حيوي داخلي المجهري للهياكل التصوير التحت خلوية في الفئران لايف تعرب عن البروتينات الفلورية

intravital المجهري هو أداة قوية تمكن التصوير العمليات البيولوجية المختلفة في الحيوانات الحية. في هذه المقالة، نقدم طريقة مفصلة لتصوير ديناميات الهياكل التحت خلوية، مثل حبيبات إفرازية، في الغدد اللعابية من الفئران الحية.

نحن هنا وصف الإجراء لصورة هياكل التحت خلوية في القوارض الحية التي تقوم على استخدام intravital المجهري متحد البؤر. كجهاز نموذج، ونحن نستخدم الغدد اللعابية من الفئران الحية نظرا لأنها توفر العديد من المزايا. الأولى، فإنها يمكن أن تتعرض بسهولة لتمكين الوصول إلى البصريات، واستقرت لتسهيل الحد من الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. هذا يسهل بشكل كبير التصوير وتتبع هياكل التحت خلوية صغيرة. الثانية، فإن معظم السكان خلية من خلايا الغدد اللعابية يمكن الوصول إليها من سطح الجهاز. هذا يسمح باستخدام المجهر متحد البؤر التي لديها القرار المكانية أعلى من غيرها من التقنيات التي استخدمت لفي الجسم الحي التصوير، مثل اثنين من الفوتون المجهري. أخيرا، الغدد اللعابية يمكن التلاعب بها بسهولة عقاقيري وراثيا، وبالتالي توفير نظام قوي للتحقيق في العمليات البيولوجية على المستوى الجزيئي.

في هذه الدراسة ونحن نركز على بروتوكول صمم لمتابعة حركية من إيماس من حبيبات إفرازية في خلايا عنيبية وديناميات غشاء البلازما قمية حيث تلتحم الحبيبات الإفرازية على تحفيز مستقبلات بيتا الأدرينالية. على وجه التحديد، ونحن استخدام الماوس المعدلة وراثيا التي تشارك في تعرب عن GFP عصاري خلوي والببتيد التي تستهدف غشاء تنصهر مع بروتين فلوري جنبا إلى جنب، الطماطم. ومع ذلك، فإن الإجراءات التي استخدمناها لتحقيق الاستقرار وصورة الغدد اللعابية يمكن أن تمتد إلى نماذج الماوس الأخرى وإلى جانب لمناهج أخرى لتسمية في الجسم الحي المكونات الخلوية، مما يمكن تصور مختلف الهياكل التحت خلوية، مثل الإندوسومات، الجسيمات الحالة، الميتوكوندريا، و الهيكل الخلوي الأكتين.

في العقدين الماضيين أدت ظهور المجهر الحية واستخدام البروتينات الفلورية لاختراقات كبرى على كل عملية الخلوية التي يمكن تخيلها، وبالتالي تعزيز فهمنا للبيولوجيا الخلية ^1. وقد استفاد هذا المجال بشكل كبير من استخدام الثقافات خلايا الثدييات التي هي نموذج نظم قوية للغاية، لا سيما عندما يتعلق الأمر التلاعب التجريبية. ومع ذلك، فإنها غالبا ما لا توفر التمثيل الحقيقي للبيولوجيا الكائنات الحية متعددة الخلايا المعقدة ^2. وقد بدأت هذه القضية التي يتعين معالجتها من خلال تطوير intravital المجهري (IVM) التي فتحت الباب أمام التحقيق الأسئلة البيولوجية الرئيسية في مجالات مثل علم الأعصاب، علم المناعة والأورام والبيولوجيا ^3. حتى الآن، فإن معظم الدراسات على أساس الإدارة المتكاملة للنواقل أجريت على مستوى الأنسجة والخلايا الفردية، دون تقديم أي معلومات عن ديناميات مقصورات التحت خلوية. في الآونة الأخيرة، لدينا مختبر وغيرهاو قد وضعت تقنيات الإدارة المتكاملة للنواقل قادرة على التصوير الهياكل التحت خلوية في القوارض الحية ^{4-7، 13-15} والسماح التلاعب الدوائية والوراثية في الجسم الحي. وقد استخدم هذا النهج من قبلنا لدراسة الاتجار غشاء في الجسم الحي، وبشكل أكثر تحديدا الإلتقام وينظم إيماس ^6،7.

ويستند نظامنا النموذج التجريبي على فضح، وتحقيق الاستقرار وتصوير الغدد اللعابية تحت الفك السفلي (اس جي اس) من القوارض تخدير. هو اختيار SGS كجهاز نموذجا للIVM يرجع ذلك إلى حقيقة أن الغدد يمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق إجراء عملية جراحية بسيطة، يمكن تخريجها دون المساس بهم علم وظائف الأعضاء، واستقرت للحد من الحركة الفنية بسبب ضربات القلب والتنفس. بالإضافة إلى ذلك، SGS يمكن التلاعب بها وراثيا عن طريق حقن انتقائي ناقلات إما فيروسية أو غير الفيروسية مقرها من خلال القناة اللعابية ^8،9. أخيرا، اس جي اس هي الغدد خارجية الإفراز تتألف من epith الاستقطابخلايا الليل، والتي تشكل عنيبات ​​والقنوات، وخلايا عضلية ظهارية، ويبلغ عدد سكانها معقدة من الخلايا اللحمية. لهذا السبب، فهي نموذجا ممتازا لدراسة إيماس، الإلتقام، والتسليم الجينات، والهيكل الخلوي الأكتين، على النحو المبين في دراساتنا الأخيرة ^10، وتتيح الفرصة لدراسة جوانب بيولوجيا الخلايا مثل الخلايا القطبية، انقسام الخلايا، خلية تقاطعات الخلية، والقنوات الأيونية.

في هذه الورقة نحن تصف بالتفصيل بروتوكول التصوير لتحقيق قرار التحت خلوية في ظهارة من SGS على فأرة الحاسوب حية. على وجه التحديد، وتبين لنا كيفية صورة حبيبات إفرازية في خلايا عنيبية من SGS خلال إيماس المنظمة. كما هو موضح سابقا، على التحفيز مع منبهات مستقبلات بيتا الأدرينالية، وحبيبات إفرازية تلتحم مع غشاء البلازما قمية وتنهار تدريجيا، والإفراج عن محتوياتها في نفيق عنيبية ^6. هدفنا هو توفير الأدوات الأساسية للمحققين مع متجربة inimal في العمليات الجراحية والتعامل مع الحيوانات، حتى يتمكنوا من أداء بنجاح IVM في قرار التحت خلوية. منذ الجزء الأكثر تحديا في IVM هو التحضير للحيوان، وهنا نركز على وصف الإجراءات الجراحية الأساسية التي تستخدم لكشف ولشل حركة SGS دون المساس ظيفتها. أما بالنسبة للإجراءات لتسمية البنى التحت خلوية، عدة استراتيجيات، مثل تسليم النظامية من تحقيقات الفلورسنت، واستخدام الحيوانات المعدلة وراثيا، أو مزيج من الاثنين معا، وقد وصفت في مكان آخر ^7،11.

جزء 1: المجاهر وإعداد الإعداد التصوير

1. وينبغي أن يكون أي متحد البؤر المجهر المقلوب مناسبة لIVM. في هذه الدراسة تم استخدام المجهر أوليمبوس IX81 مقلوب، ومجهزة مع وحدة المسح الضوئي ليزر متحد البؤر Fluoview-1000. لتحقيق أفضل قرار ممكن، فمن المستحسن استخدام الأهداف NA عالية، مثل الماء الغمر UPLSAPO 60x/1.20 NA، والغمر النفط خطة آبو 60x/1.42-NA. الأهداف غمر النفط لديها الكفاءة جمع أعلى وعلى الرغم من أنها تتطلب استخدام ساترة بين الأنسجة والهدف، لأنها توفر جودة التصوير بشكل أفضل عندما تستخدم لمناطق الصورة داخل 15-20 ميكرون من السطح. بالإضافة إلى ذلك، استخدام زيت يزيل القلق للتبخر المياه خلال جلسات التصوير لفترة أطول. من أجل الحفاظ على درجة الحرارة والرطوبة، وينبغي المجهر مغلق تماما والمتوفرة مع الهواء الدافئ ومرطب. بدلا من ذلك، والحيوان، ومرحلة المجهر، ويجب أن تكون درجة حرارة الهدف بوسائل أخرى. على سبيل المثال، ومنصات الحرارة الكيميائية يمكن أن تستخدم للحيوان والمسرح، وسخانات الهدف المصممة خصيصا يمكن استخدامها لتحقيق الهدف (الشكل 1A). يجب تشغيل سخان هدف في 30 دقيقة قبل البدء في هذا الإجراء. ملاحظة: عندما منصات الحرارة هي استخدام للحفاظ على الحيوانات تدفئة الشاش لديها لوضع في بين لوحة والجلد. الجلد لابد من رصدها للحروق.
2. المراحل القياسية في معظم المجاهر مبائر المتاحة تجاريا لها الافتتاح ان يستخدم لادخال مختلف أصحاب التي يتم استخدامها لتناسب الشرائح، أطباق بتري، وألواح من مختلف الأحجام. من أجل أداء الإدارة المتكاملة للنواقل، مرحلة إدراج معيار لمدة 35 ملم أطباق بتري هو مقلوب رأسا على عقب، مع تغطية 40 مم شريحة زجاجية، والتي يتم تأمينها بواسطة ثم فراغ عالية سيليكون الشحوم أو اخفاء الشريط (الشكل 1A). ويمكن أيضا إدراج مخصص يتم تصنيعها من 3 ملم لوحة الألومنيوم سميكة. سطح الزجاج ثم سلeaned مع الايثانول 70٪ وتمريرها مع Kimwipe.
3. تصنيع حامل مخصصة للتجميد SGS (توازن). الغرض من حامل لتحقيق الاستقرار في SGS في مكان وزوجين بشكل صارم لهم المسرح وساترة. حامل يمكن أن تكون مصنوعة من طبق بيتري 60 ملم من البلاستيك. الأول، هو كسر قاع الطبق بعيدا عن الجدران ومقطعة إلى مستطيلات من حوالي 15 × 10 مم. ثم، يتم تقريب حواف مصقولة وباستخدام الصنفرة غرامة. يتم بناؤها أربعة الفواصل (1.5-2 مم) عن طريق إزالة نصائح المطاط من 1 مل الغطاسون حقنة. باستخدام الصنفرة غرامة، والسطح من الفواصل والزوايا الأربعة للقطعة من البلاستيك ومصقول. ثم يتم لصقها على الفواصل التي كتبها superglue به هلامي، وممهدة لاحقا باستخدام الصنفرة غرامة على سطح مستو. لاحظ أن للحيوانات الأكبر سنا، وحجم أصحاب والفواصل قد يكون من الضروري زيادة لاستيعاب الغدد أكبر قليلا.
4. إعداد هلام اقتران البصرية. 0.3٪ كربومير-940 (يتم إعداد الجدول 2) هلام عن طريق الاحماء 100 مل من الماء نقي للغاية وتذويب 5.47 غرام من D-السوربيتول. ثم، تضاف 0.3 غرام من كربومير-940. يجب تغطية الكأس وتوضع على طبق ساخن التحريك (الإعداد أدنى الحرارة) لعدة ساعات أو حتى تذوب جميع كتل كربومير تماما. أخيرا، يضاف Trietanolamine الإفلات من الحكمة مع التحريك بلطف، حتى يتم التوصل إلى الرقم الهيدروجيني من حوالي 7.4. يتم تخزين جل في 4 درجات مئوية ^13.

جزء 2: الحيوانات والتخدير

1. قبل إجراء أي تجارب مع الحيوانات، ينبغي الموافقة على البروتوكولات من قبل لجنة رعاية الحيوان والأخلاق المحلية الخاصة بك. الأهم من ذلك، ينبغي تدريب الباحثين بشكل صحيح لإجراء عمليات جراحية وينبغي أن تتشاور مع لجنة رعاية الحيوانات المحلية أو مؤسسة الطبيب البيطري قبل الشروع في هذا الإجراء.
2. في هذه الدراسة، نموذج الفأر (GFP / mTomato الفأر) المستمدة عن طريق عبور الفئران FVB معربا عن GFP القابلة للذوبان (GFP الفأر) وايتم استخدام الفئران C57B6 ال تعبر عن الببتيد التي تستهدف غشاء تنصهر مع بروتين فلوري جنبا إلى جنب، الطماطم (mTomato الفأر) ^6. ملاحظة: عادة ما يستغرق 20-30 دقيقة للحيوان لتصبح تخدير كامل وهيأهم للتصوير
3. ويعيش الفئران في بيئة الخاضعة للرقابة في المرفق الحيوانية ويسمح للتأقلم لمدة أسبوع واحد قبل التجربة. هذه الخطوة كانت ضرورية لتصوير SGS لأن أي نتائج ضيق في تعزيز النشاط إفرازية ^12. يتم توفير الماء والغذاء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. وتستخدم الذكور من 2 -5 أشهر من العمر للتجارب التصوير (20-30 غ).
4. قبل التخدير، وتزن الحيوانات لتحديد الجرعة المناسبة من التخدير.
5. منذ الاجهاد الناجم عن إدارة التخدير عن طريق الحقن قد يضعف النشاط إفرازية من اس جي اس، وحمل ما قبل التخدير عن طريق الاستنشاق isoflurane و، تليها حقن التخدير. لهذا الهدف، ووضع الفئران بلطف جدا في غرفة المرذاذ، وبدوره على تدفق الأكسجين (800-900 مم زئبق). تعيين مستويات isoflurane وإلى 3٪ لبدء تحريض ما قبل التخدير.
6. بمجرد أن الحيوانات هي اللاوعي، وضخ مزيج من 100 ملغ / كغ والكيتامين 20 ملغ / كغ زيلازين في التجويف البريتوني (25 G إبرة). يتم عن طريق تمييع 100 ملغ / مل زيلازين إلى 20 ملغ / مل في المياه المالحة ومن ثم خلطها مع الكيتامين التخدير أعدت طازجة. وكذلك المخفف هذا الخليط 01:01 مع المياه المالحة ويتم حقن كمية مناسبة على أساس وزن الحيوان. هذا التخفيف يساعد في الوقاية من جرعة زائدة عرضية. نلاحظ أن الخليط يفقد فعاليته بعد 20 دقيقة.
7. مراقبة الحيوانات بحثا عن علامات على اليقظة وحقن مزيد من خليط مخدر إذا كانوا يخرجون من التخدير (حوالي 75٪ من الجرعة الأولي في غضون 45 دقيقة بعد الحقن الأولى، و 50٪ في كل ساعة بعد ذلك). تحقق من عمق التخدير كل 15 دقيقة بواسطة معسر مخلب ومراقبة الاستجابة. ملاحظة: إدارة دائما مرهم للعين لمنعجفاف العين.
8. التخدير لحث على انخفاض حرارة الجسم، والتي يمكن أن تؤثر على استنساخ التجارب وصحة الحيوان. لذلك، يجب أن تبقى الفئران تحت مصباح الحرارة أو على وسادة ساخنة لكامل مدة التجربة. ملاحظة: مصباح الحرارة ينبغي أن يكون ما لا يقل عن 12-18 بوصة من الحيوان لمنع حرق
9. درجة حرارة الجسم للحيوانات لابد من رصدها باستخدام ميزان حرارة مجهزة مسبار درجة حرارة الجسم.

جزء 3: جراحة الحيوان وتحديد المواقع لحيوي داخلي المجهر

1. إعداد مساحة العمل مع جميع الأدوات الجراحية (الجدول 1) التي يجب أن تكون نظيفة ومعقمة.
2. حلق منطقة الرقبة من الفأرة مع المقص الكهربائي. مسح أسفل الجانب البطني من منطقة الرقبة من الفأرة تخدير مع اسفنجة الشاش غارقة في الايثانول 70٪. تجفيف الزائدة مع Kimwipe.
3. مع ملاقط منحنية مملة رفع قطعة صغيرة من الجلد في خط الوسط (يقارباملطاف في نهاية السفلي من العضلات الماضغة)، وجعل شق صغير (الشكل 1B).
4. إدراج مقص في افتتاح وفصل الجلد عن الأنسجة الكامنة من خلال فتح شفرات مقص. تجنب إتلاف الأنسجة الغدية الأساسية بالإشارة المقص يصل نحو الجانب السفلي من الجلد. كرر هذه الخطوة عدة مرات حتى يتم فصل الجلد عن الأنسجة العميقة (الشكل 1B).
5. باستخدام مقص، وقطع شريط من الجلد خففت حوالي 3 ملم واسعة وطويلة 10 مم. يجب أن تقطع الجلد بحيث يبدأ الافتتاح بالقرب من قاعدة SGS حيث العصب، القناة والأوعية الدموية الاتصال الغدة إلى بقية الجسم. بعد تنظيف منطقة الجرح، وافتتاح الناتجة تكون بيضاوية الشكل وقياس ما يقرب من 8 × 12 ملم. وسوف تكون مرئية على حد سواء SGS بعد افتتاح (الشكل 1B).
6. مع حقنة تطبيق هلام اقتران البصرية في منتصف خفض والقضاء عليها نحوالخارج بشاش معقم. قطعة نظيفة من الشاش وينبغي أن تستخدم لمسح كل لمنع إدخال الشعر أو الدم إلى الأنسجة المكشوفة. كرر هذه الخطوة حتى يتم إزالة كل الشعر الدم وفضفاضة.
7. باستخدام # 7 ملاقط، فصل الأنسجة الضامة بعيدا عن الغدة تحت الفك السفلي الأيمن على طول الطريق الى قاعدة للغدة (بدلا من هذا البروتوكول يمكن استخدامها على ترك SGS). أولا، والعثور على غيض من سان جرمان والاستيلاء على النسيج الضام بضعة ملليمترات أعلاه غيض من الغدة. تمزيق النسيج الضام حول الغدة دون إصابة لحمة. (الشكل 1B). مرة واحدة تتعرض الغدة، فصل بلطف النسيج الضام من الغدة. في حالة حدوث نزيف، وغسل الدم بعيدا مع المياه المالحة. تأكد من أن جميع الأنسجة الضامة يتم فصل وتتعرض الغدة بالكامل. الحفاظ على الغدة رطبة من خلال تطبيق هلام اقتران البصرية بانتظام.
8. قبل جلب الحيوان إلى المجهر، ضع قطعة سميكة من الشاش وهيئة التعليم العالير حزمة على خشبة المسرح المجهر للحفاظ على درجة حرارة 38 ± 2 درجة مئوية. درجة حرارة حزمة الحرارة الكيميائية يمكن تعديلها حسب حجم التخفيضات التي تعرض الحقيبة الداخلية إلى الغلاف الجوي. يوفر بعض الشاش العزل من حزمة الحرارة من المرحلة المعادن. تغطية الجزء العلوي من حزمة الحرارة مع قطعة رقيقة من الشاش كذلك.
9. وضع الحيوان على جانبها (الجانب الأيمن للغدة اليمين) وعلى الشاش. وضع الحيوان مع الغدة اللعابية تحت الفك السفلي وضعت في منتصف ساترة (الشكل 1C).
10. وينبغي تأمين هذا الحيوان واستقرت في هذا الموقف قبل شل حركة الغدة. ضع قطعة من الشريط اللاصق على الجانب البطني من مخلب الأمامي الأيمن من الفأرة. ربط القواطع من الماوس عن طريق خياطة الحرير (الشكل 1C، أقحم). خلق بعض التوتر بين خيط الحرير ومخلب وإرفاقها على خشبة المسرح بواسطة الشريط اللاصق. سان جرمان ينبغي يستريح بشكل طبيعي في منتصفساترة. الرأس والصدر يجب ان يستقر بالإضافة إلى ذلك بواسطة أسافين البلاستيكية التي يمكن أن يقترن إلى المرحلة.
11. وضع قطعة صغيرة من عدسة تنظيف الأنسجة على الغدة (الشكل 1C). تمديد الغدة قليلا ووضع حامل تخصيص أكثر من غدة. زوجين بإحكام إلى مرحلة استقرار مع اخفاء الشريط. ويمكن تحسين اقتران من قبل الشبك المعدني متصلا المرحلة (الشكل 1C). وينبغي تجنب التوتر وحادة الزوايا لأنها قد تؤثر سلبا على تدفق الدم. مباشرة بعد استقرار تفقد تدفق الدم إما عن طريق فحص الغدة بصريا (يجب أن تحتفظ تلوين وردي) أو عن طريق epifluorescence. في الماوس GFP / م الطماطم، والتعديلات الجسيمة لتدفق الدم يمكن تقييمها بسهولة منذ وصفت كل من الأوعية الدموية والعديد من خلايا الدم مع الطماطم م.
12. تغطية الحيوان مع الشاش وسادة ساخنة. قياس درجة حرارة الغدة يتعرض باستخدام ميزان حرارة مجهزة ثإيث مرنة التحقيق الحرارية صغيرة وضعت في اتصال مع جانب واحد من الغدة عرضة للخطر.

جزء 4: معلمات التصوير

1. استخدام epifluorescence التركيز الإضاءة على سطح الغدة إما باستخدام GFP أو مجموعة مرشح طلب تقديم العروض. العثور على سطح سان جرمان، وتقييم تدفق الدم في الشعيرات الدموية والتشكل العام للأنسجة. وتشمل علامات تلف الأنسجة blebbing غشاء أو ظهور فجوات كبيرة.
2. تقييم استقرار الأنسجة إما عن طريق epifluorescence أو لما قبل مسح المنطقة المحددة. A إعداد مستقرة أمر ضروري، لأن معظم الحركة الفنية لا يمكن إزالتها أو تصحيحها لتحليل البيانات في مرحلة ما بعد المعالجة. إذا كان إعداد ليست مستقرة، ويطلب التعديلات.
3. للعثور على صورة البؤري السليم الغدد في وضع ما قبل المسح (1X التكبير)، والانتقال تدريجيا نحو الهدف ساترة حتى الهياكل عنيبية، وحبيبات إفرازية وعيصبح غشاء lasma واضحة للعيان (الشكل 2).
4. تعتمد المعلمات التصوير لمرور الوقت على التجربة الفردية. لصورة ديناميكية حبيبات إفرازية استخدام سرعة المسح الضوئي من 0.5-2 ثانية / الإطار، و256 × 256 بكسل مع 0.2 ميكرون / بكسل النطاق المكاني (مجال الرؤية من حوالي 50 ميكرومتر × 50 ميكرون). من أجل تصور أمثل حبيبات وغشاء البلازما، يجب تعيين سمك البصرية بين 0.9-1.2 ميكرومتر. لإثارة GFP وجنبا إلى جنب، الطماطم، يمكن للمرء استخدام طول موجة من 488 نانومتر و 561 نانومتر، على التوالي. يتم تعيين ذروة السلطة حوالي 0.5 ميغاواط لنانومتر 488 و 1 ميغاواط لنانومتر 561. وهذا يضمن الحد الأدنى من photobleaching من.
5. إعدادات كاشف لا بد من تعديلها للحفاظ على إشارة داخل النطاق الديناميكي وتعتمد على سطوع العينة.
6. مرة واحدة يتم تعيين كافة المعلمات، يمكن بدء التصوير. الأولى، تأخذ لقطة من مجال الرؤية لاستخدامها كنقطة مرجعية. في حينالتصوير في الفاصل الزمني، قد تحدث الانجراف من الأنسجة في XY و Z. هذا يمكن تعويضها يدويا عن طريق ضبط منطقة المسح الضوئي وموقف Z. وينبغي إجراء التعديلات تدريجيا وبزيادات صغيرة لتجنب القطع الأثرية. علاوة على ذلك، يمكن استخدام الصورة إشارة إلى تحديد ما إذا كان يحدث photobleaching من. إذا تم الكشف عن photobleaching من كبير (تخفيض أكثر من 15-20٪ في مضان)، والحد من قوة الليزر بنسبة 0.1 ميغاواط.
7. لتحفيز إيماس، حقن تحت الجلد 0.1 ملغ / كغ من محلول الطازجة من ايزوبروتيرينول في المياه المالحة. يتم تشغيل إيماس حوالي 1 دقيقة بعد الحقن. وسوف يتم الكشف عن حبيبات إفرازية الصمامات مع غشاء البلازما بزيادة قدرها GFP مضان حول حبيبات ونشر الببتيدات جنبا إلى جنب-الطماطم في الأغشية الحد منها (الشكل 3). نوصي الحصول على 3-4 متواليات الوقت الفاصل في نفس المنطقة، 10 دقيقة لكل منهما.
8. بعد الدورة والتصوير، والموت ببطء انوsthetized الحيوانية CO ₂ الاستنشاق في غرفة القتل الرحيم (10-12 ملم زئبقي لمدة 10 دقيقة).

في GFP / mTomato الماوس، تظهر عنيبات ​​الهياكل تمييزا واضحا، الذي أعرب عن GFP عصاري خلوي والتي تستهدف غشاء جنبا إلى جنب، الطماطم الببتيد (الشكل 2، خط كسر). في عنيبات ​​الفردية، ويتم رسم خلايا عنيبية من الببتيد جنبا إلى جنب، الطماطم. تم الكشف عن GFP أيضا في نوى التي هي واضحة للعيان داخل خلايا عنيبية (الشكل 2، والسهام). يتم استبعاد GFP عصاري خلوي من حبيبات إفرازية التي تظهر حويصلات دائرية مظلمة اعتبارا من حوالي 1-1.5 ميكرون في القطر (الشكل 2، أقحم، النصال). لتصور الأحداث exocytic، ونحن نركز على مجال واحد من غشاء البلازما التي يتم تخصيبها في حبيبات إفرازية (الشكل 3، النجمة). بعد الحقن تحت الجلد من 0.1 ملغ / كغ ايزوبروتيرينول، نلاحظ زيادة في مستويات GFP مضان حول بعض من حبيبات إفرازية التي هي على مقربة من غشاء البلازما (الشكل 3، الأسهم الخضراء). كما عأظهرت reviously، وتنصهر هذه الحبيبات مع غشاء البلازما وتجنيد شبكه الأكتين السميك الذي يحتفظ GFP حشوية ^6. بالإضافة إلى ذلك، بعد الاندماج مع غشاء البلازما، وجنبا إلى جنب الببتيد-الطماطم ينشر في الأغشية الحد من حبيبات إفرازية (الشكل 3، السهام الحمراء). بعد 30-40 ثانية حبيبات إفرازية تنهار تدريجيا ويتم دمج الأغشية الحد بهم في غشاء البلازما قمية.

الشكل 1. تعيين ما يصل المجهر، والعمليات الجراحية، وتحديد المواقع الحيوان. A. وتغطي إدراج مرحلة مصممة لعقد 35 ملم أطباق بتري مع 40 ملم ساترة. يتم وضع إدراج في المرحلة المجهر وهذا هو استعد مسبقا مع منصات ساخنة (الاهليليجات البرتقال) ومصباح ساخنة. والهدف من ذلك هو ما قبل يسخن مع سخان الهدف (مجموعة درجة الحرارة: 38 ° C). B. الإجراءات الجراحية لفضح الغدد اللعابية. باستخدام مقص نظيف، يتم إجراء شق في الجلد فوق منطقة الرقبة. يتم إدراج مقص في افتتاح لفصل الجلد عن الأنسجة الأساسية. ثم تتم إزالة الجلد، ومقشر النسيج الضام بلطف من واحدة من الغدد باستخدام الملقط. C. يتم وضع الحيوان على جانبها في مرحلة ما قبل ساخنة ويتم سحبها الغدة بلطف وتوضع في منتصف ساترة . ومدمن مخدرات القواطع إلى مرحلة بخيوط الحرير (الشكل). وتقع قطعة صغيرة من الأنسجة تنظيف العدسة بين الغدة وحامل الجهاز. ثم استقر حامل الجهاز مع المشبك التي تم تأمينها على المسرح مع اخفاء الشريط (الأخضر).

oad/50558/50558fig2.jpg "/>
الشكل 2. صورة ممثل منطقة التصوير في الغدد اللعابية ليعيش GFP / mTomato الماوس. عنيبات ​​ويسلط الضوء بشكل جيد في القناة GFP (الخضراء كسر خط). ويتم رسم الخلايا واحد من الببتيد TD-الطماطم التي يكون موضعيا في غشاء البلازما (خط كسر الحمراء). يتم ترجمة GFP في السيتوبلازم والنواة (الأسهم)، لكنها استبعدت من حبيبات إفرازية (أقحم، النصال). بار، و 10 ميكرومتر.

الشكل 3. الممثل التسلسل الزمني تبين إيماس من حبيبات إفرازية على حقن 0.1 ملغم / كغم من ايزوبروتيرينول. تم تصوير حبيبات إفرازية على مقربة من غشاء البلازما (النجمة). بعد الاندماج مع غشاء البلازما، ومستويات GFP حول حبيبات إفرازيةق زيادة كبيرة (الأسهم الخضراء)، والببتيد TD-الطماطم ينشر في الأغشية الحد منها (السهام الحمراء). حبيبات إفرازية تنهار ببطء وتتكامل الأغشية في غشاء البلازما قمية. بار، 5 ميكرون.

الجدول 1. مواد

الجدول 2. أدوات

حتى الآن تم تصوير معظمها في البنى التحت خلوية في المختبر (أي مزارع الخلايا) أو في فيفو السابقين (أي الجهاز الثقافات، وشرائح الأنسجة، والاستعدادات عنيبية) نظم النموذج الذي غالبا ما لا ألخص خصائص الأنسجة الحية سليمة ^6. في هذا الصدد، والنهج المقدمة هنا يمثل انفراجة كبيرة لأنه تمكن التصوير ديناميات خطوة محددة الاتجار غشاء (إيماس أي تنظيم) في الفئران الحية.

يمثل هذا البروتوكول تقدما كبيرا مع النواحي لغيرها من الإجراءات المصممة للتصوير في الجسم الحي من اس جي اس أو الأجهزة الأخرى في تجويف الجسم ^{10،11،13-15.} وقد أجريت بعض الدراسات السابقة لدينا في الفئران التي هي أكثر مرونة لعمليات جراحية، لديها أجهزة أكبر، وانخفاض معدل ضربات القلب بالمقارنة مع الفئران. وعلى الرغم من الإجراءات في الفئران هي أصعب لاقامة، لأنها توفر العديد من أدفاntages بما في ذلك إمكانية استخدام مجموعة أوسع من نماذج المرض، والحيوانات المعدلة وراثيا خروج المغلوب. بالإضافة إلى ذلك، هذا النهج بنجاح التقليل من الحركة الفنية، وتوفير سيطرة أفضل على الضغوط التي مورست على الهيئات بالتالي يتعرض تقليل مخاطر: ط) الحد من تدفق الدم، والثاني) الإضرار العمارة الأنسجة، والثالث) عرقلة وظيفة طبيعية من الجهاز. هذا هو مصدر قلق كبير بأننا حلها عن طريق القضاء على المعوقات التي تم إنشاؤها بواسطة حامل الجهاز وإدخال عامل استقرار ^10،11.

واحدة من الخطوات الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الحفاظ على درجة حرارة مناسبة في كل من الحيوان والجهاز عرضة للخطر. في الواقع، التخدير يؤدي انخفاض حرارة الجسم الشديد والحفاظ على درجة حرارة الجسم المناسبة يقلل بشكل ملحوظ من احتمالات الوفاة قبل استكمال التجربة. علاوة على ذلك، يتعرض الجهاز يتبادل الحرارة بسرعة مع البيئة الخارجية خلال كل من بروك الجراحية edures والتصوير. منذ خفض درجة الحرارة المحلية من بطء شديد أسفل حركية الخطوات exocytic، من الأهمية بمكان لمنع ذلك باستخدام مصباح الحرارة، سخان الهدف، وطريق الحفاظ على الغدة رطبة مع أي هلام اقتران أو المالحة الدافئة. العلبة كاملة من المجهر مع الغرفة البيئية هو أيضا حل جيد للسيطرة على درجة الحرارة. خطوة حاسمة أخرى هو تحقيق التوازن المناسب بين تحقيق الاستقرار والحفاظ على تدفق الدم. في الواقع، في إعداد التي لم تستقر بشكل صحيح، فمن الصعب جدا أن يتبع حركية من حبيبات إفرازية التي الأحجام في نطاق ميكرون. من ناحية أخرى، والحد من النتائج إمدادات الدم في تشكيل فجوات كبيرة أو إعاقة واضحة من إيماس المنظمة. لتحقيق هذا التوازن من المهم أن نراقب باستمرار تدفق الدم والتحقق من وجود علامات تلف الخلايا أثناء تطبيق الضغط لتحقيق الاستقرار في الجهاز.

ق ق = "jove_content"> القيود رئيسيان من هذا البروتوكول هي سرعة اكتساب وعمق التصوير. على الرغم من أن المجاهر مبائر القائم على الجلفانومتر ديك ما يكفي من القرار الزماني لتصور انهيار تدريجي للحبيبات إفرازية، فإنها لا تسمح التالية قبل الانصهار والاندماج الأحداث التي تحدث بناء على أمر من ميلي ثانية. ويمكن تحسين هذا الجانب مع استخدام المجاهر المجاهر القرص الغزل أو المسح الضوئي ليزر مجهزة الماسحات الضوئية الرنانة. من حيث العمق، المجهري متحد البؤر يحد من الاستحواذ على 30-50 ميكرومتر الأولى تحت سطح الغدد اللعابية. وهذا يتيح التصوير 1 طبقة من الهياكل عنيبية، ولا يسمح التصوير القنوات اللعابية. هذا القيد يمكن التغلب عليها باستخدام المجهر ثنائي الفوتون الذي يضمن التصوير تصل إلى عمق 100-150 ميكرون، وإن كان على حساب القرار المكانية.

على الرغم من أن لهذه الدراسة قمنا بتحديد الماوس المعدلة وراثيا التي تمكن imagi في وقت واحدنانوغرام من حبيبات إفرازية وغشاء البلازما قمية، والإجراءات المذكورة هنا يمكن أن تمتد إلى دراسة العديد من العمليات داخل الخلايا الأخرى. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق استخدام جزيئات الموسومة fluorescently أن تسمية الهياكل الخلوية محددة، ويمكن أن تدار إما بشكل منتظم أو مباشرة على اس جي اس. بدلا من ذلك، وقد وضعت نماذج الماوس المعدلة وراثيا الجديدة معربا عن جزيئات الموسومة fluorescently، مثل GLUT4 نقل الجلوكوز، وعلامة LifeAct F-الأكتين، علامة النووي هيستون 2B الماوس، والالتهام الذاتي علامة LC3-GFP. وأخيرا، فإن الاستراتيجية الأساسية وضعنا لشل حركة وصورة عالية الدقة اس جي اس في ويمكن يحتمل تمتد إلى الأجهزة الأخرى (مثل البنكرياس والكبد والكلى، والغدد الثديية) من خلال إدخال بعض التعديلات في حجم أو شكل استقرار.

وأيد هذا البحث من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة.