Floresan Proteinler ifade Canlı Farelerde Görüntüleme hücrealtı Yapıların Intravital Mikroskopi

Intravital mikroskopi canlı hayvanlarda çeşitli biyolojik süreçleri görüntüleme sağlayan güçlü bir araçtır. Bu yazıda, canlı farelerde tükürük bezlerinde bu salgılama granüller gibi alt-hücresel yapıların, dinamiklerini görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz.

Burada konfokal mikroskopi intravital kullanımına dayanan, canlı kemirgenlerde görüntü hücre içi yapılarda hiç bir yöntem tarif eder. Onlar çeşitli avantajlar sağlamak beri bir model organ olarak, biz canlı farelerin tükürük bezleri kullanın. İlk olarak, kolayca optik erişim sağlamak maruz bırakıldı ve kalp atışı ve solunum nedeniyle hareket eserler azaltılmasını kolaylaştırmak için stabilize edilebilir. Bu durum görüntü ve küçük hücre içi yapıları izleme kolaylaştırır. İkinci olarak, tükürük bezlerinin hücre popülasyonlarının çoğu organın yüzeyinden erişilebilir. Bu, iki foton mikroskopi gibi in vivo görüntüleme için kullanılmış olan diğer teknikler, daha yüksek bir uzamsal çözünürlüğe sahip konfokal mikroskopi kullanımına izin verir. Son olarak, tükürük bezleri kolayca böylece moleküler düzeyde biyolojik süreçleri araştırmak için güçlü bir sistem sağlayarak, farmakolojik ve genetik olarak manipüle edilebilir.

Bu çalışmada akinar hücrelerinde salgılama granüllerin Ekzositoz ve salgı granüller beta-adrenerjik reseptörlerin stimülasyonu üzerine sigorta apikal plazma zarının dinamiklerinin kinetiğini takip etmek için tasarlanmış bir protokol üzerinde odaklanır. Özellikle, sitosolik GFP floresan protein ve tandem-domates ile ikame edilmiş bir membran-hedefli bir peptit birlikte-ifade eden transgenik bir fare kullanılmıştır. Ancak, tükürük bezleri stabilize etmek ve görüntü için kullanılan prosedürler, diğer fare modellerinde uzatıldı ve bu endozomlarda, lizozomlarda, mitokondri gibi çeşitli hücre içi yapıların görselleştirme sağlayan, in vivo hücre bileşenleri etiketlemek için diğer yaklaşımlar akuple edilebilir ve aktin hücre iskeleti.

Geçtiğimiz iki yıl içinde canlı mikroskobu gelişi ve floresan proteinlerin kullanımı, böylece hücre biyolojisi ¹ anlayışımızı ilerleyen, akla gelebilecek her hücresel süreç üzerinde büyük atılımlar yol açmıştır. Bu alan deneysel manipülasyonlar konusunda özellikle son derece güçlü modeli sistemleri, memeli hücre kültürlerinin kullanılması büyük faydalar vardır. Ancak, genellikle karmaşık çok hücreli organizmaların ² biyoloji gerçek temsilini vermemektedir. Bu sorun, nörobiyoloji, immünoloji ve tümör biyolojisi ³ gibi alanlarda önemli biyolojik soruları soruşturma için kapıyı açtı intravital mikroskobu (IVM) geliştirilmesi ele başlanmıştır. Şimdiye kadar, IVM göre çalışmaların çoğu hücre içi bölmelerin dinamikleri hakkında herhangi bir bilgi vermeden, doku ve tek tek hücrelerin düzeylerinde ifa edilmiştir. Son zamanlarda, laboratuvar ve diğers canlı kemirgenler ^{4-7, 13-15} ve in vivo olarak farmakolojik ve genetik manipülasyonlar izin görüntüleme hücre içi yapıların sahip IVM teknikleri geliştirmiştir. Bu yaklaşım, in vivo membran ticaretini incelemek için bizim tarafımızdan kullanılan ve daha spesifik endositoz ve ekzositoz olayları ^6,7 düzenlenmiştir.

Bizim deneysel model sistem, teşhir stabilize ve anestezi kemirgenler submandibular tükürük bezleri (SGS) görüntüleme dayanmaktadır. IVM için bir model organı olarak SG-seçimi bezleri küçük bir ameliyat ile kolayca erişilebilir olması nedeniyle, kendi fizyolojisini ödün vermeden dışsallaştırılabileceği ve kalp atışı ve solunum nedeniyle hareket eserler azaltmak için stabilize edilebilir. Buna ek olarak, SGS seçici tükürük kanal ^8,9 ile viral veya non-viral vektörlerin ya da bazlı püskürtülmesiyle genetik olarak manipüle edilebilir. Son olarak, SGS polarize epith oluşan salgı bezleri vardırasinüsü ve kanalları, miyoepitelial hücreler ve stromal hücrelerin karmaşık bir populasyonu oluşturmak Elial hücreleri. Bu nedenle, onlar bizim son çalışmalarda ¹⁰ vurgulandığı gibi, ekzositoz, endositoz, gen teslimi ve aktin iskeletinin çalışma, ve bu hücre polarite, hücre bölünmesi, hücre-hücre biyolojisi gibi yönlerini çalışma fırsatı sunmak için mükemmel bir model vardır hücre kavşaklar ve iyon kanalları.

Bu yazıda detaylı olarak canlı bir fare SG-epitelinde subselüler çözünürlük elde etmek için bir görüntüleme protokol açıklar. Özellikle, biz nasıl regüle ekzositoz sırasında SGS asiner hücrelerinde görüntü salgı granülleri göstermek. Daha önce gösterildiği gibi, beta-adrenerjik reseptör agonistleri ile uyarılması üzerine, salgı granüller apikal plazma membranı ile füzyon ve kademeli olarak daraltmak için asinar kanalcık ⁶ içine içeriklerini serbest bırakır. Amacımız m araştırmacılara temel araçları sağlamak içincerrahi prosedürler ve hayvan kullanımı konusunda inimal deneyim, başarılı bir hücrealtı çözünürlükte IVM gerçekleştirmek böylece. IVM de en zorlu kısmı hayvanın hazırlık olduğundan, burada biz onların işlevini ödün vermeden SGS ortaya çıkarmak ve hareketsiz için kullanılmaktadır temel cerrahi prosedürlerin açıklaması odaklanın. Sistemik floresan probları teslimi, transgenik hayvanların kullanılması ya da her ikisinin bir kombinasyonu gibi alt-hücresel yapılar, çeşitli stratejiler, etiketlemek için işlemler için olduğu gibi, başka bir yerde ^7,11 tarif edilmiştir.

Bölüm 1: Mikroskop ve Görüntüleme Kur hazırlanması

1. Herhangi bir ters konfokal mikroskop IVM için uygun olmalıdır. Bu çalışmada, Fluoview-1000, konfokal lazer tarama ünitesi ile donatılmış bir Olympus IX81 ters mikroskop kullanılmıştır. Mümkün olan en iyi çözünürlük elde etmek için, bu tür su daldırma UPLSAPO 60x/1.20 NA ve yağ daldırma Plan-Apo 60x/1.42 NA gibi yüksek NA hedeflerinin kullanılması tavsiye edilir. Yağ daldırma hedefleri daha toplama verimliliği vardır ve doku ve hedef arasında bir lamel kullanımını gerektiren ne kadar yüzeyinden 15-20 um olan görüntü alanları için kullanıldığında, daha iyi bir görüntü kalitesi sağlar. Ayrıca, yağ kullanımının daha uzun görüntüleme oturumları sırasında su buharlaşması için endişe ortadan kaldırır. Sıcaklık ve nem muhafaza etmek amacıyla, mikroskop tamamen kapalı olmalıdır ve sıcak ve nemlendirilmiş hava ile birlikte. Alternatif olarak, hayvan, mikroskop sahne veamaç başka yollarla ısıtılmalıdır. Örneğin, kimyasal ısı yastıkları hayvan ve aşama için kullanılabilir ve özel olarak tasarlanmış amacı ısıtıcılar objektif (Şekil 1A) için kullanılabilir. Amaç ısıtıcı prosedürü başlamadan önce 30 dakika açık olmalıdır. Not: ısı pedleri bir gazlı pad ve deri arasındaki yerleştirmek zorundadır sıcak hayvan tutmak için kullanımı zaman. Cilt yanıkları için izlenecek vardır.
2. Ticari olarak temin edilebilen confocal mikroskoplar çoğunda, standart aşamaları slaytlar, Petri kapları, ve farklı boyutlarda plakaları uyacak şekilde kullanılan çeşitli sahipleri eklemek için kullanılan bir açıklığa sahiptir. 35 mm Petri kapları için IVM, standart bir sahne ekleme yapmak için, sonra yüksek vakum silikon gres veya maskeleme bandı (Şekil 1A) tarafından güvenli bir 40 mm cam slayt ile kaplı, baş aşağı çevrilir. Özel bir insert da 3 mm kalınlığında alüminyum levha imal edilebilir. Cam yüzeyi daha sonra Cl% 70 etanol ile eaned ve bir Kimwipe ile sildi.
3. SGS immobilizasyon (sabitleyici) için özelleştirilmiş bir tutucu imalatı. Sahibinin amacı yerinde SGS ve sahne ve lamel onları katı çift stabilize etmektir. Tutucu bir 60 mm plastik Petri kabı yapılabilir. İlk olarak, çanak alt duvarlardan uzak kırılmış ve yaklaşık 15 x 10 mm'lik dikdörtgen halinde kesilir. Sonra, kenarları ince zımpara ile yuvarlanır ve parlatılır. Dört pulu (1.5-2 mm) 1 ml şırınga plançerleri lastik ipuçları kaldırarak tarafından inşa edilmiştir. Ince zımpara kağıdı, ayırıcıların yüzey ve plastik parçanın dört köşe kullanılarak cilalanır. Ayırıcılar sonra jelatinli superglue kullanılarak yapıştırılmış ve daha sonra düz bir yüzeye ince zımpara kullanarak düzeltti. Yaşlı hayvanlar için, sahiplerinin boyutu ve aralama biraz daha büyük bezleri karşılamak için artırılabilir gerekebilir, dikkat edin.
4. Optik bağlaştıncı jel hazırlanması. % 0.3-Carbomer 940 (Tablo 2) jel ultra saf su ve 100 ml kadar ısınma ve D-Sorbitol 5,47 g çözülmesiyle hazırlanır. Daha sonra, Carbomer-940, 0.3 g ilave edilir. Beher kaplanmış ve karıştırılan bir sıcak plaka (en düşük ısı ayarı) üzerine yerleştirilmiş birkaç saat ya da tüm karbomer kümeleri tamamen çözülene kadar olmalıdır. Yaklaşık 7.4 'lik bir pH elde edilinceye kadar son olarak, Trietanolamine, damla damla yavaşça karıştırılarak ilave edilir. Jel 4 ° C'de ¹³ saklanır.

Bölüm 2: Hayvanlar ve Anestezi

1. Hayvanlarla deneylerini önce protokolleri yerel hayvan bakımı ve etik kurul tarafından onaylanmış olması gerekir. Önemlisi, araştırmacılar düzgün cerrahi işlemleri gerçekleştirmek ve prosedür geçmeden önce yerel hayvan bakım komitesi veya kurum veteriner danışmalısınız eğitilmelidir.
2. Bu çalışmada, bir fare modeli (GFP / mTomato-fare) çözünür GFP (GFP-fare) eksprese wi FVB fare melezlenerek elde edilenfloresan protein tandem-domates (mTomato-fare) ⁶ ile ikame edilmiş bir membran-hedefli bir peptidi eksprese eden th C57B6 farenin kullanılmıştır. Not: genellikle tam anestezi ve görüntüleme için prepped olmak hayvan için 20-30 dakika sürer
3. Fareler, hayvan barınağında kontrollü bir ortamda tutuldular ve daha önceki deneyden bir hafta boyunca ortama alışmaları sağlanır. Bu adım, gelişmiş salgılama faaliyeti ¹² herhangi bir sıkıntı sonuçları yana SGS görüntülenmesi için gereklidir. Su ve gıda ad libitum olarak verilmiştir. 2 -5 ay arası Erkek görüntüleme deneyleri (20-30 g) için kullanılır.
4. Önce anestezi, anestetik uygun dozu belirlemek için hayvanlar tartılır.
5. Enjekte edilebilir anestetikler verilmesiyle indüklenen gerilim SGS salgı aktivitesi bozabilir için, anestezik enjeksiyonu takiben, izofluran teneffüs tarafından önceden anestezi neden olur. Bu amaç için, çok yavaşça buharlaştırma odasına fareler yerleştirin veoksijen akışı (800-900 mmHg) açın. Öncesi anestezi indüksiyon başlatmak için% 3 izofluran seviyelerini ayarlayın.
6. Hayvanlar bilinçsiz kez, periton boşluğu (25 G iğne) bir 100 mg / kg ketamin karışımı ve 20 mg / kg ksilazin enjekte edilir. Anestetik taze tuzlu su içinde 20 mg / ml ila 100 mg / ml ksilazin seyreltilmesi ve daha sonra ketamin ile karıştırılarak hazırlanır. Bu karışım, daha fazla tuz ile 1:1 seyreltilir ve uygun bir miktar hayvanların ağırlığına göre enjekte edilir. Bu seyreltme yanlışlıkla aşırı dozda önlemede yardımcı olur. Karışım, 20 dakika sonra etkisini kaybeder unutmayın.
7. Uyanıklık belirtileri hayvanları gözlemlemek ve onlar (bundan sonra her saat ilk enjeksiyondan sonra 45 dakika içinde ilk dozun yaklaşık% 75 ve% 50) anestezi çıkan ise daha fazla anestezik karışımı enjekte. Pençe kısma ve tepkisini gözlemleyerek her 15 dk anestezi derinliğini kontrol edin. Not: Her zaman önlemek için oftalmik merhem yönetmekgöz kuruluğu.
8. Anestezikler deneylerin tekrarlanabilirliği ve hayvan sağlığını etkileyen, hangi hipotermi neden. Bu nedenle, fareler ısı lambası altında ya da deney süresi boyunca ısıtılmış bir yüzey üzerinde tutulmalıdır. Not: ısı lambası yanan önlemek için hayvanın en az 12-18 santim olmalıdır
9. Hayvanların vücut sıcaklığı bir rektal sıcaklık probu ile donatılmış bir termometre ile kontrol edilmesi gerekir.

Bölüm 3: Intravital Mikroskopi Hayvan Cerrahisi ve Konumlandırma

1. Temiz ve steril olması gereken tüm cerrahi aletlerin (Tablo 1) ile çalışma alanını hazırlayın.
2. Elektrikli kesme makinesi ile fare boyun alan tıraş. % 70 etanol ile ıslatılmış bir gazlı bez ile anestezi fare boyun bölgesinde ventral tarafı aşağı silin. Kimwipe ile fazlalığı kurulayın.
3. Donuk kavisli cımbız orta hat (yakla de cildin küçük bir parça yukarı kaldırınyaklaxık Masseter kasların alt ucunda) ve küçük bir kesik (Şekil 1 B) tercih.
4. Ağzına makas takın ve makas bıçakları açarak uzakta yatan doku cilt ayırmak. Cildin alt doğru makas yukarı doğrultarak yatan glandüler doku zarar kaçının. Cildin daha derin dokulara (Şekil 1 B) ayrılır kadar bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
5. Makas kullanırken, yaklaşık 3 mm genişliğinde gevşek cilt ve uzun 10 mm'lik bir şerit kesip. Açılış sinir, kanal ve kan damarları vücudun geri kalanına bezi bağlamak SGS tabanına yakın başlar, böylece deri kesilmelidir. Yara bölgeyi temizledikten sonra, sonuçta açılış oval olması ve yaklaşık 8 x 12 mm ölçer. Hem SGS açıklık (Şekil 1B) sonra görünür olacaktır.
6. Bir şırınga ile kesme ortasına optik bağlantı jel uygulamak ve doğru silinsteril gazlı bez ile dışarıda. Her açıkta kalan dokuya saç ya da kan girişini önlemek için silme için temiz bir gazlı bez parçaları kullanılmalıdır. Tüm kan ve gevşek saç kaldırılıncaya kadar bu adımı tekrarlayın.
7. 7. cımbız kullanarak, uzak sağ submandibuler bezden bağ dokusu (alternatif olarak bu protokol sol SG-kullanılabilir) bezinin tabanına tüm yol ayırın. İlk olarak, SG ucunu bulmak ve birkaç milimetre bezinin ucu üzerinde bağ dokusu al. Parankimini zarar vermeden bezinin etrafında bağ doku gözyaşı. (Şekil 1B). Bezinin maruz kaldığı zaman, hafifçe bezinden bağ dokusu ayırın. Kanama oluşursa, tuzlu su ile kanı yıkayın. Tüm bağ dokusu ayrılır ve bezi tamamen açık olduğundan emin olun. Düzenli olarak optik kuplaj jel uygulayarak nemli bezi tutun.
8. Önce mikroskop hayvan getiren, gazlı bez kalın bir parça ve hea yerleştirint 38 ± 2 ° C'lik bir sıcaklığı korumak için mikroskop sahneye paketi Kimyasal ısı paketinin sıcaklığı atmosfere iç kese maruz kesim büyüklüğüne göre ayarlanabilir. Gazlı bez metal aşamasından ısı paketinin bir izolasyon sağlar. Hem gazlı ince bir parça ile ısı paketinin üst kapağı.
9. Yan (sağ bezi için sağ tarafı) ve gazlı bez üzerine hayvan yerleştirin. Lamel (Şekil 1C) ortasına yerleştirilen submandibuler tükürük bezi ile hayvan yerleştirin.
10. Hayvan bezi hareketsiz önce sabitlenir ve bu pozisyonda stabilize edilmelidir. Farenin sağ ön pençe ventral tarafta maskeleme bandı bir parça yerleştirin. Bir ipek sütür (Şekil 1C, inset) tarafından fare kesici dişler kanca. Ipek iplik ve pençe arasında bazı gerginlik oluşturmak ve maskeleme bandı ile sahneye ekleyebilirsiniz. SG ortasında doğal istirahat edilmelidirlamel. Kafa ve göğüs ek aşamasına akuple edilebilir plastik kamalar ile stabilize edilmelidir.
11. Bezi (Şekil 1C) üzerinde dokuların temizlenmesi lens küçük bir parça yerleştirin. Biraz bezi uzatmak ve bezi üzerinde özelleştirilmiş bir tutucu yerleştirin. Maskeleme bandı ile sahneye sıkıca çift sabitleyici. Kavrama aşama (Şekil 1C) bağlı bir metal kelepçe ile geliştirilebilir. Onlar kan akımını bozabilir olarak gerilim ve keskin açılar kaçınılmalıdır. Stabilizasyon (pembe renk muhafaza edilmelidir) görsel bezi inceleyerek veya epifluoresan yoluyla kan akışını incelemek hemen sonra. Kan damarları ve kan hücrelerinin çeşitli de m-domates ile etiketlenmiş çünkü GFP / m-domates fare olarak, kan akımının bütün değişiklikler kolayca değerlendirilebilir.
12. Gazlı bez ve ısıtmalı ped ile hayvan örtün. W teçhiz edilmiş bir termometre kullanarak maruz bezinin sıcaklığını ölçmekith maruz bezinin bir tarafı ile temas halinde yerleştirilmiş olan küçük bir esnek termokupl sondası.

Bölüm 4: Görüntüleme Parametreleri

1. GFP veya RFP filtre kümesini kullanarak ya bezinin yüzeyi üzerinde epifloresans aydınlatma odak kullanma. SG yüzeyini bulun ve kılcal kan akışını ve doku genel morfolojisi değerlendirmek. Doku hasarı belirtileri, zann kabarmasıyla veya büyük hücre arası boşlukların görünümünü içerir.
2. Ya epifluoresan ile ya da seçilen alan ön tarama ile doku stabilitesini değerlendirmek. Hareket eserler çoğu post-processing veri analizinde kaldırıldı veya düzeltilmiş olamaz beri istikrarlı bir hazırlık esastır. Hazırlık kararlı değilse, ayarlamalar gereklidir.
3. Uygun odak düzlemi görüntüyü ön-tarama modu (1X zum) olarak bezleri bulmak ve yavaş yavaş asiner yapılar, salgı granülleri ve p kadar lamel doğru hedefe taşımak içinLasma zar (Şekil 2) açık bir şekilde görünür hale gelir.
4. Geçen zaman için görüntüleme parametreleri, bireysel deneye bağlıdır. Görüntü salgı granülleri dinamikleri 0.5-2 saniye / kare bir tarama hızı kullanmak ve bir 0.2 mm / piksel mekansal ölçek (yaklaşık 50 mikron x 50 mikron görüş alanında) ile 256 x 256 piksel. Optimal olarak granüller ve plazma membranını görselleştirmek amacıyla, optik kalınlık 0,9-1,2 um arasında ayarlanmalıdır. GFP ve tandem-domates tahrik etmek için, bir sırası ile, 488 nm ve 561 nm arasında bir dalga boyuna kullanabilir. Tepe gücü 488 nm ve 561 nm için 1 mW için yaklaşık 0,5 mW ayarlanır. Bu minimal photobleaching sağlar.
5. Detektör ayarları dinamik aralıkta muhafaza sinyali ve numune parlaklığına bağlı ayarlanması gerekir.
6. Tüm parametreleri ayarlandıktan sonra, görüntüleme başlamış olabilir. İlk olarak, bir referans noktası olarak kullanılacak görüş alanının bir fotoğrafını çeker. Sürezaman atlamalı görüntüleme, X, Y ve Z doku sürüklenen oluşabilir. Bu manuel olarak tarama alanı ve Z konumunu ayarlayarak telafi edilebilir. Ayarlamaları ve yavaş yavaş, küçük artışlarla eserler önlemek için yapılmalıdır. Ayrıca, referans resim ışıkla ağartma meydana olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir. Önemli photobleaching (floresan fazla% 15-20 azalma) tespit edilirse, 0.1 mW ile lazer gücünü azaltır.
7. Tuzlu su içinde, izoproterenol taze hazırlanmış bir solüsyonu enjekte deri altından 0.1 mg / kg, eksositosizini teşvik etmek. Ekzositoz enjeksiyondan sonra yaklaşık 1 dakika tetiklenir. Plazma membranı ile füzyonu granülleri tanelerin çevresinde GFP floresan bir artış ve sınırlayıcı membran içine tandem-Domates peptidlerin difüzyon (Şekil 3) tarafından tespit edilecektir. Biz aynı bölgede 3-4 time-lapse dizileri, 10 dakika her edinme öneririz.
8. Görüntüleme oturumundan sonra, ane euthanizeötenazi odasında CO ₂ inhalasyon (10 dakika için 10-12 mmHg) tarafından hayvan sthetized.

GFP / mTomato fare, acininin sitozolik GFP ve membran hedefli tandem-Domates peptid (Şekil 2, kırık çizgi) ifade açıkça farklı yapıları, görünür. Bireysel asinüs olarak, asiner hücreler tandem-Domates peptid tarafından betimlenir. GFP, aynı zamanda açık bir şekilde (Şekil 2, oklar) acinar hücreleri içinde görebilir çekirdeklerinde tespit edilir. Sitozolik GFP çapı yaklaşık 1-1.5 mikron koyu dairesel veziküllerini (Şekil 2, inset, ok uçları) görünür salgı granülleri çıkarılmıştır. Ekzositik olayları görselleştirmek için, (3, Şekil yıldız işareti) ifrazi tanecikler içerisinde zenginleştirilmiş plazma zarının bir alanda odaklanır. 0.1 mg / kg izoproterenol subkütan enjeksiyondan sonra, plazma zarı (Şekil 3, yeşil oklar) yakın olan bir salgı granüllerin yaklaşık GFP floresans seviyelerinde bir artış görülebilir. P olarakreviously gösterilen bu granüller, plazma membran ile birleşir ve sitoplazmik GFP ⁶ muhafaza eden bir kalın bir ağ örgüsü aktin işe. Buna ek olarak, plazma membranı ile füzyon sonra, tandem-Domates peptid salgı granüller (Şekil 3, kırmızı oklar) sınırlayan membran içine yayılır. 30-40 saniye sonra, yavaş yavaş salgılama granüller daraltmak ve sınırlayıcı membranlar, apikal plazma zarının entegre edilmiştir.

Şekil 1. Mikroskop, cerrahi girişimler ve hayvan konumlandırma kurmak. A. 35 mm Petri kapları tutmak için tasarlanmış bir kademeli uç 40 mm örtücü kısım ile kaplıdır. İnsert ısıtılmış tamponlar (turuncu oval) ve ısıtılmış bir lamba ile önceden ısıtılmış olan mikroskop aşamada yerleştirilir. Amaç, ön olduğu . Tükürük bezleri maruz B. Cerrahi yöntemler: nesnel bir ısıtıcı (38 ° C sıcaklık ayar) ile ısıtmalı. Temiz makas kullanarak, bir kesik boyun bölgesinde cilt üzerinde yapılır. Makas temel doku cilt ayırmak için açıklığa sokulur. Cilt daha sonra çıkarılır ve bağ dokusu hafifçe cımbız kullanarak bezlerinin birinden soyulur. C. Hayvan önceden ısıtılmış sahne üzerindeki tarafına yerleştirilir ve bez yavaşça çekilir ve lamel ortasına yerleştirilir . Kesici dişler ipek iplik (inset) ile sahneye bağladım. Lens temizleme doku küçük bir parça bezi ve organ tutucu arasına sıkıştırılmıştır. Organ tutucu sonra maskeleme bandı (yeşil) ile sahnede sabitlenmiş bir kelepçe ile stabilize edilir.

oad/50558/50558fig2.jpg "/>
Şekil 2. Canlı GFP / mTomato fare tükürük bezlerinin bir görüntüleme alanı Temsilcisi görüntü. Acininin güzel GFP kanalı (yeşil kesik çizgi) vurgulanır. Tek hücreler, plazma zarı (kırmızı kesik çizgi) ile lokalize td-Domates peptid tarafından tarif edilmektedir. GFP sitoplazma ile çekirdek (oklar) lokalizedir, ancak salgılama granüller (ilave, ok başları) dahil değildir. Bar, 10 mikron.

Izoproterenol 0.1 mg / kg 'lık enjeksiyonu üzerine salgı granül eksositosizini gösteren Şekil 3,. Örnek zaman dizisi. Granülleri, plazma zarının (yıldız) yakın görüntülendi. Plazma membranı, salgı granülün çevresinde GFP düzeyleri ile füzyon sonras anlamlı (yeşil oklar) artırmak ve td-Domates peptid kendi sınırlayıcı zarlarına (kırmızı oklar) içine yayılır. Salgı granülleri yavaş yavaş çökmeye ve membranlar apikal plazma zarı içine entegre edilmiştir. Bar, 5 mm.

Tablo 1. Malzemeler

Tablo 2. Aletleri

Şimdiye kadar hücre içi yapılar daha çok in vitro (örneğin, hücre kültürleri,) ya da sık sık olduğu gibi canlı dokuların ^6'nın özelliklerini özetlemek olmayan ex vivo (örneğin, organ kültürleri, doku dilimleri, asinar preparatlar) model sistemlerinde de görüntülenmiştir edilmiştir. Bu fareler yaşayan belirli bir membran kaçakçılığı adım (yani regüle ekzositoz) dinamiklerini görüntüleme sağlayan bu yana, bu anlamda, burada sunulan yaklaşımı büyük bir atılım temsil eder.

Bu protokol, vücut boşluğuna ^10,11,13-15 SGS veya diğer organların in vivo görüntüleme için tasarlanmış diğer prosedürlere bakımdan ile önemli bir gelişmeyi temsil etmektedir. Bizim daha önceki bazı çalışmalarda, cerrahi işlemler daha esnektir büyük organlara sahip sıçanlarda yapılan ve farelere kıyasla azalmış kalp hızı edildi. Farelerde prosedürleri kurmak zor olmasına rağmen, onlar birkaç Adva sağlamakhastalık modelleri, transjenik ve nakavt hayvanların geniş bir spektrum kullanımı olasılığı dahil olmak üzere ntages. I) kan akışını azaltarak, ii) mimari dokusu zarar, ve iii) normal işlevini bozar: Buna ek olarak, bu yaklaşımın başarılı maruz organları dolayısıyla da risklerin azaltılması üzerine uygulanan basıncı üzerinde daha iyi bir kontrol sağlayarak, hareket eserler minimize organın. Bu, organ sahibi tarafından oluşturulan kısıtlaması ortadan kaldırılması ve bir stabilizatör ^10,11 getirerek çözüldü önemli bir husustur.

Bu protokolde en önemli adımlardan biri hayvanda ve maruz organın hem de uygun bir sıcaklığı korumak için bir. Gerçekten de, anestezi ağır hipotermi neden olur ve uygun vücut ısısını muhafaza önemli ölçüde deney tamamlanmasından önce ölüm şansını azaltır. Ayrıca, açık bir organ hızla cerrahi proc hem sırasında dış çevre ile ısı alışverişiedures ve görüntüleme. Sıcaklık, yerel azaltılması ciddi ekzositik adımları kinetiğini yavaşlatabilir zamandan beri, bu ısı lambası, amaç ısıtıcı ve birleştirme jel ya da sıcak bir tuzlu su ya da nemli tutarak bezi kullanarak bunu önlemek için çok önemlidir. Bir çevre bölmesi ile mikroskop tam muhafaza de sıcaklığını kontrol etmek için iyi bir çözümdür. Diğer bir kritik adım stabilizasyon ve kan akışının bakım arasında uygun bir denge elde etmektir. Gerçekten de, uygun bir şekilde kararlı olmayan bir hazırlık olarak, bu boyutlar mikron aralığında olan salgılama granüllerin kinetiğini takip etmek çok zordur. Öte yandan, büyük vakuoller veya düzenlenmiş Ekzositoz önemli bir inhibisyonu oluşumunda kan akımı sonuçlarının azaltılması. Bu dengeyi sağlamak için sürekli kan akışını izlemek ve organı stabilize etmek için basınç uygularken hücresel hasar belirtilerini kontrol etmek önemlidir.

Bu protokolün iki ana sınırlamalar edinme hızı ve görüntüleme derinliği vardır. Galvanometre tabanlı konfokal mikroskoplar salgı granülleri kademeli çöküşünü görselleştirmek için yeterli zamansal çözünürlüğe sahip olsa da, onlar milisaniye sırasına meydana füzyon öncesi ve füzyon olayları takip izin vermez. Bu yönü rezonans tarayıcıları ile donatılmış dönen disk mikroskoplar veya lazer tarama mikroskop kullanımı ile geliştirilebilir. Derinlik açısından, konfokal mikroskopi tükürük bezlerinin yüzeyinin altındaki ilk 30-50 um kazanılmasını sınırlar. Bu asinar yapıların görüntüleme 1 kat sağlar ve tükürük kanallarının görüntüleme izin vermez. Bu sınırlama, her ne kadar bir uzamsal çözünürlük pahasına, 100-150 um derinliğe kadar görüntülemeyi sağlayan iki foton mikroskopi kullanılarak aşılabilir.

Bu çalışma için simultane IMAGI sağlayan bir transjenik fare seçilmiş olmasına rağmensalgı granüller ve apikal plazma zarının ng, burada tanımlanan prosedürler diğer bazı hücre içi işlemleri incelemek için uzatılabilir. Bu özel hücresel yapılar etiket ve SGS üzerine ya da sistemik olarak ya da doğrudan tatbik edilebilir floresan etiketli moleküller kullanılarak elde edilebilir. Alternatif olarak, floresan-etiketli moleküller ifade yeni transjenik fare modelleri, glukoz nakil GLUT4, F-aktin işaretleyici LifeAct, nükleer histon işaretleyici 2B fare ve otofaji işaretleyici LC3-GFP olarak geliştirilmiştir. Son olarak, yüksek çözünürlükte SGS hareketsiz ve görüntü için geliştirilmiş olan temel strateji potansiyel olarak diğer organlarda (örneğin, pankreas, karaciğer, böbrek ve meme bezleri) büyüklüğü birkaç değişiklik getirerek ya da sabitleyici şeklini uzatılabilir.

Bu araştırma NIH İntramural Araştırma Programı, Diş ve Kraniofasial Araştırmalar Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.