Method Article
מיקרוסקופיה Intravital היא כלי רב עוצמה המאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים שונים בבעלי חיים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה מפורטת להדמית הדינמיקה של מבני subcellular, כגון גרגרי ההפרשה, בבלוטות הרוק של עכברים חיים.
כאן אנו מתארים הליך למבני subcellular תמונה במכרסמים חיים המבוססים על השימוש במיקרוסקופ intravital confocal. כאיבר מודל, אנו משתמשים בבלוטות הרוק של עכברים חיים מכיוון שהם מספקים מספר יתרונות. ראשית, הם יכולים להיחשף בקלות כדי לאפשר גישה לאופטיקה, והתייצבו כדי להקל על ההפחתה של ממצא התנועה בשל פעימות לב ונשימה. זה מקל באופן משמעותי הדמיה ומעקב אחר מבני subcellular קטנים. שנית, רוב אוכלוסיות התאים של בלוטות הרוק נגישים מפני שטח של האיברים. זה מאפשר השימוש במיקרוסקופיה confocal שיש לו רזולוציה מרחבית גבוהה יותר מטכניקות אחרות שהיה בשימוש במשך in vivo הדמיה, כגון שני פוטונים במיקרוסקופ. לבסוף, ניתן להשפיע על בלוטות רוק בקלות פרמקולוגית וגנטי, ובכך לספק מערכת חזקה כדי לחקור תהליכים ביולוגיים ברמה מולקולרית.
במחקר זה אנו מתמקדים בפרוטוקול נועד לעקוב קינטיקה של exocytosis של גרגרי הפרשה בתאי acinar ואת הדינמיקה של קרום הפלזמה הפסגה שבו גרגרי הפרשת הפתיל על גירוי של קולטנים בטא adrenergic. באופן ספציפי, השתמשנו בעכבר מהונדס שישתף מבטא GFP cytosolic ופפטיד ממוקד קרום התמזגו עם חלבון טנדם-עגבניות ניאון. עם זאת, הנהלים ששמשנו לייצוב תמונה ובלוטות הרוק יכולים להיות מורחבים לדגמי עכבר אחרים ומצמידים את גישות אחרות לתווית רכיבים סלולריים in vivo, המאפשר ההדמיה של מבני subcellular שונים, כגון endosomes, lysosomes, מיטוכונדריה, ו שלד התא אקטין.
בשני העשורים האחרונים כניסתו של מיקרוסקופיה חי והשימוש בחלבוני ניאון הובילו לפריצות דרך משמעותיות בכל תהליך סלולארי ניתן להעלות על הדעת, ובכך לקדם את ההבנה של ביולוגיה של תא 1 שלנו. תחום זה נהנה מאוד מהשימוש בתרביות תאים של יונקים שהן מערכות מודל חזקות מאוד, במיוחד כאשר מדובר במניפולציות ניסיוני. עם זאת, הם לא לעתים קרובים לספק ייצוג אמיתי של הביולוגיה של אורגניזמים רב תאיים מורכבים 2. בעיה זו החלה להיות מטופל על ידי הפיתוח של מיקרוסקופיה intravital (IVM) שפתחה את הדלת לבירורן של שאלות ביולוגיות מרכזיות בתחומים כמו נוירוביולוגיה, אימונולוגיה וגידול ביולוגיה 3. עד כה, רוב המחקרים המבוססים על IVM בוצעו ברמות של רקמות ותאים בודדים, מבלי לספק כל מידע על הדינמיקה של תאי subcellular. לאחרונה, המעבדה ואחרת שלנוים פיתחו טכניקות IVM מסוגלים מבני subcellular הדמיה במכרסמים חיים 4-7, 13-15 ומאפשרים מניפולציות תרופתי וגנטיות בגוף חי. גישה זו נוצלה בעבר על ידי לנו ללמוד סחר קרום in vivo, ובאופן ספציפי יותר אנדוציטוזה ומוסדרת exocytosis 6,7.
מערכת המודל הניסויית שלנו מבוססת על חשיפה, ייצוב והדמית בלוטות רוק submandibular (SGS) של מכרסמים בהרדמה. הבחירה של SGS כאיבר מודל לIVM היא בשל העובדה שהבלוטות נגישות בקלות על ידי ביצוע ניתוח קטן, יכול להיות מוחצן מבלי להתפשר על הפיסיולוגיה שלהם, והתייצב כדי להפחית את חפצי התנועה בשל פעימות לב ונשימה. בנוסף, SGS ניתן להשפיע באופן סלקטיבי מבחינה גנטית על ידי הזרקת וקטורים מבוססים או ויראלי או לא ויראלי דרך צינור רוק 8,9. לבסוף, SGS הם בלוטות אקסוקרינית מורכבות מepith המקוטבתאי elial, המהווים את acini והצינוריות, תאי myoepithelial, ואוכלוסייה מורכבת של תאי סטרומה. מסיבה זו, הם מודל מצוין ללמוד exocytosis, אנדוציטוזה, מסירת גן, ושלד תא אקטין, מודגש כמו במחקרים האחרונים שלנו 10, ומציע את ההזדמנות ללמוד היבטים של ביולוגיה של תא, כגון קוטביות תא, חלוקת תא, תא צמתים תא, ותעלות יונים.
במאמר זה אנו מתארים בפירוט פרוטוקול הדמיה להשגת הרזולוציה subcellular באפיתל של SGS של עכבר חי. באופן ספציפי, אנו מראים כיצד תמונת גרגרי ההפרשה בתאי acinar של SGS במהלך exocytosis המוסדר. כפי שניתן לראות בעבר, על גירוי עם אגוניסטים של הקולטן בטא adrenergic, גרגרי הפרשה להתמזג עם קרום הפלזמה הפסגה ויתמוטטו בהדרגה, משחררים את התוכן שלהם לcanaliculi acinar 6. המטרה שלנו היא לספק את הכלים הבסיסיים לחוקרים עם מ 'ניסיון inimal בפרוצדורות כירורגיות וטיפול בבעלי חיים, כך שהם יכולים לבצע בהצלחה IVM ברזולוציה subcellular. מאז החלק המאתגר ביותר בIVM הוא ההכנה של בעל החיים, כאן אנו מתמקדים בתיאור של פרוצדורות כירורגיות הבסיסיות שמנוצלות לחשוף ולשתק את SGS מבלי להתפשר על התפקוד שלהם. ובאשר לנהלים לתייג מבני subcellular, מספר אסטרטגיות, כגון משלוח מערכתי של בדיקות ניאון, שימוש בבעלי החיים מהונדסים, או שילוב של שניהם, כבר תאר במקום אחר 7,11.
חלק 1: מיקרוסקופים והכנת תוכנית ההתקנה של ההדמיה
חלק 2: בעלי חיים ובהרדמה
חלק 3: ניתוח בעלי חיים ומיקום למיקרוסקופי Intravital
חלק 4: פרמטרי הדמיה
בעכבר ה-GFP / mTomato, acini מופיע מבנים כנבדלים באופן ברור, שמבטאים GFP cytosolic ופפטיד טנדם-עגבניות ממוקדות קרום (איור 2, קו שבור). בacini הבודד, תאי acinar מסומנים בפפטיד טנדם-עגבניות. GFP הוא גם זוהה בגרעינים שנראים בבירור בתוך תאי acinar (איור 2, חיצים). GFP cytosolic מוחרג מגרגירי הפרשה המופיעים שלפוחית כהה מעגלית של כ 1-1.5 מיקרומטר קוטר (איור 2, הבלעה, ראשי חץ). כדי להמחיש את אירועי exocytic, אנו מתמקדים באזור אחד של קרום הפלזמה כי הוא מועשר בגרגירי הפרשה (איור 3, כוכבית). לאחר ההזרקה תת עורית של 0.1 isoproterenol מ"ג / קילוגרם, אנו צופים עלייה ברמות של הקרינה ה-GFP סביב כמה גרגרי הפרשה שנמצאים בסמיכות לקרום הפלזמה (איור 3, חיצים ירוקים). כמו previously הראה, גרגרים אלה התמזגו עם קרום הפלזמה ולגייס meshwork אקטין עבה ששומר על ה-GFP cytoplasmic 6. בנוסף, לאחר מיזוג עם קרום הפלזמה, פפטיד טנדם-העגבניות מתמוסס לתוך קרום הגבלה של גרגרי הפרשה (איור 3, חיצים אדומים). אחרי 30-40 שניות גרגרי הפרשה יתמוטטו בהדרגה והקרומים הגבלה שלהם משולבים בקרום הפלזמה הפסגה.
איור 1. מיקרוסקופ להגדיר, הליכים כירורגיים, ומיצוב של בעלי חיים. א להכניס שלב נועד להחזיק 35 מ"מ צלחות פטרי מכוסה coverslip 40 מ"מ. הכנס יוצב בבמת מיקרוסקופ שהיא מראש חימם עם רפידות מחוממות (אליפסות כתומות) ומנורה מחוממת. המטרה היא מראש מחומם עם דוד אובייקטיבי (סט טמפרטורה: 38 מעלות צלזיוס). נהלים ב כירורגי כדי לחשוף את בלוטות הרוק. בעזרת מספריים נקיים, מבצע חתך בעור מעל לאזור הצוואר. המספריים מוכנסים בפתח כדי להפריד את העור מהרקמה הבסיסית. העור לאחר מכן הוסר, ורקמת החיבור הוא קילף בעדינות מאחד הבלוטות באמצעות פינצטה. ג החיה ממוקמת בצדו על הבמה המחוממת מראש והבלוטה היא משכה בעדינות והניחה באמצע coverslip . החותכות מחוברות לבמה עם חוט משי (הבלעה). פיסה קטנה של רקמת ניקוי עדשה היא דחוקה בין הבלוטה ובעל האיברים. בעל האיבר לאחר מכן התייצב עם מהדק כי הוא מאובטח על הבמה בנייר דבק (ירוק).
oad/50558/50558fig2.jpg "/>
איור 2. תמונה מייצגת של אזור הדמיה של בלוטות הרוק של עכבר ה-GFP / mTomato חי. Acini הם יפה מודגשים בערוץ ה-GFP (קו שבור ירוק). תאים בודדים מסומנים בפפטיד TD-העגבניות שהוא מקומי בקרום הפלזמה (קו אדום שבורה). GFP הוא מקומי בציטופלסמה והגרעינים (חיצים), אבל לא נכלל בגרגרי ההפרשה (הבלעה, ראשי החץ). בר, 10 מיקרומטר.
איור 3. נציג רצף זמן מראה את exocytosis של גרגרי הפרשה על זריקה של 0.1 מ"ג / קילוגרם של isoproterenol. גרגרי הפרשה היו צילמו קרובים לקרום הפלזמה (הכוכבית). לאחר איחוי עם קרום הפלזמה, הרמות של ה-GFP סביב גרגר הפרשהים להגדיל באופן משמעותי (חיצים ירוקים), ופפטיד TD-העגבניות מתמוסס לתוך הקרומים שלהם הגבלה (חיצים אדומים). גרגרי הפרשה יקרסו לאט ובקרומים שלהם משולבים בקרום הפלזמה הפסגה. בר, 5 מיקרומטר.
טבלת 1. חומרים
טבלה 2. מכשירים
עד כה מבני subcellular כבר צילמו בעיקר במבחנה (תרביות תאים כלומר) או in vivo (כלומר איבר תרבויות, פרוסות רקמה, הכנות acinar) מערכות מודל לשעבר שלעתים קרובות אינו לשחזר את המאפיינים של רקמות גרו בשלמותה 6. מבחינה זו, הגישה המוצגת כאן מייצגת פריצת דרך משמעותית שכן הוא מאפשר הדמיה הדינמיקה של שלב ספציפי קרום סחר (exocytosis המוסדר כלומר) בעכברים חיים.
פרוטוקול זה מייצג התקדמות משמעותית עם בחינות להליכים אחרים המיועדים להדמית vivo של SGS או לאיברים אחרים בחלל הגוף 10,11,13-15. חלק מהמחקרים הקודמים שלנו בוצעו בחולדות, כי הם עמידים יותר לפרוצדורות כירורגיות, יש איברים גדולים יותר, וקצב לב מופחת בהשוואה לעכברים. אמנם, בהליכים שבעכברים הם יותר קשים להגדיר, הם מספקים כמה אדוהntages כולל האפשרות להשתמש בספקטרום רחב יותר של דגמי מחלה, מהונדס ובעלי חיים בנוקאאוט. בנוסף, גישה זו ממוזערת הצלחת ממצא התנועה, ומספק שליטה טובה יותר על הלחץ המופעל על האיברים החשופים וכך להקטין את הסיכונים של: א) הפחתת זרימת הדם, ii) נזק למבנה הרקמה, וג) לפגוע בתפקוד התקין של האיבר. זהו חשש עיקרי שפתרנו על ידי ביטול המגבלה שנוצרה על ידי בעל האיברים ומציג מייצב 10,11.
אחד השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה הוא לשמור על הטמפרטורה הנכונה, הן בבעלי החיים והן באיברים החשופים. ואכן, הרדמה גורמת היפותרמיה קשה ושמירה על טמפרטורת הגוף המתאימה מפחיתה באופן משמעותי את הסיכוי למוות לפני השלמת הניסוי. יתר על כן, האיברים שנחשפו במהירות מחליפים חום עם הסביבה החיצונית במהלך שני proc כירורגית edures וההדמיה. מאז ההפחתה המקומית של טמפרטורה קשה להאט את קינטיקה של צעדי exocytic, זה הוא חיוני כדי למנוע את זה על ידי שימוש במנורת החום, דוד האובייקטיבי, ועל ידי שמירה על הבלוטה לחה או עם ג'ל הצימוד או מי מלח חמים. מארז מלא של מיקרוסקופ עם תא סביבתי הוא גם פתרון טוב לשליטה על הטמפרטורה. עוד צעד קריטי הוא כדי להשיג את האיזון הראוי בין הייצוב ותחזוקה של זרימת הדם. ואכן, בהכנה שלא התייצבה כמו שצריך, זה מאוד קשה לעקוב קינטיקה של גרגרי הפרשה גדלים שנמצאים בטווח מיקרון. מצד השני, הירידה של תוצאות אספקת דם להיווצרות של וקואולות גדולה או עיכוב משמעותי של exocytosis המוסדר. כדי להשיג איזון זה חשוב כל הזמן לפקח על זרימת הדם ולבדוק סימנים של נזק לתאים בעת החלת הלחץ כדי לייצב את האיברים.
ss> שתי המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה הם = "jove_content" המהירות של רכישה ואת העומק של הדמיה. למרות שיש לי המיקרוסקופים confocal מבוסס גלונומטר רזולוציה של זמן מספיק כדי לדמיין את הקריסה ההדרגתית של גרגרי הפרשה, הם לא מאפשרים בעקבות אירועים מראש היתוך ומיזוג המתרחשים בסדר הגודל של אלפיות שנייה. היבט זה יכול להיות שיפור עם השימוש במיקרוסקופי דיסק מסתובב או סריקה מיקרוסקופי לייזר מצוידים בסורקי תהודה. במונחים של עומק, מיקרוסקופיה confocal מגבילה את הרכישה ל30-50 מיקרומטר הראשון מתחת לפני השטח של בלוטות הרוק. זה מאפשר לשכבת ההדמיה 1 מבני acinar, ואינו מאפשר הדמיה צינוריות הרוק. מגבלה זו ניתן להתגבר על ידי שימוש במיקרוסקופ שני פוטונים שמבטיח הדמיה עד לעומק של 100-150 מיקרומטר, אם כי על חשבון הרזולוציה מרחבית.
אמנם למחקר זה יש לנו נבחר עכבר מהונדס המאפשר Imagi בו זמניתננוגרם של גרגרי הפרשה וקרום הפלזמה הפסגה, ניתן להאריך את ההליכים המתוארים כאן כדי ללמוד כמה תהליכים תאיים אחרים. זו יכולה להיות מושגת על ידי שימוש במולקולות מתויגות fluorescently שתווית מבנים תאיים ספציפיים ויכולים להינתן גם באופן מערכתי או ישירות על SGS. לחלופין, מודלים עכבר מהונדסים חדשים להביע מתויגות fluorescently מולקולות פותחו, כגון GLUT4 תחבורת גלוקוז, LifeAct סמן ה-F-אקטין, עכבר 2B היסטון סמן הגרעיני, וסמן autophagy LC3-GFP. לבסוף, האסטרטגיה הבסיסית שפיתחנו כדי לשתק ותמונת SGS ברזולוציה גבוהה יכולה להיות פוטנציאל הרחיבה לאיברים אחרים (לדוגמא לבלב, כבד, כליות, ובלוטות החלב) על ידי הצגה כמה שינויים בגודל או צורה של המייצב.
מחקר זה נתמך על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון הלאומי למחקר דנטלי Craniofacial.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagent | |||
Isoflourane (Forane) | Baxter | 101936-40 | Handle under chemical hood |
Ketamine (ketaved) | Fort Dodge Animal Health | 57457-034-10 | Stock solution 100 mg/ml |
Xylazine (Anased) | Akorn, Decatur | 61311-481-10 | Stock solution 100 mg/ml |
Neomycin/Polymyxin B | Bausch and Lomb | 24208-785-55 | Use to lubricate the eye of the mouse |
Carbomer-940 | Ashalnd, Inc. | 4607-1 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 | |
Triethanolamine | Sigma-Aldrich | 90279 | Add drop wise to prevent the solution to solidify |
Isoproternol | Sigma-Aldrich | 16504 | Prepare fresh solutions in saline when needed. Stocks can be stored at -20 °C |
Instrument | |||
Isoflurane V 1.9 (Vaporizer) | Braintree Scientific | 190AF | |
Portable Downdraft table equipped with HEPA filter | Hazard Technology | PDDT | |
Heat lamp, Model HL1 | Braintree Scientific | HL-1 US | |
MicroTherma 2T Thermometer | Braintree Scientific | TW2 | |
Operating Scissors (11.5 cm straight | World Precision Instruments | 5003708-12 | |
#7 curved tip tweezers | World Precision Instruments | 14187 | |
Microscissors | World Precision Instruments | 503365 | |
Black Braided Silk suture #4.0 | George Tiemann Co | 160-1219-4 | |
Gauze sponges 2" x 2" | Tyco Healthcare | 9022 | |
Lens cleaning tissue | Olympus | CL-TISSUE (M97) AX6476 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved