Kanal Hücreleri Toplama kültür İlköğretim Rat İç Medüller

Arginin-vazopressin (AVP) böbrek temel hücreleri tarafından su geri emilimini kolaylaştırmak yoluyla vücudun su dengesi ince ayar kontrol eder. Burada, AVP-aracılı su geri emilimini moleküler mekanizmaları hakkında aydınlatılması için uygun toplayıcı kanal hücrelerinin primer sıçan iç medüller yetiştiriciliği için bir protokol mevcut.

Arginin-vazopressin (AVP) böbrek kanalı temel hücre toplanması ve böylece ince ayar vücut su dengesi suyun geri emilimini kolaylaştırır. AVP, hücrelerin yüzeyi üzerinde vasopresin V2 alıcıları (V2R) ile bağlanır ve böylece, cAMP sentezini indükler. Bu su kanalı aquaporin 2 (AQP2) fosforlaştıncı değişikliklere yol açan hücresel sinyal sürecini hızlandırır. Protein kinaz A AQP2 phoshorylates ve böylece birincil idrar su geri emilimini kolaylaştırmak plazma zarı içine hücre içi veziküllerden AQP2 en translokasyon tetikler. Asıl hücrelerde hipofiz veya AVP-aktif sinyal gelen AVP serbest sapmaları sırasıyla, merkezi ya da nefrojenik diabetes insipidus neden olabilir; yüksek bir kan plazma AVP düzeyi, kronik kalp yetmezliği ve uygunsuz antidiüretik hormon salgılanması sendromu gibi kardiyovasküler hastalıklar ile ilişkilidir.

Burada, cultivati ​​için bir protokol mevcutifade V2R ve AQP2 endojen kanal (IMCD) hücreleri, toplama birincil sıçan iç medüller on. Hücreler AQP2 bölgesinin kontrolü altında yatan moleküler mekanizmaların için uygun olan ve bu nedenle AVP-aracılı su emiliminin bozulmasına ile bağlantılı hastalıkların tedavisi için yeni bir ilaç bulmak için hedefler. IMCD hücreleri sıçan böbrek iç medullae elde edilir ve altı ila sekiz gün tohumlama sonra deneyler için kullanılır. IMCD hücreleri düzenli hücre kültürü yemekleri, matara ve farklı biçimlerde mikro-titre plakalar kültür olabilir, işlem sadece birkaç saat gerektirir ve standart hücre kültürü laboratuarlar için uygundur.

Böbreğin toplayıcı ana hücrelerde, arjinin-vasopresin (AVP) su ekleme uyararak su emilimini kontrol plazma zarı içine kanal aquaporin 2 (AQP2). AVP adenilat siklaz ve böylece cAMP oluşumunu uyarıcı G-protein çiftli vazopressin tip-2 reseptörü (V2R) bağlanır. Bu sinyal akışının başlatılması protein kinaz A (PKA) aktivasyonuna yol açar. PKA plazma zarı içine hücre içi veziküllerden yeniden dağıtımı için en önemli tetikleyici olan, 256 (S256) serin de AQP2 fosforile. Membran ekleme ozmotik degrade ve ince ayar vücut su dengesinin birlikte su geri emilimini kolaylaştırır.

Nedeniyle AVP salgı veya AVP-aktif sinyal nedenleri veya sapmaları AVP-aracılı su geri emiliminin bozulmasına, ciddi hastalıklar ile ilişkilidir. V2R veya AQP2 mutasyonlar neden azalma su geri emilimini bir elev ise, nefrojenik diabetes insipidus yol açarated kan plazma AVP düzeyi, kronik kalp yetmezliği ve uygunsuz antidiüretik hormon salgılanması (SIADH) en sendromu gibi kardiyovasküler hastalıklar aşırı su geri emilimini ile ilişkilidir.

AVP-aracılı su geri emilimini önemi sadece hastalık kendi ima kaynaklanıyor. AQP2 taşıyan için veziküller ve plazma zarı ile füzyon AVP bağlı translokasyon şu anda iyi anlaşılmış değildir kesinlikle cAMP-bağımlı exocytic süreci temsil eder. Bir cAMP bağımlı ekzositozu için diğer örnekleri, böbrek ve H renin salınımı ⁺ mide salgı vardır. Bu nedenle renal ana hücrelerde AQP2-translokasyon düzenleyen moleküler mekanizmaların açıklanması, sadece diğer hücre tipleri içindeki moleküler süreçleri anlamak yardımcı olur, ancak, aynı zamanda AVP-aracılı su emiliminin bozuklukları ile bağlantılı hastalıkların tedavisi için yeni terapilere yol açabilecektir .

Emekanizmaları kontrol AQP2 lucidating kanalı temel hücre modelleri toplama gerektirir. Bunun için farklı memeli böbrek hücre hatları bir dizi kullanılabilir. Ancak, bu modeller birkaç sakıncaya sahiptir. Birçok hücre sistemlerinde AQP2 protein düzeyi (Tablo 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) düşüktür ^1-10, ektopik diğerleri aşın insan (MCD4, WT10) ^11,12 veya sıçan (CD8) ¹³ AQP2. MCD4 ve COS-7 hücreleri içinde V2 reseptörü ifade değildir. Bildiğimiz kadarıyla orada böbrek iç medüller toplayıcı, AQP2 ifade en bol olan böbrek bir kısmının türetilmiştir kullanılabilir bir model olarak kalıcı bir hücre hattı, ancak kortikal toplayıcı ^1,11,13-16 gelen . Bu tür hücre modelleri örnek, yaygın olarak kullanılan ölümsüzleştirdi mpkCCD (örneğin ¹⁷⁾ veya yeni kurulan mTERT-CCD ¹⁴ hücre hatları içindir. Her iki hücre hatları ve endojen olarak ifade AQP2 V2R ancak türetilen yanakortikal toplama kanalı büyük olasılıkla kanal (IMCD) hücreleri toplamak iç medüller göre farklı bir proteom içerir. Bunlar örneğin farklı Na ifade etmelidir ⁺ taşıma sistemleri.

Burada, V2R ve AQP2 endojen ifade kültürü birincil IMCD hücrelere bir protokol mevcut. Bu model, bu nedenle, böbrek toplama kanalında en yakın fizyolojik durumu temsil eder. Kültür kurulması gereğine göre sadece standart laboratuar ekipmanları vb laboratuarlar kolayca bu yaklaşım kabul edebilir.

1. Hazırlık

1. Kültür kaplarına hazırlanması
   1. Çözülme Kollajen Tip 4 de IV O / N ° C ve% 0.1 steril asetik asit içinde çözülür. Kullanmak için ses hücreleri numaralı seribaşı için olduğu yemekler türüne ve sayısına bağlıdır. 2 mg / cm ² kullanın.
   2. En az 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin ve yemekler için damıtılmış su (A tridest) ile iki kez yıkanır.
   3. Yemekler düzgün kurumasını bekleyin.
2. Ortam takviyesi
   1. 500 ml orta 1.75 g glukoz ekleyerek kadar 4,5 g / L glikoz düzeyini artırmak. Orta 600 mOsmol ayarlamak için, sırasıyla, 200 ve 100 mOsmol mOsmol tarafından ozmolarite geliştirmek için, 100 mM NaCl ve 100 mM üre ekleyin.
   2. 600 mOsmol DMEM ortamı,% 1 esansiyel olmayan amino asitler,% 1 ultroser, 500 uM DBcAMP, 20 U / ml nistatin ve 0.25 ug / ml gentamisin (50 ug / ml 'lik bir konsantrasyon ile stok solüsyonu 1:200 seyreltme) ekleyin taze hazırlama gününde.
3. Enzim çözeltisi
   1. 1 mg / ml hiyaluronidaz ile 2.2 mg / ml kollajenaz ekleyin DPBS içeren 0.25 mg / ml gentamisin ve nistatin. 2 böbrek iç medullae parçalamak için bu enzim çözeltisi, 1 ml hazırlayın. Çözelti süzme ile sterilize edilmesi gerekir ve 50 ml Falcon tüpleri içinde depolanır.

2. İlköğretim Rat İç Medüller yetiştirme Kanal (IMCD) Hücreleri Toplama

Tüm hayvan inceleme işlemleri, yerel ve federal mevzuata uygun olarak yapılacak olan.

1. CO ₂ fareler (CO ₂ ile doymuş bir kutu içinde) veya izofluran (; 2-2.5% izofluran ile hava akışı 350-400 ml / dk U-400 Anestezi ünitesi, Univentor Ltd, Malta) uyuşturan. Beyazımsı iç ve koyu dış medulla arasındaki sınırın tam tespiti izin kanama için hayvan başını kesmek. Buna ek olarak, kanama izole eritrositlerin sayısını en aza indirir. Böbrekler çıkarın vebuz üzerinde gentamisin ve nystatin (yukarıya bakınız) ile desteklenmiş steril DPBS yıkayın. Bütün adımları steril temiz tezgah koşullar altında yapılacak olan.
2. Aşırı sıvı kaldırmak için steril bir kompres üzerine DPBS çözüm böbrek aktarın. Steril forseps ve makas ile yağ böbrek kapsülü çıkarın.
3. Böbrek hala kompres sabit dış (kortikal) tarafının uzunlamasına ekseni yanında biraz kesilmiş olması. Tamamen kesmek için, ancak renal pelvis bağlı, tek parça halinde bırakmak değil emin olun.
4. Kavisli makas ile dikkatli bir şekilde gül parıltılı dış medulla ile çevrilidir beyazımsı iç medullae, incelemek. Buz üzerinde bir 60 mm kültür çanak gentamisin ve nistatin içeren, DPBS onları toplamak.
5. Tüm medullae izole ve buz üzerinde toplanan sonra, sadece tampon ile kaplıdır bir seviyeye DPBS hacmini azaltmak. 5 küpler halinde medullae kesmek için steril bir jilet kullanınmm ^3.
6. Bir ateşe kısa bir süre tutarak eritin ve steril Pasteur pipet keskin ucunu yuvarlak. Pipet devam etmeden önce soğutulur emin olun.
7. Yuvarlak Pasteur pipeti kullanılarak hiyaluronidaz ve kolajenaz (1.3.1) taze olarak hazırlanmış steril bir enzim çözeltisi içeren 50 ml Falcon tüplerine doku süspansiyonu aktarın. Sıkıca kapağını kapatın ve 37 ° C 1.5 için düzenli bir masa su banyosunda sürekli ajitasyon (220 rpm) altında inkübe - 2 saat.
8. Süspansiyon ezilerek için, homojen bir süspansiyon bulanık hale gelene kadar yuvarlak Pasteur pipeti (yukarıya bakın) ile bir kaç kez aşağı karışımı pipet ve.
9. 300 xg'de 5 dakika ve 16 ° C için süspansiyon santrifüj Süpernatantı atın, pelet tekrar gentamisin ve nystatin ve santrifüj içeren, DPBS iyice tekrar süspansiyon. Bir kez bu yıkama adımı yineleyin.
10. Tam takviye orta ve c içine tohum onları hücrelerin tekrar süspansiyonulture yemekler ve / veya mikro-titre iyi plakaları. 2 medullae (1 hayvan) hazırlanması biri 60 mm kültür çanak için yeterli hücreleri verecektir.
11. 24 saat sonra, 600 mOsmol DMEM ile iki kez yıkama ve hücreler taze ortam ilave edin. Bir sonraki haftada 2-3 kez hücreleri (Şekil 1) yıkanmalıdır. 6-8 gün sonra tohumlama, IMCD hücre deneyleri için de kullanılabilir. Deney başlamadan önce 24 saat DBcAMP ve nystatin olmadan ortamda bunları tasarlamak unutmayın. Aksi takdirde AQP2 plazma zarında sadece yer alacaktır.

Primer fare IMCD hücreleri başarılı ekimi 6-8 gün tohumlama sonra konfluent tek tabaka (Şekil 2) ile sonuçlanır. 60 mm kültür çanak başına yaklaşık 6 x 10 ⁶ hücre vardır. Bu tip IV kolajen, bir bazal membran bileşeni ¹⁸ ile kaplanmış olduğu gibi sıkı bir şekilde hücreler, kültür tabaklarına uygun. Bu nedenle, IMCD hücreleri birkaç ayrıntılı yıkama işlemleri sırasında bile terketmez. Yukarı, kültürlenmiş hücreler,% 80, endojen V2R ve AQP2 ifade eder. AQP2 yoksun hücreler interkalate hücreleri Henle, vaza recta veya iç medüller interstitial hücrelerin döngünün ince bacaklarda türetilen, IMCD hücreler olarak kabul edilir, bu ise, ana hücrelerdir. Daha önce gösterildiği gibi, 600 mOsmol ortamı osmolaritesi AQP2 ¹⁹ yük atma önler. Buna ek olarak, AQP2 ifade membran geçirgen bir cAMP analoğu DBcAMP ile orta ilave tarafından korunur. AQP2 plazma memb azaltmak içinrane ekspresyonu ve böylece içi lokalizasyonu IMCD hücreleri lehine deneyler DBcAMP önce yaklaşık 24 saat olmadan tutulmalıdır. AQP2 çoğu kontrol edilen koşullar altında, plazma membranında lokalize ise, DBcAMP içermeyen yetiştirme zamanı uzamış olmalıdır. Standart tamponlar 60 mm kültür tabaklarında büyütülmüş hücreler lizis 1.5 mg protein, ¹⁰ verir.

AVP veya forskolin, adenilat siklaz doğrudan bir aktivatörü, plazma zarı (Şekil 2) hücre içi veziküllerden AQP2 translocates ile kısa süreli stimülasyon (30 dakika) üzerine. Buna ek olarak, IMCD hücrelerde ifade AQP2 AVP ya da forskolin ile (Şekil 3), ¹⁰ ile 30 dakikalık bir tehdidi üzerine artar. AQP2 bolca artış geliştirilmiş transkripsiyon ve çeviri bağımsızdır. Forskolin veya AVP stimülasyon p seviyesindeki bir azalma ile ilişkilidir, p38-, mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK-, p38), inhibisyonuna yol açarAQP2 bir serin 261 ve poli-ubikuitinasyon bir azalma da hosphorylation. Böylece, stimülasyon üzerine AQP2 bolluk artışı azalma proteozomal bozulması ¹⁰ atfedilir. Birlikte ele alındığında, IMCD hücreleri AQP2 kontrol mekanizmaları araştıran sağlar.

Tablo 1. AQP2 kontrol mekanizmalarının çalışmaları için Memeli böbrek hücre hatları. ÇAKI, mpkCCD ve mTERT-CCD hücreleri AQP2 endojen ifade. COS-7, HEK293 olarak, LLC-PK1, M1 ve MDCK hücre hatları, AQP2 pek saptanabilir. Ektopik CD8 MCD4 WT10 ve hücreler aşın AQP2.

Şekil 1. IMCD hücre kültürleri kurulması için prosedür şematik gösterimi. Deneysel adımlar ve deneyler için tercih hafta içi düzeni vardır belirtilmiştir. Primer fare hücreleri IMCD gün 0 üzerine ekildi ve 1 hafta sonra deneyler için kullanılır. Parantez içindeki sayılar "Protokol" başlığı altında açıklanan ilgili deneysel adımlara bakın.

Şekil 2. AVP ya da forskolin ile uyarılması üzerine plazma zarı içine AQP2 ekler. IMCD hücreleri kontrol edilen koşullar altında ya da sola ya da 37 ° C'de 30 dakika boyunca 100 nM AVP veya 10 uM forskolin ile uyarıldı Hücreler azalan olarak mikroskobi ile incelendi^10; (Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Almanya LSM 710) önce ribed. ^20,21; Çekirdekler DAPI ile görüntülendi, AQP2 ısmarlama bir antikor (antikor H27 kırmızı) ile tespit edildi. Üst panel, xy taramaları, alt panel, xz taramaları. Ölçek bar, 20 mikron.

Şekil 3,. Vasopresin (AVP) ile forskolin ile uyarılması üzerine AQP2 proteini bolluğu artar. IMCD hücreleri tedavi edilmezse (UTR) ya da 37 ya da 30 dakika boyunca 100 nM AVP (A) veya 10 uM forskolin (F) ° C ile uyarıldı Hücreler parçalanır edildi ve karmaşık glikozillenmiş (AQP2 cg), mannoz yüksek (AQP2 hm) ve olmayan glikozillenmiş AQP2 (AQP2 ng) AQP2 (sc-9882, SantaCruz) daha önce ¹⁰ açıklandığı karşı spesifik antikorlar kullanarak immunoblot tarafından tespit edildi. Bir yükleme kontrolü olarak α-tubulin (CP06, Calbiochem) ile tespit edildi. Gösterilen> 3 e bir temsilci sonucudurxperiments. Moleküler ağırlıklar, (kDa), belirtilir.

Biz primer sıçan IMCD hücrelerinin hazırlanması ve kültür için ayrıntılı bir protokol mevcut. Bu yaklaşım bir sıçan ²⁰ hücreleri 21 cm ² kadar verir. Deney, standart hücre kültürü ekipman gerektirir ve yaklaşık 6 saat içinde, tek bir kişi tarafından yapılabilir. Dolayısıyla, bu yaklaşım, bir standart laboratuar yöntemi olarak uygundur.

Primer fare IMCD hücreleri, 96 oyuklu plakalar, 60 mm yemekler arasında, farklı büyüklükte kültür tabaklarında tohumlanmış edilebilir. Bununla birlikte, 384 iyi biçimde büyümesi için optimizasyon prosedürü gerektirir. Biz büyüme yavaşlamış olarak 60 mm daha büyük yemekleri kullanmaktan kaçının. Hücreler, örneğin Western blot, immünopresipitasyon, DNA / RNA izolasyonu, immünofloresan mikroskopi, ^{Ca2 +} görüntüleme ve elektrofizyoloji ^10,22,23 gibi deneyler, çeşitli için uygundur.

Tohumlama sonra yaklaşık 6 ila 8 gün, birincil IMCD hücreler confl için yetiştirilenuent tek tabaka (Şekil 2). Hücre yüksekliği 3 olan - ortalama ^24, ve hücreleri üzerinde 5 mikron sıkıca bağlı ve endojen AQP2 ifade yüksek düzeyde tutmak vardır. AQP2 immünofloresan mikroskopik olarak tespit kadar hücrelerin% 80 AQP2 pozitif ana hücreler (; ^10,20 Şekil 3) temsil ettiğini gösterir. Morfolojik olarak hücreler uzun zaman, düz bir hücre sınırları, 1-3 nukleoli ile sitoplazması içine gömülü bir çekirdek ve birkaç belirgin sitoplazmik granüller ²⁰ ile karakterize edilir. Kültür kalan 20% AQP2-negatif hücrelerin kimliği kesin olarak tanımlanmamıştır. Maric ve arkadaşları. Hücre sınırları ²⁰ görselleştirmek için sıkı bağlantıları faz-kontrast mikroskobu ve immunofloresan mikroskopik analizler yapılmaktadır. AQP2-negatif hücrelerde kendi komşu hücreleri ve bir çekirdekçik ile bir çıkıntılı çekirdeğine girintiler ve invajinasyonları ile kavisli hücre sınırları görülmektedir. Based AQP2 pozitif hücrelerinkinden farklı olan bu morfolojisine Maric, ve ark. AQP2-negatif hücrelerin çoğu hücre dalanmasından önerdi. Buna ek olarak, kültür görünüşe göre birkaç fibroblastlar ²⁰ içerir. Bu hücrelerin ana hücreleri overgrowing başlattığınızda kültürler fazla 10 gün boyunca yetiştirilen eğer sadece belirgin hale gelir. Kültürümüzün durumu fibroblast altında tipik bir fibroblast görünüm görüntülenmez. Doğrultusunda, Gonzalzez ve ark. 5-8 gün tohumlama ²⁵ sonra benzer primer IMCD hücre kültürlerinde interstisyel hücreler bulundu.

Birincil IMCD hücre kültürleri biraz farklı bir şekilde hazırlanmış, ancak burada yukarıda tanımlanan diğer laboratuarlarda kullanılan ile benzer özelliklere sahip olan. Örneğin, Chou ve ark. Kollajen ^26, kaplı olmayan plastik yüzeylere tohum primer IMCD hücreleri. Ya da protokole göre hazırlanan birinci IMCD hücreleri benzer kaliteli gibiHer iki hücre içi ^{Ca2 +} ölçümü ^22,23,26 için uygun olan bir örneğidir. MRNA ve primer IMCD hücrelerinde salgılanan proteinlerin dair kapsamlı Affimetrix teknolojisi ²⁷ ve kütle spektrometrik analizi proteomu ²⁸ (ayrıca bkz kullanılarak transkripsiyonel profili elde edilmiştir http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Gibi birçok birincil hücreler için primer IMCD hücreleri, sınırlamalar düşük transfeksiyon oranı (≈ 1% ²⁹⁾ içerir. Kodlayan plazmid ya da protein kendileri (örneğin ³⁰⁾ mikroenjeke edilir Böylece eğer proteinlerin ekspresyonu neredeyse mümkündür. Diğer bir sınırlama primer IMCD hücreleri düzgün hücre polarite olmamasıdır. AVP, bazolateral plazma zarı (Şekil 2) ağırlıklı olarak AQP2 translocates yanıt. Bizim çalışmalarda doğru kutup, yani ikna etmek Çeşitli filtreler üzerinde hücrelerin büyüyerek apikal plazma zarına AQP2 translokasyon ikna etmek için, henüz başarılı olmamıştır.

Birlikte ele alındığında, yukarıda tarif edildiği gibi kurulmuş birinci IMCD hücreleri, AQP2 kontrol edilmesi için makine sahiptirler ve bu nedenle AQP2 düzenleme incelemek için uygun bir modeldir. Ancak, bunların kullanımı hayvan gerektirir ve bu nedenle diğer model kurulmuş sistemleri (yukarıya bakınız) ve diğer model sistemler olarak elde edilmiştir sonuçların doğrulanması için yürütülen edilemez deneyler ile sınırlı olmalıdır.

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (; KL 1415/3-2 ve KL 1415/4-2 DFG) tarafından desteklenmiştir.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman