1-inducibles incluyen las células hematopoyéticas y los osteoclastos hematopoyéticos derivados, la eliminación de las células hematopoyéticas ⁺ Mx1 mejora la calidad de imagen y cuantificación de células osteogénicas ⁺ Mx1.
3. Después de trasplante de médula ósea, para observar a los animales cuatro a seis semanas con el fin de lograr una repoblación con éxito de células de donantes de médula.

2. Moutilizar Preparación

1. Anestesie ratón mediante inyección intraperitoneal de 50 l de ketamina / xilazina (100 mg / kg, xilazina 12 mg / kg de peso corporal) mediante un procedimiento aprobado por la IACUC. Nota: La duración del efecto puede ser prorrogado por una dosis adicional de ketamina / xilazina.
2. Determine si el ratón está totalmente anestesiado por la falta de respuesta a los pies y / o pellizcos de cola. (Opcional) Cuando se anestesia el ratón, asegurar una máscara de gas isoflurano sobre la nariz con cinta adhesiva. Ajuste el nivel de isoflurano para asegurar que el animal está completamente sedado.
3. Corte el pelo del cuero cabelludo utilizando un condensador de ajuste eléctrico o tijera pequeña. Retire los fragmentos de cabello y esterilizar la piel expuesta con un 70% algodón con alcohol. Aplique el gel lacrimógenos para evitar la deshidratación de la córnea.

3. Lesiones Microfractura

1. Después de asegurarse de que el animal está completamente sedado, hacer una sola incisión en forma de L inversa para abrir la piel del cuero cabelludo. En pocas palabras, hacer una primera incisión transversal (menos de 1 cm) InicioÌón de una oreja a otra oreja. Gire ~ 60 ° y continuar incisión hacia la nariz hasta ~ 2-3 mm de distancia de la nariz. Nota: Esta incisión minimiza la formación de tejidos de la cicatriz por encima del área a explorar.
2. Separe los colgajos de piel tirando hacia los lados con unas pinzas. Ambos huesos frontales y la intersección de las suturas coronal y sagital deben ser claramente expuestos.
3. Limpie la superficie abierta por el lavado con PBS estéril y de limpieza suave con gasa o algodón hisopos estériles hasta que se eliminen todos los pelos residuales.
4. Para generar microfracturas en la bóveda craneal, sostenga la cabeza del ratón con una mano y una aguja de 30 G con la otra mano. Hacer un micro-punción (~ 0,2 mm de diámetro de la herida con <1 mm de profundidad) en el hueso frontal izquierdo, cerca de la intersección de las suturas coronal y sagital, insertando la punta de una aguja de 30 G con una presión suave y movimiento de torsión. Precaución: Es fundamental para evitar que la aguja penetre en el cerebro, lo que minimiza bleeding y el daño tisular.
5. Cambie a una aguja más grande (20 o 25 G) y ensanchar el orificio de punción girando la aguja (~ 0,5 mm de diámetro).
6. Repita el paso 3.3 a 3.5 para generar segunda punción en el hueso frontal contralateral.
7. Limpie hacia fuera los puntos lesionados por goteo continuo de PBS hasta que el sangrado se detenga.
   Nota: El sangrado en los sitios de fractura va a interferir con la imagen apropiada e inducir la formación de cicatrices.
8. Aplique una gota de solución salina fisiológica estéril o 2% de Methocel en el cráneo para evitar que se sequen. Nota: No permita que la superficie del cráneo se seque, lo que reducirá la claridad de la imagen. Es importante usar una cantidad suficiente de gel o solución salina para cubrir el área.

4. Imaging intravital

1. (Opcional) Antes de formación de imágenes, algunos ratones se les inyecta un colorante vascular para visualizar los vasos sanguíneos. Inyectar retro-orbital con 20 l de Qtracker no dirigido 705 (2 M solución en 50 mM de tampón de borato) diluido en 80 ml de PBS. Utilice una jeringa de insulina para minimizar el desperdicio de reactivos. Si la señal no es lo suficientemente brillante, podrían ser necesarias cantidades adicionales.
2. Encienda el escáner. Nota: Un escáner láser basado en polígonos permite la adquisición simultánea de múltiples canales de imagen a una velocidad de vídeo (30 fotogramas por segundo). Escaneo tasa video es muy importante para la formación de imágenes de animales vivos.
3. Encienda el láser multi-fotón (femto-segundos de titanio: zafiro láser). Establecer la longitud de onda a 880 nm y ajustar la potencia para la segunda generación de armónicos de formación de imágenes (440 nm) del hueso. Por las buenas prácticas agrarias y tdTomato excitación, encienda el 491 nm y 561 nm láser de estado sólido.
4. Encienda el PMT (tubo fotomultiplicador) detectores para cada señal (a ± filtro de paso de banda 435 20 nm para generación de segundo armónico, un ± filtro de paso de banda 528 19 nm para GFP, y 590 ± 20 para tdTomato.) (Opcional) Utilice un 638 nm láser de helio-neón y un PMT con un ± filtro paso banda 695 27,5 nm para detectar Qtracker 705 de señal.
5. Placcorreo del animal en una platina del microscopio motorizado XYZ-eje. Mantenga el ratón en la posición más cómoda con una almohadilla eléctrica para ayudar a mantener la temperatura del cuerpo (lo que reduce el riesgo de pérdida de animales). Use cinta adhesiva para sujetar el ratón para minimizar el movimiento durante la exploración y para mantener el área de la imagen lo más horizontal posible.
6. Aplique una gota de gel caliente metilcelulosa 2% o solución salina fisiológica en el cráneo para evitar que se sequen. Ponga una cubierta de vidrio en el área de imagen. Utilice un objetivo de bajo aumento (30x objetivo de inmersión en agua con 0,9 NA) para explorar el calvaria.
7. Utilizando el controlador XYZ-eje, encontrar la superficie de la bóveda craneal mediante la detección de la señal de GAA de los huesos e identificar una ubicación de punto de interés fundamental, tales como la intersección entre las suturas sagital y coronal suturas. Adquirir una imagen y registrar las coordenadas XYZ.
8. Continuar para buscar la ubicación de la lesión mediante la observación de las señales de los grupos de autoayuda y de fluorescencia.
9. Cuando los sitios de lesión o de la región of interés se encuentran, adquirir una imagen de la mejor plano focal que contiene las señales de fluorescencia de GAA y de las células de interés. Guardar coordenadas XYZ y la distancia a la intersección de las suturas coronal y sagital para definir su ubicación con precisión las próximas rondas de formación de imágenes.
10. Para recoger las estructuras celulares y de los huesos en 3D de una lesión de fractura, grabar imágenes de Z-pilas (2-5 micras) con intervalos de ~ 100 m de profundidad desde la superficie del hueso endosteal. Después de la finalización de la formación de imágenes de un lado de la lesión, repetir el proceso de formación de imágenes para los sitios de lesión próximos.

Procedimientos 5. Publicar Operación

1. Después de formación de imágenes, enjuague sitio de formación de imágenes con solución salina estéril para eliminar el gel de metilcelulosa del cráneo. El uso de un bastoncillo de algodón estéril, aplicar una pequeña cantidad de pomada antibiótica triple en la superficie. Cubra los colgajos de piel y volver a cerrar el cuero cabelludo mediante sutura quirúrgica. Esto se puede hacer con un hilo de sutura hipoalergénico (poliglactina absorbible dotura) y 5-0 tamaño de la aguja de sutura. Precaución: Una buena técnica de sutura reduce al mínimo la formación de cicatrices.
2. Tratar a todos los animales con inyección IP de 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina cada 12 horas durante 48 horas después de la cirugía. Mantener a los animales en una cámara de recuperación tibia hasta que recobren el conocimiento suficiente. Después de 3 a 5 días, abrir de nuevo la sutura y repetir los pasos intravital de imágenes para realizar el seguimiento del cambio celular durante la curación de la fractura.

El modelo de fractura de huesos largos estabilizado ha sido muy popular en los estudios de fractura. Sin embargo, los modelos de fractura grandes hueso largo o causar daño tisular múltiple y, por lo tanto, tienen una limitación en la medición cuantitativa de la función de las células óseas. Hemos desarrollado una lesión mínimamente invasiva (menos de 1 mm de diámetro con invasión mínima o ninguna en la duramadre) en huesos frontales de calota con la perforación de la aguja (figuras 1A-1C). Elegimos una vista superior de los huesos frontales de calota para en vivo de imágenes en vivo de microfracturas porque este hueso tiene una estructura ósea plana y delgada con la médula ósea, lo que permite una clara imagen de hueso lesionado, células óseas, y la vasculatura sin la interferencia de otros tejidos ( Figura 1C). Hemos observado que este microfractura recapitula muchas características de grandes lesiones de fractura, incluyendo la formación de callo suave seguido de la deposición de minerales y nueva formación de hueso (datos no mostrados).

Cinética de osteogénicas madre / progenitoras en reparaciones de fracturas. A TéSt si nuestro método proporciona una salida coherente y cuantitativa de los números de osteoprogenitoras durante la curación de la fractura, se utilizó el ratón Mx1/YFP como un modelo de linaje de seguimiento simple y rastreado Mx1 ⁺ OspC en la reparación de fracturas temprana. Después de células de la médula Mx1 ⁺ fueron reemplazados por tipo salvaje ósea, que generó seis microfracturas independientes (dos / ratón) en la bóveda craneal de ratón Mx1/YFP. Cuando Mx1/YFP ⁺ OspC fueron rastreados durante 14 días después de la lesión, se observó consistentemente que un pequeño número de células progenitoras se detectaron en el sitio de la lesión por 3 días. Los números aumentaron continuamente en el día 7, alcanzando población máxima en el día 10 y el mantenimiento por 14 días (Figura 3A). Hemos cuantificado la cinética de los números osteoprogenitoras midiendo la intensidad de la señal de YFP (procesamiento de imágenes y análisis con el programa ImageJ). Hemos repetido este experimento con una salida similar, lo que sugiere la consistencia de nuestro enfoque (Figura 3B).

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Figura 1. En vivo de imágenes de lesiones calvarial ratón. (A) Representación esquemática de microfracturas en los huesos frontales del ratón cerca de la intersección de las suturas coronal (CS) y sagital (SS) y de imagen intravital secuencial. (B) la exposición quirúrgica de ratón bóveda craneal antes de la lesión. (C) lesiones microfractura representativos de bóveda craneal de ratón para imágenes intravital. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2. In vivo seguimiento de OspC en los sitios de lesión. (A) Representación esquemática de ratón Mx1/Tomato/Ocn-GFP trigénico. (B) Este diagrama ilustra las posibles poblaciones de células fluorescentes que aparecen en los sitios de lesión de trigénico Mx1/Tomato / OCN-GFP ratón. El rojo representa Mx1 ⁺ OspC expresar tomate. El amarillo representa los osteoblastos maduros (Tomate ⁺ GFP ⁺⁾ diferenciadas de Mx1 ⁺ OspC mientras que el verde representa nuevos osteoblastos de osteoblastos pre-existentes (GFP ⁺⁾ o Mx1 no inducible (Mx1 ^-). Progenitores (C) secuencial de imágenes intravital de Mx1 ⁺ OspC y osteoblastos en los sitios de lesión. Tomate ⁺ osteoprogenitors y GFP ⁺ osteoblastos cerca de la lesión en la bóveda craneal de ratón Mx1/Tomato/Ocn-GFP fueron imágenes inmediatamente después de la lesión (día 0) y en tindicó tiempos después de la lesión. Las flechas indican los osteoblastos derivados de Mx1 ⁺ OspC (amarillo). Azul, óseo. El círculo de puntos representa a toda la zona de la fractura (single). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Medición consistente y cuantitativa de OspC inducidos-MX1 durante la curación de fracturas. (A) Tres lesiones independientes en calvaria ratón Mx1/YFP fueron imágenes en secuencia inmediatamente después de la lesión (día 0) y en los tiempos indicados después de la lesión. (B) Cuantitativo medición de las células madre / progenitoras osteogénicas Mx1 ^+. La cinética de Mx1 + OSPCexpansión en los sitios de lesión se midió la intensidad de señal de YFP usando ImageJ. Los gráficos muestran dos experimentos independientes con la media de seis lesiones en cada experimento. Azul, hueso; , ⁺ células madre / progenitoras verdes Mx1 osteogénicas; rojo, vasculatura (Q-dots). Las barras de escala son 100 micras (A). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La regulación de las células madre del esqueleto puede ser de gran importancia para definir los mejores métodos para lograr la regeneración ósea. Imágenes cuantitativa y secuencial a nivel celular ha sido técnicamente difícil. Aunque el modelo de fractura de los huesos largos del ratón ha sido ampliamente utilizado y adecuado para estudios biomecánicos ^17, su ubicación de tejido profundo, el tamaño de la fractura desigual, daño de tejidos blandos, y la aplicación de fijadores de estabilización han limitado intravital de imágenes secuenciales. Aquí, se proporciona un método para superar estas limitaciones mediante la combinación de confocal / de dos fotones microscopía intravital y un modelo de fractura de bóveda craneal de ratón. Este enfoque con seguimiento linaje madre / progenitoras osteogénico demuestra su capacidad para tiempo real, de imágenes in vivo de osteogénicas madre / progenitoras en la reparación de fracturas.

Un reto técnico importante en este método es la obtención de imágenes de calidad altos y consistentes en el tiempo. Alta calidad imlas edades, con una profundidad máxima de imagen depende de la luminosidad de los reporteros fluorescentes y la condición de los tejidos de la superficie de imágenes. Además, minimizando la exposición al láser para evitar daños en los tejidos y fotoblanqueo es importante para la formación de imágenes secuenciales a largo plazo. Escaneo rápido utilizando la plataforma de velocidad de vídeo es útil para este propósito. Si un solo campo de visión no puede cubrir toda la lesión, el área se puede asignar al tomar imágenes montaje para cubrir la mayoría de los sitios de fractura. Es importante hacer un compromiso entre la calidad de la pila Z y la cantidad de información obtenida durante toda la sesión de formación de imágenes. Por ejemplo, Z-pilas con muchas rebanadas (por ejemplo, 1-2 micras pasos) y de alta definición son más fáciles de analizar más a fondo; sin embargo, requieren la exposición de láser a largo plazo conduce a un mayor grado de fotoblanqueo inducida por láser.

Desde secuencial de imágenes in vivo de lesiones de fractura requiere la apertura quirúrgica repetitivo de la piel y la superficie del hueso,formación de la cicatriz fibrótica en la superficie de la bóveda craneal es un problema común que interrumpe imágenes de tejidos profundos y altos rendimientos de fluorescencia de fondo. Técnicas de sutura cualificados y sangrado mínimo es fundamental para reducir la formación de cicatrices. En general, cuatro y cincuenta y siete de formación de imágenes de repetición de tiempo se puede lograr sin pérdida significativa de la calidad de la imagen.

Dada la posibilidad de repetición de imágenes, el control fácil y preciso del tamaño de la fractura y la consistencia de la cinética de reparación, este método puede proporcionar un medio razonable para probar dianas terapéuticas para la curación de fracturas, osteoporosis, y la regeneración de otros tejidos como el músculo esquelético.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia financieros.

Damos las gracias a C. Park por leer el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIAMS en Número Award y un Premio K01AR061434 Leukemia & Lymphoma Society Fellowship (5127-09) para DP y subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud a CPL y DTS El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.