طرق للكشف الكمي للجسم التي يسببها تكملة التنشيط على خلايا الدم الحمراء.

نحن هنا وصف اثنين من المقايسات لقياس تفعيل مكملا الناجم عن أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء. وميزة كبيرة على المقايسات الحالي الكمي وطبيعة السهل تفسير ل.

أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) يمكن أن يؤدي إلى تنشيط تكمل مما أدى إلى تسارع التخليص عبر مستقبلات مكملا في الكبد (انحلال الدم خارج الأوعية) أو يؤدي إلى تحلل كرات الدم الحمراء داخل الأوعية الدموية لل. Alloantibodies (على سبيل المثال ABO) أو الأجسام المضادة لمستضدات RBC (كما رأينا في فقر الدم الانحلالي الذاتية، AIHA) مما يؤدي إلى تفعيل تكمل يحتمل أن تكون ضارة ويمكن أن يكون - وخصوصا عندما يؤدي إلى تحلل داخل الأوعية الدموية - ¹ القاتلة. حاليا، تكمل التنشيط بسبب (السيارات) الأجسام المضادة في كرات الدم الحمراء في المختبر يتم تقييم باستخدام اختبار كومبس يعكس ترسب تكمل على RBC أو عن طريق فحص الدم الانحلالي nonquantitative يعكس RBC تحلل ^1-4. ومع ذلك، من أجل تقييم فعالية مثبطات مكملا، وهي ملزمة أن يكون التقنيات الكمية. نحن هنا وصف اثنين من هذه التقنيات. الأول، وهو فحص للكشف عن C3 و C4 ترسب على خلايا الدم الحمراء التي يسببها الأجسام المضادة في مصل المريض قبلsented. لهذا، يتم استخدام تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية مع fluorescently المسمى مكافحة C3 أو C4 لمكافحة الأجسام المضادة. المقبل، وصفت الحالة للدم الفحص الكمي. يتم قياس انحلال الدم بوساطة تكمل في هذا الاختبار، الناجمة عن المصل المريض استفادة من الكشف الطيفي من الهيموغلوبين الافراج عنهم. كل من هذه المقايسات استنساخه جدا والكمية، وتسهيل الدراسات التنشيط تكملة الناجم عن الأجسام المضادة.

أجسام مضادة ضد خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) يمكن أن يتسبب عن طريق نقل الدم من كرات الدم الحمراء معربا عن مستضد والذي هو غير موجود على كرات الدم الحمراء المتلقي. ويمكن لهذه الأجسام المضادة ألو يسبب ردود فعل الانحلالي الحاد نقل نظرا لتكمل التنشيط على نقل التالية ^5. في المناعة الذاتية فقر الدم الانحلالي (AIHA)، المرضى الذين لديهم أضداد ذاتية ضد كرات الدم الحمراء الخاصة بهم. وهذا يؤدي إلى تسارع إزالة الخلايا عن طريق التفاعل بين مفتش ملزمة لكرات الدم الحمراء مع Fcγ-المستقبلات على البالعات في الطحال و / أو في حالة أضداد ذاتية قادرة على تنشيط مستقبلات مكملا عبر مكملا في الكبد ^6،7. تفعيل مكملا مداهم انحلال الدم داخل الأوعية الدموية مما يؤدي إلى أمر نادر الحدوث ولكن غالبا ما يكون مميتا. المعجل، تكمل بوساطة الدمار الناجم عن RBC إما النتائج أو الأجسام المضادة في ألو فقر الدم الحاد ونقص الأكسجة الأنسجة وبالتالي يحتمل أن تكون قاتلة. تصنف الأجسام المضادة لصناعة السيارات في AIHA في الأجسام المضادة الحارة والباردة، DEPENDINز على درجة الحرارة المثلى التي تربط لكرات الدم الحمراء (37 درجة مئوية أو أقل، على التوالي). الأجسام المضادة الدافئة وعادة ما تكون من مفتش نمط إسوي والأجسام المضادة الباردة من الغلوبولين المناعي نمط إسوي ^8،9. AIHA يمكن أن تكون ثانوية بالنسبة لمثل lymphoprolyferative اضطرابات وأمراض النسيج الضام، والأورام الصلبة، والالتهابات أو المخدرات، ولكن في 50٪ من الحالات مجهولة السبب هو AIHA ^9.

يتم إجراء كشف gammaglobulins (على سبيل المثال. مفتش أو الغلوبولين المناعي) وتكمل ملزمة لكرات الدم الحمراء المريض عن طريق اختبار ضد الغلوبولين المباشرة نصف كمي (كومبس) (DAT). في DAT يتم تحضين كرات الدم الحمراء المريض مع المضادة للمفتش أو المضادة للC3D. حدوث تراص RBC يوضح وجود مكونات تكملة المرفقة أو مفتش ملزمة. يتم إجراء الكشف عن الأجسام المضادة، ألو أو في مصل المريض عن طريق اختبار ضد الغلوبولين غير المباشرة (IAT). في معهد التكنولوجيا التطبيقية، يتم تحضين اختبار كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين مع مصل المريض، وغسلها ثم حضنت مع المضادة للحأومان مفتش. في حال تم توعية كرات الدم الحمراء مع المضادة للمفتش RBC موجودة في مصل المريض تراص سيحدث. والأجسام المضادة الغلوبولين المناعي لكرات الدم الحمراء يؤدي مباشرة إلى تراص على حضانة اختبار كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين مع مصل المريض. ويتم تقييم RBC تراص في اختبار كومبس المباشر أو في IAT بصريا إما عن طريق العين في أنبوب اختبار أو عن طريق تحميل العينة على عمود Sephadex صغيرة تفصل كرات الدم الحمراء التصق واحد عن طريق حجم ^1.

آخر تقنية استخداما لقياس تفعيل تكمل على كرات الدم الحمراء هو فحص الدم الانحلالي ^1، التي يتم فيها تقييم قدرة المريض المصل للحث (بوساطة تكمل) انحلال الدم من كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين ^10. ويلاحظ اختبار بأنها إيجابية عندما طاف بعد الطرد المركزي اتسخت الأحمر بسبب الهيموغلوبين صدر ويعتبر أن تكون سلبية إذا كان لا يزال عديم اللون. كل من اختبار ضد الغلوبولين وفحص الدم الانحلالي هي نصف كمي، منذ أعلى سيرووتدل م التخفيف التي الاختبار لا تزال ايجابية.

اختبار ضد الغلوبولين وفحص الدم الانحلالي والمقايسات قوية التي يتم استخدامها بشكل روتيني في التشخيص. لأن هذه القياسات ليست نصف كمي ويعتمد على تجربة أداء فني الفحص أنها ليست مناسبة لدراسة الفروق الدقيقة التنشيط تكمل على كرات الدم الحمراء، حسب الحاجة عند تقييم فعالية مثبطات مكملا. لذلك، قمنا بتطوير اثنين من المقايسات الكمية لتحديد التنشيط مكملا بنسبة (السيارات) الأجسام المضادة لكرات الدم الحمراء، والتي سنقوم بشرح في هذه الورقة.

الأول، وضعنا مقايسة لقياس ترسب شظايا تفعيل المتممة C3 و C4 على كرات الدم الحمراء (الشكل 1A). في هذا الاختبار، يتم تحضين المعالجة بروميلين الإنسان نوع 0 كرات الدم الحمراء مع المصل الحرارة المعطل المريض (المضادة للRBC مصدر الأجسام المضادة)، مصل AB الطازجة (المصدر مكملا) والمضادة للC5 ريتوكسيماب (Eculizumab). خلال هذا المؤتمر الوطني العراقيubation، سوف تحدث C3 و C4 ترسب إذا كان المصل يحتوي على المريض تكمل تفعيل الأجسام المضادة للRBC. من أجل منع تحلل RBC عن طريق تفعيل تكملة المصب يتم إضافة عرقلة مكافحة C5 وحيدة النسيلة الأجسام المضادة. المقبل، يتم الكشف C3 و C4 ترسب على كرات الدم الحمراء عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة fluorescently المسمى أو فاب-شظايا التفاعل مع C3 و C4، على التوالي. تبوب على كرات الدم الحمراء واحدة من المهم لضمان موثوقية النتائج. وتشمل مزايا هذه التقنية أن كمية صغيرة من مادة المريض هو مطلوب، تكمل التنشيط في مرحلة مبكرة من تتالي يتم تقييم والأسلوب هو استنساخه والكمي. ميزة إضافية للنظر في كل من C3 و C4 هو أن التمييز يمكن أن يتم بين الكلاسيكية وكتين تفعيل المسار (سواء C3 و C4 ترسب) وتفعيل مسار بديل (C3 فقط ترسب). استخدام كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين بدلا من كرات الدم الحمراء غير المعالجة يزيد من حساسية كمايقول.

ويستند الفحص الثاني على فحص الدم الانحلالي المستخدمة حاليا (الشكل 1B). يتم تحضين المعالجة بروميلين الإنسان نوع 0 كرات الدم الحمراء مع المصل الحرارة المعطل المريض (المضادة للRBC مصدر الأجسام المضادة) والمصل AB الطازجة (مصدر مكمل). إذا تم تنشيط مكملا من قبل الأجسام المضادة للRBC المريض، سوف تحدث الجرعة تعتمد RBC تحلل، مما يؤدي إلى إطلاق سراح من الهيموغلوبين. وكميا كمية الهيموجلوبين صدر عن طريق قياس الامتصاصية في 414 نانومتر في في طاف بعد الغزل أسفل كرات الدم الحمراء سليمة ومجزأة. الامتصاصية يرتبط مع كمية من انحلال الدم حدث. وعلى النقيض من الفحص المستخدمة حاليا، وهذا البروتوكول يسمح للهدف، والقيمة الكمية للانحلال الدم وهذا هو استنساخه جدا ولا تعتمد على الشخص تفسير الفحص.

وقد وصفت لتطبيق هذه الأساليب في ^11، حيث كان احتمال استخدام مثبط C1-كما المانع مكملا في AIHA قtudied.

1. إعداد بروميلين المعاملة خلايا الدم الحمراء

1. خلايا الدم الحمراء كتبته-0 غسل 3x أخرى مع برنامج تلفزيوني 1X (الطرد المركزي في 664 x ج لمدة 2-5 دقيقة).
2. احتضان 1 حجم كرات الدم الحمراء محملة مجلدين من حل بروميلين 0.5٪ لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
3. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1X 3x أخرى.
4. الخلايا يمكن تخزينها كحل 3٪ في 4 درجات مئوية في برنامج تلفزيوني 1X لمدة أسبوع واحد على الأقل.

2. C3 و C4 تحليل ترسب على كرات الدم الحمراء عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية

1. للحرارة تعطيل المبلغ المطلوب من مصل المريض (أو غيرها من مصدر الأجسام المضادة لمكافحة RBC) عن طريق تسخين العينة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية.
2. غسل كرات الدم الحمراء المعالجة بروميلين ثلاث مرات في VBG ^- (5 ملي Veronal، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.05٪ الجيلاتين ودرجة الحموضة 7.4) و resuspend لهم في VBG ^{+ +} (VBG ^- + 2 + ₂ ملي MgCl 10 مم CaCl ₂₎ لإعطاء 0.5٪ محلول.
3. ماصة المكونات التالية في لوحة جولة القاع مع كوب اللؤلؤ (وأو الخلط السليم): 25 ميكرولتر كرات الدم الحمراء 0.5٪، 37.5 ميكرولتر مصل الطازجة AB (مصدر مكمل) و 37.5 ميكرولتر 200 ميكروغرام / مل مكافحة C5. مكافحة C5 مكلفة ويمكن أن يكون من الصعب الحصول عليها. يمكن للمرء أن تنظر في استخدام المصل أو C5-/C6-/C7- C8-ناقصة بدلا من AB المصل ومكافحة C5.
4. إضافة مصل المريض لكل بئر إلى تركيز النهائي من 0،1 حتي 33٪. الصحيح الاختلافات في تركيز المصل لكل بئر بسبب استخدام الحرارة المعطل AB المصل. إضافة VBG ^{+ +} للحصول على الحجم النهائي من 150 ميكرولتر / جيد. لوحة الوثيق مع ELISA احباط.
5. احتضان 1.5-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حين تهتز.
6. غسل كرات الدم الحمراء ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني + 0.5٪ BSA (الطرد المركزي في 664 x ج لمدة 2 دقيقة).
7. إضافة fluorescently المسمى مكافحة C3 والاجسام المضادة لمكافحة C4 أو شظايا فاب الخاصة بهم (للحد من تراص) في برنامج تلفزيوني + 0.5٪ BSA إلى تركيز النهائي من 1 ميكروغرام / مل. هنا وضعت مخصصة لمكافحة C3-اليكسا فلور 488 وتستخدم لمكافحة C4-اليكسا فلور 647 الاجسام المضادة، واختيار تساه تسميات الفلورسنت يسمح الكشف في وقت واحد من C3 و C4 بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية.
8. احتضان 30-45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
9. غسيل كرات الدم الحمراء 3X مع برنامج تلفزيوني + 0.5٪ BSA.
10. في resuspend كرات الدم الحمراء 150 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني +0.5٪ BSA وماصة لهم في لوحة جديدة (للتخلص من اللؤلؤ الزجاج قبل تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية).
11. تحليل أداء نظام مراقبة الأصول الميدانية. الخلايا وحيدة منفصلة عن الحلل في مبعثر بالتآمر FSC-A؛ تعيين البوابة على كرات الدم الحمراء واحد، واختيار القناة المناسبة للكشف عن الإشارات مضان (مثل FITC وAPC).
12. قياس النتائج باستخدام كثافة مضان وسيطة.

ملاحظة: من الممكن استخدام isotype السيطرة (على سبيل المثال وصفت fluorescently مكافحة IL6 الماوس IgG1). ومع ذلك، فمن المستحسن لتشمل مراقبة سلبية حقيقية مثل التي يحتضنها كرات الدم الحمراء دون مصل المريض (فقط AB المصل) أو بدون مصدر مكمل (الحرارة المعطل AB المصل والمصل المريض الحرارة المعطل)، ود ثم وصمة عار هذه مع نفس المضادة للC3-اليكسا فلور 488 والمضادة للC4-اليكسا فلور 647 الأجسام المضادة. وهذا يعطي المزيد من السيطرة صالحة من مجرد isotype السيطرة في حالة خلايا الدم الحمراء ^12، على الرغم من أن هذه الضوابط المختلفة عادة ما تعطي نفس، نتائج سلبية.

3. الفحص الانحلالي الكمي

1. للحرارة تعطيل المبلغ المطلوب من الأمصال المريض (أو غيرها من مصدر الأجسام المضادة لمكافحة RBC) عن طريق تسخين العينة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية.
2. غسيل كرات الدم الحمراء 3X مع VBG ^- ومرة واحدة مع VBG ^{+ +.}
3. ماصة المكونات التالية في لوحة جولة القاع مع لؤلؤة الزجاج (لخلط السليم): 35 ميكرولتر 3٪ كرات الدم الحمراء، و 25 ميكرولتر الطازجة المصل AB (مصدر مكمل) ومصل المريض 1-50٪. الصحيح الاختلافات في تركيز المصل باستخدام الحرارة المعطل AB المصل. إضافة VBG ^{+ +} للحصول على الحجم النهائي من 150 ميكرولتر / جيد. لوحة الوثيق مع ELISA احباط.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1.5-2 ساعة مع اهتزاز.
5. Cلوحة entrifuge في 664 x ج لمدة 5 دقائق مع خفض التباطؤ (مثل التباطؤ إلى وقف كامل في 2-3 دقيقة).
6. ماصة بعناية طاف 90 ميكرولتر في وحة microtiter جديدة. من المهم في هذه الخطوة لمنع فقاعات الهواء ومنع أن تتخذ على طول خلايا سليمة.
7. قياس A414/690 في معمل مناسبة.
8. تعبير عن تحلل كنسبة مئوية من تحلل كرات الدم الحمراء لعينة بالماء النقي.

ويبين الشكل 2A مؤامرة مبعثر ممثل لكرات الدم الحمراء. ويمكن رؤية النابضة مناسبة لكرات الدم الحمراء واحدة في دي FSC-W - FSC-A مؤامرة (P1). عادة حوالي 95٪ من كرات الدم الحمراء تقع ضمن هذه البوابة P1 (الخلايا واحد)، ولكن عندما يتم استخدام نسبة عالية من مصل المريض، وهذا يمكن أن ينخفض ​​إلى 70-80٪، وخصوصا عندما المضادة للRBC الغلوبولين المناعي موجود في مصل المريض.

وتظهر نتائج ممثلة لتأثير مصل المريض AIHA على ترسب C4 في الشكل 2B وعلى ترسب C3 في الشكل 2C. كما يمكن أن يرى في هذه الأرقام، أكثر صبرا المصل يؤدي إلى مزيد من ترسب مكملا، كما هو متوقع. الغريب، يحدث ترسب مكملا في قمتين إيجابية متميزة. وربما لا يحدث هذا بسبب عدم التجانس في السكان RBC، حيث يتم رسم كرات الدم الحمراء من متبرع واحد. نحن لا تزال تحقق في سبب هذه الظاهرة. أرقام 2D و 2E البرهانالشركة المصرية للاتصالات واستنساخ من C4 (الشكل 2D) و C3 (الشكل 2E) المقايسات الترسيب. أنها تظهر أيضا التفاوت الكبير في القدرة ترسب مكملا لمختلف عينات المرضى AIHA.

ويمكن الاطلاع على نتيجة الفحص ممثل الانحلالي مع AIHA عينة مصل المريض تحتوي على الأجسام المضادة لصناعة السيارات في كرات الدم الحمراء في الشكل 3A. عادة، وهي المعايرة مع عينة مصل ينتج لطيفة، منحنى استنساخه. المريض الأمصال تختلف اختلافا كبيرا في تكملة تفعيل القدرات، وبالتالي إجراء المعايرة كل مصل المريض. عينات مصل المريض دون عادة ما تعطي خلفية حوالي 10-15٪ وذلك بسبب امتصاص من قبل عينة مصل يستخدم كمصدر مكمل. لذا، ينبغي الحرص على استخدام تركيز عال بما فيه الكفاية مصل المريض للحصول على إشارة الذي هو فوق هذه الخلفية إلى حد كبير. مع مثبط تكملة مناسبة ومكافحة C5، إشارة الانحلالي يمكن معاير بعيدا كما هو مبين في Figure 3B.

الشكل 1. نظرة عامة التخطيطي للمقايسة ترسب C3-C4 و(A) وفحص الدم الانحلالي الكمي (B). باختصار، في ترسب فحص C3-C4 و، تكمل الناجم عن ترسب AIHA مصل المريض يقاس، بينما في مقايسة انحلال الدم الانحلالي الناجمة عن اكتشاف مصل المريض AIHA. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 2. نتائج ممثلة لC3 و C4 ترسب لssay. A) واقترح النابضة الاستراتيجية. المبين هنا هو كيفية اختيار فقط لكرات الدم الحمراء واحدة (P1، أحمر). يتم عرض agglutinates باللون الأخضر (P2). ب) تأثير المعايرة من مصل المريض AIHA على ترسب C4. يظهر isotype السيطرة (المضادة للIL6 الماوس IgG1) كما الرمادية الصلبة، في حين أظهرت العينة باللون الأسود. زيادة كمية المصل المريض يؤدي إلى زيادة في ترسب C4. C) مشابهة كما B) ولكن الآن مع الكشف عن ترسب C3. D) C4 ترسب FACS النتائج مبين في الرسم البياني يبين استنساخ للمقايسة وتظهر اختلافات كبيرة بين عينات مصل من مختلف المرضى. يمثل المحور Y كثافة مضان وسيطة. E) مماثلة كما D)، ولكن الآن لترسب C3. اضغط هنا لعرض صورة أكبر.

الرقم 3. نتائج ممثلة لفحوصات الدم الانحلالي الكمي. A) AIHA المعايرة مصل المريض في فحص الدم الانحلالي، وتبين أن زيادة تحلل بتكاثر مع تركيز مصل المريض. لا يحدث تحلل مع المصل صحية المانحة (باللون البرتقالي، والسيطرة السلبية) B) A المانع تكملة مناسبة (المضادة للC5 في هذه الحالة) يمكن أن تلغي بوساطة تكملة تحلل. المبين هنا هو المعايرة المضادة للC5 في حين تم الإبقاء على مصل المريض AIHA بتركيز ثابت. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

المقايسات أعلاه هي استنساخه وقوية. فهي سهلة لأداء وأنه من الممكن القيام بها مع العديد من العينات في نفس الوقت (في لوحة 96 أيضا). وبالتالي، فإن هذا النهج أيضا أن تكون مناسبة لنظام مؤتمتة بالكامل، مثل نظام الروبوت ELISA. وعلى النقيض من التقنيات المستخدمة حاليا، وهذه القياسات ليست الكمية وهذا سيساعد على سبيل المثال في دراسة تأثير مثبطات مكملا. وعلاوة على ذلك، فإن التفسير هو الهدف، وهو ما يشكل تحسنا خلال المقايسات المستخدمة حاليا.

سواء المقايسات يكون خطوة حاسمة واحدة. المهم في تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية هو بوابة على كرات الدم الحمراء واحدة، وذلك لأن كرات الدم الحمراء التصق سوف يعطي إشارة عالية بشكل مصطنع، لأنها تحسب كما حدث واحد. بل لعله أفضل لمنع تراص باستخدام تركيزات منخفضة مصل المريض، لأن تركيزات منخفضة لا تزال تعطي إشارات جيدة. في مقايسة الانحلالي، لا بد من نقل بعناية طاف وأي fter الحضانة في لوحة جديدة، منذ المرحل من كرات الدم الحمراء يؤدي إلى إشارة لا يمكن الاعتماد عليها (كما فقاعات الهواء الإرادة). فمن المستحسن استخدام كرات الدم الحمراء كتبته-0 في كل من المقايسات لمنع الالتباس مع تفعيل مكملا AB0 عدم تطابق.

نظرا لموثوقيتها ومتانة هذه المقايسات هي مناسبة لدراسة فعالية مثبطات مكملا لAIHA كما هو موضح في المرجع ^11، من أجل الكشف عن الفروق الدقيقة كميا في تفعيل المتممة. نظرا لحساسيتها هذه المقايسات قد كشف عن تفعيل مكملا في المرضى حيث يقترح تفعيل تكمل على RBC بقوة ولكن لم يتم الكشف عن طريق فحوصات روتينية، كما هو الحال في AIHA كومس سلبية، رغم أن هذا البيان لا يزال يتطلب التحقق. أنها يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد مكملا تفعيل قدرة ألو الأجسام المضادة (الناجمة عن نقل الدم على سبيل المثال أو في السيارة RHD ^- الأم تحمل الطفل العامل الريصي ⁺⁾ التي قد تساعد الطبيب على التنبؤاتر السلوك السريرية لضد خيفي الكشف عنها.

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

SZ وDW تتلقى منحة غير المقيد للViropharma.