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生体顕微鏡は、生きた動物の様々な生物学的プロセスを画像化可能にする強力なツールです。この記事では、生きたマウスの唾液腺では、このような分泌顆粒として細胞内構造のダイナミクスを画像化するための具体的な方法を提示する。
ここでは、共焦点生体顕微鏡を使用することに基づいているライブげっ歯類における画像細胞内構造に手順を説明します。彼らはいくつかの利点を提供するため、モデル機関として、我々は、生きたマウスの唾液腺を使用しています。第一に、それらは容易に光学素子へのアクセスを可能にするために露出し、心拍及び呼吸によるモーションアーチファクトの低減を促進するために安定させることができる。これは大幅に画像化し、小さな細胞内構造を追跡を容易にします。第二に、唾液腺の細胞集団の大部分は、器官の表面からアクセス可能である。これは、二光子顕微鏡などのインビボイメージングのために使用されている他の技術よりも高い空間分解能を有する共焦点顕微鏡の使用を可能にする。最後に、唾液腺、容易にこのようにして分子レベルでの生物学的プロセスを調査する堅牢なシステムを提供し、薬理学的および遺伝的に操作することができる。
本研究では、腺房細胞内の分泌顆粒のエキソサイトーシスおよび分泌顆粒は、β-アドレナリン受容体の刺激により融合頂端細胞膜のダイナミクスの動態に従うように設計されたプロトコルに焦点を当てています。具体的には、細胞質ゾル、GFP蛍光タンパク質タンデムトマトと融合した膜を標的とするペプチドを共発現するトランスジェニックマウスを使用していました。しかし、我々は唾液腺を安定させ、画像に使用する手順は、他のマウスモデルに拡張し、そのようなエンドソーム、リソソーム、ミトコンドリアなどの様々な細胞内構造の可視化を可能にする、in vivoでの細胞成分を標識する他のアプローチに結合することができ、アクチン細胞骨格。
過去20年間で、ライブ顕微鏡の出現と蛍光タンパク質の使用は、細胞生物1の我々の理解を進め、ありとあらゆる細胞プロセスに大きなブレークスルーにつながっている。このフィールドには、それは実験操作に来る場合は特に、非常に強力なモデル系である哺乳動物細胞培養の使用から途方も恩恵を受けている。しかし、彼らはしばしば、複雑な多細胞生物2の生物学の真の表現を提供していません。この問題は、このような神経生物学、免疫学、腫瘍生物学の3などの分野で重要な生物学的な質問を調査への扉を開いた生体顕微鏡(IVM)の開発によって対処され始めている。今のところ、IVMに基づいて、研究のほとんどは、細胞内区画の動力学に関する情報を提供せずに、組織および個々の細胞のレベルで行われている。最近では、我々の研究室や他のsは、生きたげっ歯類4-7に13〜15細胞内構造を画像化およびインビボでの薬理学的および遺伝的操作を可能にすることができるIVM技術を開発した。このアプローチは、 インビボで膜輸送を研究し、より具体的には、エンドサイトーシスおよび調節性エキソサイトーシス6,7するために我々が使用されている。
我々の実験モデルシステムは、麻酔をかけたげっ歯類の顎下唾液腺(SGSに)安定化とイメージング、露光に基づいています。 IVMのモデル器官としてのSGの選択は、腺小手術を行うことで、容易にアクセス可能であるという事実に起因して、その生理機能を損なうことなく外部化、ハートビートと呼吸によるモーションアーチファクトを低減するために安定させることができる。また、SGsアソシエイトを選択的に唾液管8,9を介して、ウイルスまたは非ウイルスベースのベクターのいずれかを注入することにより、遺伝的に操作することができる。最後に、SGSは偏epithで構成される外分泌腺である腺房や導管、筋上皮細胞、間質細胞の複雑な集団を形成elial細胞。このため、彼らは我々の最近の研究10で強調されているように、エキソサイトーシス、エンドサイトーシス、遺伝子送達、およびアクチン細胞骨格を研究し、そのような細胞極性、細胞分裂、細胞などの細胞生物学の側面を研究する機会を提供するための優れたモデルである細胞間結合、およびイオンチャネル。
本論文では詳細に生きたマウスののSGの上皮で細胞内分解能を達成するための撮影プロトコルを記述します。具体的には、どのように画像を調整されたエキソサイトーシスの間のSGの腺房細胞内の分泌顆粒をするには、show。以前に示されているように、β-アドレナリン受容体のアゴニストで刺激すると、分泌顆粒は、頂端形質膜と融合し、徐々に崩壊し、腺房細管6にその内容を解放する。私たちの目標は、Mと研究者に基本的なツールを提供することです外科的処置の動物取り扱いのinimal経験、それらが正常に細胞内解像度でIVMを実行できるようにします。 IVMの中で最も困難な部分が動物の製造であるので、ここでは、その機能を損なうことなく、SGSに公開し、固定化するために利用されている基本的な手術手順の説明に重点を置いています。全身性蛍光プローブの送達は、トランスジェニック動物の使用、または両方の組み合わせとして細胞内構造、いくつかの戦略を標識するための手順としては、他の箇所に記載されている7,11。
パート1:顕微鏡とイメージングのセットアップの準備
パート2:動物と麻酔
パート3:生体顕微鏡用の動物の手術とポジショニング
パート4:撮影パラメータ
GFP / mTomatoマウスでは、腺房細胞質ゾル、GFPと膜を標的とタンデムトマトペプチド( 図2、破線)を発現するよう明確に異なる構造を、表示されます。個々の腺房では、腺房細胞は、タンデムトマトペプチドによって描写されています。 GFPはまた、腺房細胞( 図2、矢印)の内部にはっきりと見える核において検出される。細胞質ゾルGFPは、直径約1〜1.5程度の暗い円形の小胞( 図2、挿入図、矢印)が表示され分泌顆粒から除外されます。エキソサイトーシスイベントを視覚化するために、我々は、分泌顆粒( 図3、アスタリスク)に富む血漿膜の一つの領域に焦点を当てる。 0.1 mg / kgのイソプロテレノールの皮下注射の後、我々は原形質膜( 図3、緑の矢印)に近接している分泌顆粒の一部の周りにGFP蛍光のレベルの増加を観察する。 Pなどreviously示し、これらの顆粒は、細胞膜と融合し、細胞質GFP 6を保持して厚いアクチン網目構造を募集している。また、原形質膜との融合の後に、タンデムトマトペプチドは、分泌顆粒( 図3、赤矢印)の制限膜中に拡散する。 30〜40秒後に分泌顆粒は徐々に崩壊し、その制限膜は、頂端細胞質膜に統合されています。
図1。顕微鏡は、外科的処置、動物の位置を設定します。 A. 35ミリメートルのペトリ皿を保持するように設計ステージインサート40ミリメートルカバースリップで覆われている。インサートは、加熱されたパッド(オレンジ楕円)、加熱ランプで予め温めある顕微鏡ステージに配置される。目的は、事前です 。唾液腺を露出するB.外科的処置:目的のヒーター(38℃設定温度)で加熱。きれいなハサミを用いて、切開を首の領域の上の皮膚に作られる。はさみは、下層組織から皮膚を分離するために開口部に挿入される。次に皮膚を除去し、結合組織を穏やかにピンセットを用いて腺のいずれかから剥離される。C.動物を予め加熱ステージ上に横向きに配置され、グランドを穏やかに引っ張り、カバースリップの中央に配置されている。切歯は絹糸(挿入図)をステージに夢中にされています。レンズ洗浄組織の小片を、腺および臓器ホルダとの間に挟まれている。臓器ホルダーは、その後、マスキングテープ(緑)と、ステージ上に固定されたクランプを用いて安定化されている。
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図2。ライブGFP / mTomatoマウスの唾液腺の撮像領域の代表画像 。腺房はきれいにGFPチャンネル(緑の破線)で強調表示されます。単一細胞は、細胞膜(赤点線)に局在するTD-トマトペプチドによって描写されています。 GFPは、細胞質と核(矢印)に局在するが、分泌顆粒(挿入図、矢印)から除外されます。バーは10μm。
図3。イソプロテレノールの0.1 mg / kgを注入時分泌顆粒のエキソサイトーシスを示す代表的なタイムシーケンス。分泌顆粒は、細胞膜(アスタリスク)に近い画像化した。原形質膜との融合の後、GFPのレベルは、分泌顆粒の周囲Sが有意に(緑の矢印)を増加させ、TD-トマトペプチドは、その制限膜(赤い矢印)に拡散する。分泌顆粒を徐々に崩壊し、それらの頂端膜は原形質膜に組み込まれている。バーは5μm。
表1。材料
表2。楽器
これまでのところ、細胞内構造は、 インビトロ ( すなわち 、細胞培養)またはex vivoで ( すなわち 、臓器培養、組織切片、腺房の準備)は、多くの場合、完全な生体組織6の特性を再現しないモデル系で主に画像化されています。それは生きているマウスでは、特定の膜輸送の段階( すなわち規制エキソサイトーシス)の動態を画像化することができますので、この点では、ここで紹介するアプローチは、大きな進展を表しています。
このプロトコルは、体腔10,11,13-15内のSGや他の臓器のin vivoイメージングのために設計された他の手続への点で重要な進歩を表しています。マウスと比較した場合、我々の以前の研究のいくつかは、外科的処置に対してより弾力性のあるラットに行っ大きな器官を有しており、心拍数を低減した。 、マウスでの手順は設定が困難ですが、いくつかのADVAを提供疾患モデル、トランスジェニックおよびノックアウト動物のより広いスペクトルを使用する可能性を含むntages。さらに、このアプローチが成功従ってリスク低減露出器官に適用される圧力をよりよく制御設けること、運動アーチファクトを最小化:i)の血流を低減し、ii)の組織構造を損傷すること、およびiii)正常な機能を損なう臓器の。これは、我々は、臓器ホルダーによって生成された制約を排除し、安定剤10,11を導入することで解決の主要な関心事である。
このプロトコルにおいて最も重要なステップの一つは、動物において、露出した器官の両方で適切な温度を維持することである。実際に、麻酔は、重度の低体温を誘導し、適切な体温を維持することは著しく実験終了前に死亡する可能性を低減する。また、公開される臓器は、急速に外科プロシージャの両方の間に外部環境と熱交換eduresとイメージング。温度の局所的減少が深刻なエキソサイトーシスのステップの反応速度を遅くするので、加熱ランプ、対物レンズヒータと、カップリングゲルまたは温かい生理食塩水のいずれかで湿った腺を維持してを使用して、それを防ぐために重要である。環境室で顕微鏡を完全に囲いはまた、温度を制御するための良い解決策である。別の重要なステップは、血流の安定化および維持の間の適切なバランスを達成することである。実際に、適切に安定化されていない製剤では、サイズがミクロン範囲内にある分泌顆粒の速度論に従うことは非常に困難である。一方、巨大な空胞が存在し又は調節性エキソサイトーシスの有意な阻害の形成の血液供給の減少をもたらす。このバランスを達成するためには、常に血流を監視し、臓器を安定化させるために圧力をかけながら、細胞損傷の徴候を確認することが重要である。
このプロトコルには2つの主な制限は、取得の速度とイメージングの深さである。検流計ベースの共焦点顕微鏡は分泌顆粒が徐々に崩壊を可視化するのに十分な時間分解能を持っているが、これらはミリ秒のオーダーで発生融合前と融合イベントを次のことはできません。この態様は、共振スキャナを備えたスピニングディスク顕微鏡やレーザ走査型顕微鏡を用いて向上させることができる。深さの面では、共焦点顕微鏡は、唾液腺の表面下の最初の30〜50μmの取得を制限します。これは腺房構造の画像1層が可能になり、唾液管を画像化することはできません。この制限はあるが、空間分解能を犠牲にして、100〜150ミクロンの深さまで撮影を確実にする二光子顕微鏡を使用することによって克服することができる。
この研究のために、我々は同時に想像力を可能にしたトランスジェニックマウスを選択したものの、分泌顆粒と頂端形質膜のngが、ここで説明する手順では、いくつかの他の細胞内過程を研究するために拡張することができる。これは、特定の細胞構造を標識し、SGsアソシエイトに全身あるいは直接投与することができる蛍光タグ化分子を使用することによって達成することができる。あるいは、蛍光タグ化分子を発現する新規トランスジェニックマウスモデルは、グルコース輸送Glut4移行、F-アクチンマーカーLifeAct、核マーカーヒストン2Bマウス、およびオートファジーマーカーLC3-GFPのように、開発されている。最後に、高解像度でのSGを固定して画像ために開発されてきた基本的な戦略は、潜在的に大きさや安定化剤の形でいくつかの変更を導入することによって、他の器官( 例えば、膵臓、肝臓、腎臓、及び乳腺)に拡張することができる。
本研究は、NIHの学内研究プログラム、歯科および頭蓋顔面研究所の国立研究所によってサポートされていました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
Instrument | |||
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
#7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
Black Braided Silk suture #4.0 | George Tiemann Co | 160-1219-4 | |
Gauze sponges 2" x 2" | Tyco Healthcare | 9022 | |
Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
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