Методы количественного определения антител-индуцированной активации комплемента по ЭРИТРОЦИТОВ

Здесь мы опишем два анализы для измерения активации комплемента, вызванное антителами против красных кровяных клеток. Основным преимуществом над текущими анализов является их количественный и природа простой в интерпретации.

Антитела против красных кровяных телец (эритроцитов) может привести к активации комплемента, что приводит к ускоренному оформлению через рецепторы комплемента в печени (внесосудистая гемолиз) или приводит к внутрисосудистого лизиса эритроцитов. Аллоантител (например АВО) или аутоантител к антигенам эритроцитов (как видно на аутоиммунной гемолитической анемии, АМСЗ), ведущие к активации комплемента потенциально вредны и могут быть - особенно, когда приводит к внутрисосудистого лизиса - со смертельным исходом ^1. В настоящее время, активацию комплемента вследствие (авто)-антител на эритроцитах оценивается в пробирке с помощью тест Кумбса, отражающий отложение комплемента на РБК или с помощью неколичественные гемолитической анализа отражающей РБК лизиса ^1-4. Тем не менее, для оценки эффективности ингибиторов комплемента, то в обязательном порядке иметь количественные методы. Здесь мы опишем два таких методов. Во-первых, анализ, чтобы обнаружить C3 и отложение C4 на красных кровяных телец, который, вызванных антител в сыворотке пациента предварительнозаслушанных. Для этого анализа FACS используется с флуоресцентно меченных анти-С3 или С4 анти-антител. Далее, количественный гемолитическая анализ описан. В этом анализе комплемент-опосредованной гемолиз, индуцированный сыворотки пациента измеряется с использованием спектрофотометрического обнаружения опубликованном гемоглобина. Оба этих анализов очень воспроизводимым и количественный, что облегчает изучение активации комплемента антитело-индуцированный.

Антитела против красных кровяных телец (эритроцитов) может быть вызвана при переливании эритроцитов, экспрессирующих антиген, которого нет на БС-получателей. Эти алло-антитела могут вызывать тяжелые острые гемолитические реакции переливания из-за активации комплемента на следующем переливании ^5. В аутоиммунного гемолитической анемии (АМСЗ), пациенты имеют аутоантитела против собственного эритроцитов. Это приводит к ускоренному оформлению клеток через взаимодействие IgG, связанного с эритроцитов с Fcγ-рецепторами на фагоцитов в селезенке и / или в случае аутоантител, способных активировать комплемент через рецепторы комплемента в печени ^6,7. Активация Молниеносный дополнением в результате внутрисосудистого гемолиза является редким, но нередко приводит к смерти. Ускоренное, опосредованное комплементом разрушение РБК, вызванное либо алло-или аутоантител приводит к острой анемии и, следовательно, потенциально смертельной тканевой гипоксии. В авто-антител в AIHA классифицируются в теплых и холодных антител, dependinг на оптимальной температуре они связываются с эритроцитами (37 ° С или ниже, соответственно). Теплые антитела, как правило, из IgG изотипа и холодные антитела по изотип IgM ^8,9. АМСЗ может быть вторичной по отношению к например lymphoprolyferative расстройств, заболеваний соединительной ткани, солидных опухолей, инфекций или наркотиков, но в 50% случаев АМСЗ идиопатический ^9.

Обнаружение gammaglobulins (например. IgG или IgM) и дополняют привязан к эритроцитов пациента осуществляется с помощью полуколичественного прямого антиглобулиновый тест (Кумбса) (DAT). В DAT эритроциты пациента инкубируют с анти-IgG или анти-c3d. Появление РБК агглютинации демонстрирует наличие прикрепленных компонентов комплемента или связывание IgG. Обнаружение алло-или аутоантител в сыворотке пациента осуществляется с помощью теста косвенного антиглобулиновой (IAT). В IAT, бромелайн, обработанных испытаний эритроцитов инкубировали с сывороткой пациента, промывали и затем инкубировали с анти-чУмань IgG. В случае эритроциты имели возможность ознакомиться с настоящим анти-РБК IgG в сыворотке пациента агглютинации произойдет. IgM антитела к эритроцитов приведет непосредственно к агглютинации при инкубации бромелайна обработанных испытательных эритроцитов с сывороткой пациента. RBC агглютинации в прямой тест Кумбса или в IAT оценивали визуально либо на глаз в пробирке или путем загрузки образца на небольшую колонку Sephadex разделяющей агглютинируются и единичные эритроциты по размеру ^1.

Другой часто используемый метод для измерения активации комплемента на БС является гемолитический анализ ^1, в которой емкость сыворотки пациента, чтобы вызвать (опосредованного комплементом) гемолиз бромелайн эритроцитов, обработанных ¹⁰ оценивается. Тест отметил как положительные, когда супернатант после центрифугирования окрашивается красным из-за выпущен гемоглобина и считается отрицательным, если он остается бесцветным. Оба теста антиглобулиновый и гемолитическая анализа являются полуколичественная, так как самая высокая Серум разведение обозначается в которой тест по-прежнему положительный.

Тест антиглобулиновый и гемолитическая анализа являются надежные анализы, которые обычно используются в диагностике. Так как эти анализы полуколичественный и зависит от опыта специалиста, выполняющего анализ они не подходят для изучения тонкие различия активации комплемента по эритроцитов, при необходимости при оценке эффективности ингибиторов комплемента. Таким образом, мы разработали два количественных анализов для определения активации комплемента по (авто-) антител к эритроцитов, которые мы опишем в этой статье.

Во-первых, мы разработали анализ для измерения отложение активации фрагментов комплемента С3 и С4 на БС (рис. 1А). В этом анализе человека Bromelain обработанных типа 0 эритроцитов инкубировали с инактивированной нагреванием сыворотки пациента (источник анти-антитело RBC), свежие АВ сыворотки (источника комплемента) и анти-C5 моноклонального антитела (Eculizumab). За это вклubation, С3 и С4 осаждение произойдет, если сыворотка пациента содержит дополнение активации анти-РБК антител. Для того чтобы предотвратить лизис эритроцитов путем активации комплемента ниже по потоку добавлена ​​блокирование анти-C5 моноклональное антитело. Далее, С3 и С4 осаждение на БС обнаруживает FACS с использованием флуоресцентно меченных моноклональных антител или Fab-фрагменты, реагирующие с С3 и С4, соответственно. Память на одной БС важно обеспечить надежность результатов. Преимущества этого метода включают, что небольшой объем материала пациента требуется, активацию комплемента на ранней стадии каскада оценивается и метод воспроизводимым и количественный. Дополнительным преимуществом глядя на обоих C3 и C4 является то, что можно провести различие между классическим и лектинов активации пути (как С3 и С4 осаждения) и активации альтернативного пути (только C3 осаждения). Использование бромелаина эритроцитов, обработанных вместо необработанных эритроцитов повышает чувствительность каксказать.

Второй тест основан на используемой в настоящее время гемолитической анализа (рис. 1В). Человека Бромелайн обращению типа 0 эритроциты инкубируют с инактивированной нагреванием сыворотки пациента (источник анти-РБК антитела) и свежей сывороткой АВ (источник дополнением). Если дополнение активируется пациентов анти-антител RBC, в зависимости от дозы RBC лизис происходит, что приводит к высвобождению гемоглобина. Количество выпущенной гемоглобина количественно путем измерения его абсорбции при 414 нм в супернатанте после летел вниз неповрежденные и фрагментированные эритроциты. Оптическую плотность коррелирует с количеством произошло гемолиза. В отличие от используемого в данный момент анализа, этот протокол позволяет объективно, количественного значения гемолиз, что очень воспроизводимым и не зависит от человека интерпретации анализа.

Применение этих методов было описано в ^11, где потенциальное использование С1-ингибитора в качестве ингибитора комплемента в AIHA был ыtudied.

1. Подготовка Бромелайн обработанных ЭРИТРОЦИТОВ

1. Вымойте 0 типизированных эритроциты 3x с 1x PBS (центрифугирования при 664 мкг в течение 2-5 мин).
2. Инкубируют 1 объем эритроцитарной массы с двумя объемами 0,5% раствора бромелайн в течение 10 мин при 37 ° С
3. Вымойте клетки 3x с 1x PBS.
4. Клетки могут быть сохранены в виде 3%-ного раствора при 4 ° С в 1x PBS в течение не менее одной недели.

2. С3 и С4 осаждения Анализ на эритроциты по СУИМ

1. Тепло-инактивировать необходимое количество сыворотки пациента (или другого источника анти-антитела) RBC путем нагрева образца в течение 30 мин при 56 ° С.
2. Промыть бромелайн эритроцитов, обработанных три раза в VBG ^- (5 мМ веронал, 150 мМ NaCl, 0,05% желатина, рН 7,4) и ресуспендируют их в VBG ^{+ +} (VBG ^- + 2 мМ MgCl ₂ + 10 мМ CaCl ₂₎ с получением 0,5% раствор.
3. Пипетки следующие компоненты в круглодонную нижней пластине со стеклянной жемчуга (еили надлежащее перемешивание): 25 мкл 0,5% эритроцитов, 37,5 мкл свежей сыворотки АВ (источник дополнение) и 37,5 мкл 200 мкг / мл анти-C5. Анти-C5 является дорогостоящим и может быть трудно получить. Можно было бы рассмотреть вопрос об использовании C5-/C6-/C7- или С8-дефицитный сыворотку вместо AB сыворотки и анти-С5.
4. Добавить сыворотку пациента на лунку в конечной концентрации 0.1-33%. Правильное различий в концентрации в сыворотке на лунку в связи с использованием тепла инактивированной сыворотки АВ. Добавить VBG ^{+ +,} чтобы получить конечный объем 150 мкл / лунку. Закрыть пластина с ELISA фольги.
5. Выдержите 1,5-2 ч при 37 ° С при встряхивании.
6. Вымойте эритроциты три раза PBS + 0,5% БСА (центрифугирования при 664 мкг в течение 2 мин).
7. Добавить флуоресцентно меченных анти-С3 и С4 анти-моноклональные антитела или их фрагменты Fab (чтобы уменьшить агглютинацию) в PBS + 0,5% БСА до конечной концентрации 1 мкг / мл. Здесь специально разработанных анти-С3-Alexa Fluor 488 и анти-C4-Alexa Fluor 647 моноклональные антитела используются, выбор Фесэ флуоресцентные метки позволяет одновременное обнаружение С3 и С4 по FACS.
8. Инкубировать 30-45 минут при комнатной температуре и осторожном встряхивании.
9. Wash эритроциты 3x с PBS + 0,5% БСА.
10. Ресуспендируйте эритроциты 150 мкл в PBS 0,5% BSA и пипетки их в новую пластины (чтобы избавиться от стеклянных жемчужин перед анализом FACS).
11. Выполнить анализ FACS. Отдельные одиночные клетки из дублетов в точечной заговоре FSC-A; установить ворота на отдельных эритроцитов; выберите соответствующий канал обнаружения для сигналов флуоресценции (например FITC и APC).
12. Количественная результаты с помощью средний интенсивности флуоресценции.

Примечание: Можно использовать элемент управления изотипа (например флуоресцентной маркировкой анти-IL-6 мыши IgG1). Тем не менее, рекомендуется включать истинную отрицательный контроль, например, путем инкубации эритроцитов без сыворотки пациента (только сывороткой АВ) или без источника комплемента (инактивированной нагреванием сыворотки AB и инактивированной нагреванием сыворотки пациента),д затем окрашивают их с той же анти-С3-Alexa Fluor 488 и анти-C4-Alexa Fluor 647 антитела. Это дает более правильный контроль, чем в изотипического контроля в случае эритроцитов ^12, хотя эти различные элементы управления, как правило, дают тот же, отрицательный результат.

3. Количественный гемолитическая Анализ

1. Тепло-инактивировать необходимое количество сыворотки пациента (или другого источника анти-антитела) RBC путем нагрева образца 30 мин при 56 ° С.
2. Вымойте эритроциты 3x с VBG ^- и один раз VBG ^{+ +.}
3. Внесите следующие компоненты в круглым дном пластины со стеклянной жемчужины (для правильного смешивания): 35 мкл 3% эритроцитов, 25 мкл свежей сыворотки АВ (источник дополнением) и 1-50% сыворотка пациента. Правильное различий в концентрации сыворотки с использованием тепла инактивированной сыворотки АВ. Добавить VBG ^{+ +,} чтобы получить конечный объем 150 мкл / лунку. Закрыть пластина с ELISA фольги.
4. Инкубировать при 37 ° С в течение 1,5-2 часов при встряхивании.
5. Сentrifuge пластины на 664 мкг в течение 5 мин с пониженным замедления (например замедления до полной остановки в 2-3 мин).
6. Тщательно пипетки 90 мкл супернатанта в новом планшета для микротитрования. Важно на этом этапе предотвращает образование воздушных пузырей и предотвратить взять с собой неповрежденных клетках.
7. Измерение A414/690 в подходящем спектрофотометре.
8. Экспресс лизис как процент лизиса эритроцитов образца с чистой водой.

Рисунок 2А показывает, представитель точечный график для эритроцитов. Подходит стробирования для одиноких эритроцитов можно увидеть в де FSC-W - FSC-участке (Р1). Обычно около 95% эритроцитов находятся в пределах этой P1 ворота (одиночные клетки), но когда высокий процент сыворотки пациента используется, это может упасть до 70-80%, особенно, когда анти-РБК IgM присутствует в сыворотке пациента.

Представитель результаты влияния пациента АМСЗ сыворотки по осаждению C4 показаны на рисунке 2B и осаждения C3 на рис 2С. Как можно видеть на этих фигурах, сыворотка более пациент приводит к более осаждения комплемента, как и следовало ожидать. Любопытно, что отложение комплемента происходит в двух различных положительных пиков. Это, вероятно, не вызвано неоднородностью в популяции РБК, так как эритроциты тянутся от одного донора. Мы по-прежнему расследует причины этого явления. Рисунки 2D и 2E демонстрацийт.е воспроизводимости С4 (рис. 2D) и С3 (рис. 2Е) осаждения анализах. Они также показывают значительные различия в способности осаждения дополнением различных образцов пациентов АМСЗ.

Представитель результат анализа гемолитической с АМСЗ пациент образца сыворотки, содержащей аутоантитела к эритроцитов можно видеть на фигуре 3А. Как правило, титрование образца сыворотки дает хороший, воспроизводимый кривую. Пациент сыворотки значительно различаются по комплемента активации способности, поэтому выполнить титрование каждой сыворотки пациента. Образцы без сыворотки пациента, как правило, дают фон вокруг 10-15% за счет поглощения образца сыворотки, используемой в качестве источника комплемента. Таким образом, следует соблюдать осторожность, чтобы использовать достаточно высокую концентрацию в сыворотке крови пациента, чтобы получить сигнал, который существенно выше этом фоне. С подходящего ингибитора комплемента как анти-С5, сигнал гемолитическая можно титровать от, как показано на FНа рис 3B.

Рисунок 1. Схематический обзор осаждения анализа С3-и С4 (А) и количественного анализа гемолитической (б). Короче говоря, в осаждения анализа С3-и С4, дополняют осаждения, вызванную пациента АМСЗ сыворотке измеряли, а в гемолитической анализа гемолиза индуцируется обнаружен больной АМСЗ сыворотки. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 2. Представитель результаты С3 и С4 осаждения аДни рождения Ssay.) Предлагаемые стробирования стратегию. На рисунке вы видите, как выбрать только для одиночных эритроцитов (P1, красный). В агглютинирует показаны в зеленом (Р2). Б) Эффект титрования пациента АМСЗ сыворотки по осаждению C4. Контроль изотипа (анти-IL-6 мыши IgG1) показан в виде твердого серого, в то время как образец черным цветом. Увеличение количества сыворотки пациента приводит к увеличению C4 осаждения. С) подобно тому, как б), но теперь с обнаружением для осаждения C3. D) C4 осаждение FACS результаты изображены на график, показывающий воспроизводимость анализа и показывает значительные различия между образцами сыворотки от разных пациентов. Ось Y представляет среднее интенсивности флуоресценции. Е) Похожие как D), но теперь для нанесения C3. Кликните здесь, чтобыпосмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 3. Представитель результаты количественных гемолитических анализов.) АМСЗ пациент сыворотки титрования в гемолитической анализа, показывающие, что лизис увеличивается воспроизводимо с концентрацией сывороточного пациента. Нет лизиса не происходит со здоровой донорской сыворотки (в оранжевый; отрицательного контроля) B) подходящего ингибитора комплемента (анти-C5 в данном случае) может отменить опосредованного комплементом лизиса.. На рисунке вы видите титрования анти-C5, когда пациент сыворотки АМСЗ выдерживали при постоянной концентрации. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Вышеуказанные анализы воспроизводимым и надежным. Они легко выполнить и можно выполнять их со многими образцов в то же время (в 96-луночный планшет с). Таким образом, этот подход будет также подходит для полностью автоматизированной системой, например системы робота ELISA. В отличие от используемых в настоящее время методов, эти анализы количественный и это поможет, например, при изучении эффекта ингибиторов комплемента. Кроме того, интерпретация цель, которая является улучшением по сравнению с используемыми в настоящее время анализов.

Оба анализа есть один важный шаг. Важно при анализе FACS является воротами на отдельных эритроцитов, потому склеены эритроциты даст искусственно высокий сигнал, так как они считаются как одно событие. Это даже лучше, чтобы предотвратить склеивание с помощью низкие концентрации сыворотки пациентов, так как низкие концентрации по-прежнему дают хорошие сигналы. В гемолитической анализа, крайне важно, чтобы тщательно передачи надосадочную Aосле инкубации в новой пластинкой, так как уноса эритроцитов приведет к ненадежной сигнала (как воздушные пузырьки). Рекомендуется использовать 0-типизированных эритроциты в обоих анализах во избежание путаницы с активации комплемента АВ0 рассогласования.

Из-за их надежности и устойчивости эти анализы пригодны для изучения эффективности ингибиторов комплемента для AIHA как показано в ссылке ^11, в целях выявления количественно тонкие различия в активации комплемента. Из-за их чувствительности эти анализы могут обнаружить активации комплемента у больных, где активации комплемента на RBC настоятельно рекомендуется, но не обнаруживается рутинных анализов, например, в Coombs-отрицательной АМСЗ, хотя это утверждение еще требует проверки. Они также могут быть использованы для определения комплемента активации емкость алло-антителами (индуцированных при переливании крови или, например, в RHD ^- матери подшипника ребенка RhD ^+), которые могут помочь клиницисту предсказаният клиническое поведение обнаруженного аллогенное антитело.

Авторы не имеют ничего раскрывать.

SZ и DW получить неограниченный грант ViroPharma.