Kırmızı kan hücreleri üzerinde antikor kaynaklı kompleman aktivasyon sayısal tespiti için Yöntemler

Burada, kırmızı kan hücrelerine karşı antikorlar tarafından neden olunan kompleman aktivasyon ölçmek için iki tahlil tarif eder. Mevcut deneylerde üzerinde en büyük avantajı, nicel ve kolay yorumlamak doğasıdır.

Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) karşı antikorlar, karaciğer (ekstravasküler hemoliz) ya da damar içi eritrositlerde lizise neden olarak tamamlayıcı reseptörleri ile hızlandırılmış bir boşlukla sonuçlanan kompleman aktivasyonu yol açabilir. Damar içi lizise neden - özellikle - kompleman aktivasyonu neden alloantikorları (oto-bağışıklık hemolitik anemi, AIHA görüldüğü gibi) (örn. ABO) veya RBC antijenlere karşı antikorlar, potansiyel olarak zararlı olan ve ölümcül olabilir ^1. Şu anda, eritrositlerde nedeniyle on (otomatik)-antikorları için kompleman aktivasyonu RBC üzerinde veya RBC parçalama ^1-4 yansıtan bir nonquantitative hemolitik deneyi ile tamamlayıcı çökelmesini yansıtan Coombs testi kullanılarak in vitro tayin edilmiştir. Ancak, kompleman inhibitörleri etkinliğini değerlendirmek için, nicel teknikleri olması zorunludur. Burada iki gibi teknikler tarif eder. İlk olarak, hasta serumunda antikorlar indüklenir kırmızı kan hücreleri üzerinde C3 ve C4 birikmesini tespit etmek için bir deney öncesi olduğusunulmuş. Bunun için, FACS analizi, floresan etiketli anti-C3 ya da anti-C4 antikorları ile birlikte kullanılır. Bundan sonra, bir miktar hemolitik tahlili tarif edilmektedir. Hasta serumu ile indüklenen Bu deneyde, tamamlayıcı aracılı hemoliz serbest hemoglobin spektrofotometrik tespit yapma kullanımı ölçülür. Bu tahlillerin ikisi de antikorun neden olduğu kompleman aktivasyon çalışmalar sağlayarak yeniden üretilebilen ve kantitatif bulunmaktadır.

Kırmızı kan hücrelerinin (RBC) karşı antikorlar, alıcı eritrositlerde üzerinde mevcut olmayan bir antijeni eksprese eritrositlerde transfüzyonu ile indüklenebilir. Bu allo-antikorlar aşağıdaki transfüzyon ⁵ üzerinde aktivasyonu tamamlamak nedeniyle ciddi akut hemolitik transfüzyon reaksiyonlara neden olabilir. Oto-immün hemolitik anemi (AIHA), hastalar kendi RBCs karşı oto-antikorlar var. Bu durum, dalak ve / veya karaciğer ^6,7 tamamlayıcı reseptörleri yoluyla komplemanı aktive edebilmek oto-antikorların durumda fagositoz on-Fcy reseptörleri ile eritrosit bağlı IgG etkileşimi yolu ile hücrelerin hızlandırılmış açıklık yol açar. Intravasküler hemoliz sonuçlanan fulminan kompleman aktivasyonu nadir fakat sıklıkla ölümcüldür. Hızlandırılmış akut anemi allo-veya otoantikorlar sonuçlar ve bu nedenle potansiyel olarak ölümcül bir dokunun hipoksi ile uyarılan ya da aracılık ettiği RBC imha tamamlar. AIHA in oto-antikorlar dependin, sıcak ve soğuk antikorlar sınıflandırılırBu eritrositlerde (sırasıyla 37 ° C ya da daha düşük) bağlanan en uygun sıcaklık g. Sıcak antikorlar IgG izotipinde genellikle ve IgM soğuk antikorlar ^8,9 izotip. AIHA örneğin lymphoprolyferative bozukluğu, bağ dokusu hastalıkları, solid tümörler, enfeksiyonlar veya ilaçlara ikincil olabilir, ancak vakaların% 50 AIHA idiyopatik ^9'dur.

Gammaglobulini (örneğin,. IgG ya da IgM) tespiti ve hastanın eritrosit için bağlı tamamlayıcı bir yarı niceliksel direkt antiglobulin (Coombs) testi (DAT) vasıtasıyla gerçekleştirilir. DAT olarak hasta eritrosit anti-IgG veya anti-C3d ile inkübe edilir. RBC aglutinasyon oluşumu bağlı tamamlayıcı bileşenleri veya IgG bağlanma mevcudiyetini gösterir. Allo-ya da hastanın serum içinde antikorların tespiti dolaylı antiglobulin testi (IAT) vasıtasıyla gerçekleştirilir. TBD de, bromelain ile muamele edilen deney eritrosit, hasta serumu ile kuluçkalandı, yıkandı ve daha sonra anti-h ile kuluçkalanırIgG Uman. Durumda eritrositler anti-RBC IgG hasta serum yapışmasına mevcut oluşacak ile duyarlı olmuştur. RbcS IgM antikorlar doğrudan hasta serumu ile bromelain ile muamele edilen deney eritrositlerde inkübasyon üzerine aglütinasyon yol açacaktır. Doğrudan Coombs testinde veya TBD de RBC aglütinasyon görsel bir test tüpü içinde göz ya da boyutu ¹ ile aglutinant ve tek eritrositlerde ayıran küçük bir Sephadex kolonu üzerinde örnek yükleme yoluyla değerlendirilir.

Eritrosit kompleman aktivasyonu ölçmek için sıkça kullanılan bir başka teknik, bromelain ile tedavi edilen eritrosit ¹⁰ (tamamlayıcı-aracılı) hemoliz indükleme hasta serumunun kapasitesi değerlendirilmiştir edildiği hemolitik deney ^{1 'dir.} Santrifüjlemeden sonra süpernatan nedeniyle serbest hemoglobin kırmızı lekeli ve renksiz kalırsa, negatif olarak kabul edilir zaman test pozitif olarak not edilir. Antiglobulin test ve hemolitik tahlil, hem yarısayısaldır yana en yüksek serum seyreltme testin hala pozitif olduğu belirtilmiştir.

Antiglobulin test ve hemolitik tahlil rutin teşhis kullanılan sağlam tahliller vardır. Bu analizler semikantitatif ve kompleman inhibitörlerinin etkinliğini değerlendirirken gerektiğinde onlar, eritrositler kompleman aktivasyon ince farklılıklarını incelemek için uygun değildir tahlil gerçekleştiren teknisyen deneyimine bağlı olduğundan. Bu nedenle, biz bu yazıda anlatacağım RBCs, (otomatik-) antikorlar kompleman aktivasyonunu belirlemek için iki nicel analizler geliştirdi.

İlk olarak, eritrositlerde kompleman C3 ve C4 aktivasyonu fragmanlarının birikimi (Şekil 1A) ölçülmesi için bir tahlil geliştirilmiştir. Bu deneyde, insan bromelain ile tedavi edilen tip-0 eritrosit ısı ile inaktive edilmiş hasta serumu (anti-RBC antikoru kaynağı), taze AB serumu (tamamlayıcı kaynak) ve anti-C5 monoklonal antikor (Eculizumab) ile inkübe edilir. Bu inc sırasındaHastanın serum anti-RBC antikorları harekete tamamlayacak içeriyorsa ubation, C3 ve C4 birikimi oluşacaktır. Alt kompleman aktivasyonu ile RBC liziz önlenmesi için bir bloke edici anti-C5 monoklonal antikoru ilave edilir. Daha sonra, eritrositlerde C3 ve C4 çökelme sırasıyla, C3 ve C4 ile reaksiyona floresan etiketli monoklonal antikorlar ya da Fab-fragmanları kullanılarak FACS ile tespit edilir. Tek RBCs üzerinde yolluk sonuçların güvenilirliğini sağlamak için önemlidir. Bu tekniğin avantajları, hasta bir malzeme küçük hacimli, kaskadının erken bir aşamasında aktive edilmeyi tamamlayan değerlendirilir gereklidir ve yöntem, yeniden üretilebilir ve nicel olduğu bulunur. C3 ve C4 hem de ideal bir diğer avantajı, bir ayrım klasik ve lektin yolak aktivasyonu (C3 ve C4 biriktirme her ikisi de) ve alternatif bir yol, aktive (sadece biriktirme C3) arasında yapılabilir olmasıdır. Yerine işlenmemiş RBCs bromelain-tedavi RBCs kullanımı gibi hassasiyetini artırırsöylüyorlar.

İkinci deney şu anda kullanılan hemolitik tahlilinde (Şekil 1 B) dayanır. İnsan bromelain ile tedavi edilen tip-0 eritrosit ısı ile inaktive edilmiş hasta serumu (anti-RBC antikoru kaynağı) ve taze AB serumu (tamamlayıcı kaynak) ile inkübe edilir. Kompleman hasta anti-RBC antikorlar tarafından aktive edilirse, doza bağımlı RBC parçalama hemoglobin serbest yol, meydana gelecektir. Serbest hemoglobin miktarı sağlam ve parçalanmış eritrositlerde aşağı eğirme işleminden sonra süpernatan içinde 414 nm'de absorbans ölçümü ile belirlenir. Absorbans meydana hemoliz miktarı ile ilişkilidir. Mevcut deneyde tersine, bu protokol, bir hedef, çok tekrarlanabilir ve değerlendirilirken kişiye bağımlı değildir hemoliz kantitatif değeri sağlar.

Bu yöntemlerin bir uygulama AIHA kompleman önleyici olarak C1-inhibitörünün potansiyel kullanımı ^{olduğu, 11} s 'de tarif edilmiştirtudied.

1.. Bromelain ile tedavi edilen kırmızı kan hücrelerinin hazırlanması

1. Yıkayın 0-yazdığınız kırmızı kan hücreleri 1x PBS (2-5 dakika boyunca 664 x g santrifüj) ile 3x.
2. 37 ° C'de 10 dakika boyunca% 0.5 bromelain çözeltisi iki hacim ile dolu eritrositlerde 1 hacim inkübe
3. Hücreler 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
4. Hücreler en az bir hafta için 1x PBS içinde 4 ° C'de% 3 çözelti halinde saklanabilir.

2. FACS RBCs C3 ve C4 Birikme Analizi

1. 56 ° C'de 30 dakika boyunca ısıtılarak örnek hasta serumu gerekli miktarda (ya da diğer anti-RBC antikoru kaynağı) Isı-inaktif
2. (5 mM Veronal, 150 mM NaCl,% 0.05 jelatin pH 7.4) ve VBG ^{+ +} bunları tekrar süspansiyon ^- VBG in bromelain ile tedavi edilen eritrosit üç kez yıkayın (VBG ^- + 2 mM _MgCI2, 10 mM _CaCl2) vermek üzere bir % 0.5 çözelti.
3. (F cam inci ile bir yuvarlak tabanlı bir plaka içine, aşağıdaki bileşenleri Pipetveya uygun karıştırma): 25 ul% 0.5 eritrosit, 37.5 ul taze AB serumu (kompleman kaynak) ve 37.5 ul 200 ug / ml anti-C5. Anti-C5 pahalı ve elde etmek zor olabilir. Bir C5-/C6-/C7- veya C8-eksik serum yerine AB serumu ve anti-C5 kullanarak düşünebiliriz.
4. 0,1-33% bir nihai konsantrasyona kadar oyuk başına hasta serum ekleyin. Doğru ısı ile inaktive edilmiş AB serum kullanılarak dolayı, oyuk başına serum konsantrasyon farkları için. De 150 ul / lik bir son hacim elde etmek için VBG ^{+ +} ekleyin. ELISA folyo ile yakın plaka.
5. Çalkalarken 37 ° C 'de 1.5-2 saat inkübe edin.
6. PBS +% 0.5 BSA (2 dakika boyunca 664 x g'de santrifüj) ile RBC üç kez yıkayın.
7. Ekle floresan etiketli anti-C3 ve anti-C4 monoklonal antikorlar ya da bunların fragmanları, Fab 1 ug / ml 'lik bir son konsantrasyona PBS +% 0.5 BSA içinde (aglütinasyon azaltmak için). Burada, özel anti-C3-Alexa Fluor 488 geliştirilmiş ve anti-C4-Alexa Fluor 647 monoklonal antikorlar kullanılır; thes seçimie floresan etiketler FACS ile C3 ve C4 arasında aynı anda algılanmasını sağlar.
8. Hafif sallama ile oda sıcaklığında 30-45 dakika kuluçkalayın.
9. PBS +% 0.5 BSA ile yıkayın eritrosit 3x.
10. Süspanse alyuvarlar 150 PBS +0.5% BSA ul ve (FACS analiz öncesi cam inci kurtulmak için), yeni bir plaka içine pipetle.
11. FACS analizi yapın. Bir dağılım komplo FSC-A çifti ayrı tek hücreleri; tek eritrositler üzerindeki kapıyı ayarlayın; floresan sinyallerin (örn. FITC ve APC) için uygun algılama kanalı seçin.
12. Medyan floresan yoğunluğunu kullanarak sonuçlarını ölçmek.

Not: Bu, bir izotip kontrolü (örn., flüoresan anti-IL-6 fare IgG1 etiketli) kullanmak mümkündür. Bununla birlikte, hasta serumu (sadece AB serum olmadan) ya da bir tamamlayıcı kaynağı (ısı ile inaktive AB serum ve ısı ile inaktive edilmiş hasta serum olmadan) eritrositlerde inkübe edilmesi ile, örneğin, gerçek bir negatif kontrol dahil edilmesi önerilmektedir bird sonra aynı anti-C3-Alexa Fluor 488 ve anti-C4-Alexa Fluor 647 antikorları, bu leke. Bu farklı kontroller genellikle aynı, negatif sonuç veren, ancak bu, kırmızı kan hücrelerinin ¹² durumunda, bir izotip kontrolü daha geçerli bir kontrol sağlar.

3. Kantitatif Hemolitik Deneyi

1. 56 ° C 'de, numune 30 dakika ısıtılarak hasta serasının gerekli miktarda (ya da diğer anti-RBC antikoru kaynağı) Isı-inaktif
2. VBG ile yıkayın RBC'ler 3x ^- ve bir kez VBG ^{+ +} ile.
3. (Uygun karıştırma için) bir cam inci ile bir yuvarlak tabanlı bir plaka içine aşağıdaki bileşenleri Pipet: 35 ul% 3 kırmızı kan hücreleri, 25 ul taze AB serumu (tamamlayıcı kaynak) ve% 1-50 hastanın serum. Isı ile inaktive edilmiş AB serum kullanılarak serum konsantrasyon farkları için doğru. De 150 ul / lik bir son hacim elde etmek için VBG ^{+ +} ekleyin. ELISA folyo ile yakın plaka.
4. Çalkalanarak 1.5-2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
5. Cindirgenmiş yavaşlama (2-3 dakika içinde tam durdurmak için örneğin yavaşlama) ile 5 dakika boyunca 664 x g entrifuge plakası.
6. Dikkatli bir şekilde yeni bir mikrotiter plakası içinde 90 ul üstte yüzen madde pipet. Bu hava kabarcıkları önlemek ve sağlam hücrelerin yanınızda önlemek için bu aşamada önemlidir.
7. Uygun bir spektrofotometre içinde A414/690 ölçün.
8. Saf su ile bir örnek eritrosit lizis yüzdesi olarak liziz ifade eder.

Şekil 2A RBCs için temsili bir dağılım grafiği göstermektedir. FSC-A arsa (P1) - Tek RBCs için uygun yolluk de FSC-W görülebilir. RBCs genellikle% 95 civarında bu P1 kapısı (tek hücre) içinde kalan, ancak hasta serumunda yüksek oranda kullanıldığında anti-RBC IgM hasta serumunda mevcut olduğunu, özellikle bu,% 70-80 düşüş olabilir.

C4 birikimi ile ilgili AIHA hasta serumunun etkisi için Örnek sonuçlar Şekil 2B'de ve Şekil 2C'de C3 birikimi gösterilir. Bu şekillerde görülebileceği gibi, beklendiği gibi, daha fazla hasta serum, daha çok tamamlayıcı biriktirilmesini sağlamaktadır. İlginç bir biçimde, tamamlayıcı yerleştirme iki ayrı pozitif tepe görülür. Alyuvarlar tek bir donörden çekilir çünkü bu muhtemelen, RBC nüfusun heterojen neden değildir. Biz hala bu olayın nedenini araştırıyor. 2D ve 2E demonstra RakamlarC4 (Şekil 2B) ve C3 (Şekil 2E) çökeltme deneyleri tekrarlanabilirliğini te. Onlar da çeşitli AIHA hasta numunelerinin tamamlayıcısı birikimi sıfatıyla geniş bir değişkenlik göstermektedir.

Eritrositler için otomatik antikorları ihtiva eden bir AIHA hasta serum numunesi ile hemolitik deneyinin temsili bir sonuç Şekil 3A'da görülebilir. Normal olarak, serum örneği, bir titrasyon, bir güzel ve tekrarlanabilir bir eğri elde edilir. Hasta sera tamamlayıcı aktive kapasitesinde önemli ölçüde değişebilir ve bu nedenle her bir hasta serumunun bir titrasyonu yapın. Hastanın serum olmadan numuneleri genellikle nedeniyle tamamlayıcısı kaynağı olarak kullanılan serum örneğinden tarafından emilmesi için bir arka plan üzerine yaklaşık 10-15% verir. Bu nedenle, bakım esasen bu arka plan üstünde olan bir sinyali elde etmek için yeterince yüksek bir hasta serum konsantrasyonunu kullanmak alınmalıdır. F 'de gösterildiği gibi, anti-C5 gibi uygun bir tamamlayıcı inhibitörü ile, hemolitik sinyal uzak titre edilebilirŞEKIL 3B.

Şekil 1. C3-C4 ve biriktirme tahlilinde Kısaca, C3-C4 ve birikim deneyi (A) ve kantitatif hemolitik deneyi (B)., Şematik gösterimi, AIHA hasta serumu ile indüklenen çökelmesini tamamlamak, ölçülür hemolitik deney hemoliz iken AIHA hasta serum algılanır tarafından uyarılan. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. C3 ve C4 birikme A Örnek sonuçlarssay. A) strateji yolluk Önerilen. Burada gösterilen sadece (kırmızı P1) tek eritrositler seçmek için nasıl. Aglütine yeşil (P2) 'de gösterilmiştir. B) C4 birikimi ile ilgili AIHA hasta serumunun bir titrasyon etkisi. Örnek siyah olarak gösterilmiştir ise izotip kontrol (anti-fare IgG1 IL6), gri bir katı olarak gösterilir. Hasta serumu miktarını artırmak B olarak benzer C4 biriktirme. ° C)) bir artışa neden olur ama şimdi C3 birikimi için algılamalı. D) FACS C4 çökeltme sonucu tahlilin tekrarlanabilirliğini gösteren ve önemli farklılıklar gösteren bir grafiği tasvir farklı hastalardan alınan serum örnekleri arasında. Y ekseni D olarak benzer) E. Medyan floresan yoğunluğunu temsil eder) ama şimdi C3 birikimi için. için buraya tıklayınDaha büyük resmi görmek.

Şekil 3,. Gösterilen sayısal hemolitik deneylerinde hemolitik tahlilinde. A) AIHA hasta serum titrasyonu için, Örnek sonuçlar bu hasta serum konsantrasyonu ile yeniden üretilebilir liziz artar. B) bu durumda uygun bir tamamlayıcı inhibitörü (anti-C5) kompleman-aracılı liziz iptal olabilir., No liziz (negatif kontrol turuncu) sağlıklı verici serumu ile meydana gelir. AIHA hasta serum sabit konsantrasyonda tutuldu ederken, anti-C5 bir titrasyon burada olduğunu göstermiştir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Yukarıda bahsedilen deneyler, tekrarlanabilir ve sağlamdır. Bunlar, uygulaması kolay olan ve (a-96 oyuklu bir plaka içerisinde) aynı anda birçok örnekleri ile gerçekleştirmek mümkündür. Dolayısıyla, bu yaklaşım aynı zamanda bir ELISA robot sistemi, örneğin, tam otomatik bir sistem için uygun olacaktır. Şu anda kullanılan tekniklerin aksine, bu deneyler, nicel ve bu tamamlayıcı önleyicileri etkisinin çalışmaya örneğin yardımcı olacaktır. Ayrıca, yorumlama anda kullanılan deneyleri üzerinde bir gelişme olduğu, nesneldir.

Her iki testte de kritik bir adım vardır. Onlar bir olay olarak kabul edilir beri aglütine alyuvarlar, yapay olarak yüksek bir sinyal verecektir çünkü FACS analizinde önemli, tek eritrositler üzerinde kapısı olduğunu. Düşük konsantrasyonları hala iyi sinyaller vermeye çünkü, düşük hasta serum konsantrasyonları kullanılarak aglütinasyon önlemek için daha iyidir. Hemolitik deneyde, dikkatli bir şekilde yüzer bir transfer için çok önemlidirYeni bir tabak içine ürkiye'de inkübasyon, eritrosit carry-over beri (irade hava kabarcıkları gibi) güvenilmez bir sinyale yol açacaktır. Bu AB0 uyumsuzluğu kompleman aktivasyonu ile karışıklığı önlemek için her iki deneylerde 0-yazdığınız RBCs kullanmanız tavsiye edilir.

Onların güvenilirlik ve dayanıklılık için, bu deneyler, referans ¹¹ de gösterildiği gibi kompleman aktivasyon kantitatif ince farklar tespit etmek amacıyla, AIHA için tamamlayıcı önleyicilerinin etkinliğini incelemek için uygundur. Bu deyim hala doğrulama gerektirir rağmen, RBC kompleman aktivasyonu şiddetle tavsiye edilir nerede nedeniyle duyarlılığı bu deneyler hastalarda kompleman aktivasyonu tespit olabilir ama böyle Coombs negatif AIHA gibi rutin tahliller ile tespit değil. Beklenmeye için klinisyene yardımcı olabilecek ^- Onlar da (Rh ⁺ çocuk taşıyan bir anne, örneğin kan transfüzyonu veya bir RhD uyarılan) allo-antikorları kompleman aktive kapasitesini belirlemek için kullanılabilirBir tespit aloantikorlerin klinik davranışını t.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

SZ ve DW VIROPHARMA sınırsız bir hibe alırsınız.