덕트 세포를 수집 배양 차 쥐 내부 수질

아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 신장 주요 세포에 의해 물을 재 흡수를 촉진을 통해 몸에 물 항상성의 미세 조정을 제어합니다. 여기, 우리는 AVP-매개 물 재 흡수를 기본 분자 메커니즘의 해명에 적합한 덕트 세포를 수집 차 쥐 내부 수질의 재배를위한 프로토콜을 제시한다.

아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 신장 덕트 주요 세포를 수집하고이를 미세 조정 몸 물 항상성에 의해 물을 재 흡수를 용이하게합니다. AVP는 세포의 표면에 바소프레신​​ V2 수용체 (V2R)에 결합함으로써 캠프의 합성을 유도합니다. 이 물 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2)의 인산화의 변화를 선도하는 세포 신호 전달 과정을 자극한다. 단백질 키나아제 A는 AQP2를 phoshorylates함으로써 기본 소변에서 물을 재 흡수를 촉진 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서 AQP2의 전위를 트리거합니다. 주요 세포에서 뇌하수체 또는 AVP 활성화 신호에서 AVP 방출의 수차는 각각 중앙 또는 신원 성 요붕증을 일으킬 수 있으며, 높은 혈액 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 증후군 심혈관 질환과 관련이 있습니다.

여기, 우리는 cultivati​​위한 프로토콜을 제시한다표현 V2R 및 AQP2는 내생 덕트 (IMCD) 세포를 수집, 차 쥐 내부 수질의합니다. 세포는 AQP2의 컨트롤을 기본 분자 메커니즘을 해명에 적합하며, 따라서 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애와 관련된 질환의 치료를위한 새로운 약물 표적을 발견 할 수 있습니다. IMCD 세포는 쥐의 신장 내 medullae에서 얻을 수 있습니다 및 6~8일 파종 후 실험에 사용됩니다. IMCD 세포는 일반 세포 배양 접시, 플라스크 및 다른 형식의 마이크로 타이 터 플레이트에서 배양 할 수있는 절차는 몇 시간이 필요하며, 표준 세포 배양 실험실에 적합합니다.

신장 집합관 주 세포, 아르기닌 바소프레신​​ (AVP)는 물 삽입을 자극하여 물을 재 흡수를 제어하는​​ 플라즈마 막에 채널 아쿠아 포린-2 (AQP2). AVP는 아데 cyclase의함으로써 캠프의 형성을 자극 G 단백질 결합 바소프레신​​ 2 형 수용체 (V2R)에 바인딩합니다. 이 신호 폭포의 개시 단백질 키나제 A (PKA)의 활성화로 연결됩니다. PKA는 플라즈마 막으로 세포 내 소포에서의 재분배를위한 주요 트리거입니다, 256 (S256) 세린에서 AQP2를 인산화. 막 삽입 삼투 기울기 및 미세 조정 몸 물 항상성을 따라 물을 재 흡수를 용이하게합니다.

때문에 AVP 분비 또는 AVP 활성화 신호 원인 또는 수차에 AVP-매개 물의 재 흡수의 조절 장애는 심각한 질병과 연관됩니다. V2R 또는 AQP2의 돌연변이에 의해 발생 감소 물을 재 흡수는 표고 반면, 신원 성 요붕증로 연결ated 혈장 AVP 레벨은 만성 심장 마비와 부적절한 항 이뇨 호르몬 분비 (SIADH)의 증후군 심혈관 질환의 과도한 수분 재 흡수와 연결되어 있습니다.

AVP-매개 물을 재 흡수의 중요성뿐만 아니라 질병의 의미에서 유래한다. AQP2 베어링에 소포와 세포막과 융합의 AVP 유발 전위는 현재 잘 이해되지 않는 엄격 캠프에 의존 exocytic 프로세스를 나타냅니다. 캠프 의존 exocytosis에 대한 다른 예는 신장과 H의 레닌 분비 ⁺ 위장 분비한다. 따라서 신장 주요 세포에서 AQP2-전위를 지배하는 분자 메커니즘의 해명뿐만 아니라 다른 세포 유형에 비슷한 분자 프로세스를 이해하는 데 도움이뿐만 아니라 AVP-매개 물을 재 흡수의 장애와 관련된 질환의 치료에 대한 새로운 치료에 방법을 포장 수 있습니다 .

E기계 제어 AQP2를 lucidating은 덕트 주요 세포 모델을 수집해야합니다. 이를 위해 다른 포유 동물의 신장 세포 라인의 숫자를 사용할 수 있습니다. 그러나 이러한 모델은 몇 가지 단점을 가지고있다. 많은 세포 시스템에서 AQP2의 단백질 수준 (표 1, M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) 낮은 ^1-10 ectopically 다른 과발현 사람 (MCD4, WT10) ^11,12 또는 쥐 (CD8) ¹³ AQP2. MCD4 및 COS​​-7 세포에서 V2 수용체가 표시되지 않습니다. 우리의 지식이 신장 내 수질 집합관, AQP2 발현이 가장 풍부한 신장의 그 부분에서 파생 가능한 모델로 영구 세포 라인은 없지만, 대뇌 피질 집합관 ^{1,11,13-16에서} . 이러한 세포 모델은 예를 들어 널리 사용되는 불후의 mpkCCD (예를 들어, ¹⁷⁾ 또는 최근에 설립 된 mTERT-CCD ¹⁴ 세포주이다. 두 세포주 내생 적 표현 AQP2 및 V2R 그러나 그들은에서 파생되기 때문에대뇌 피질의 수집 덕트는 대부분 덕트 (IMCD) 세포를 수집하는 내부 수질에 비해 다른 프로테옴을 포함합니다. 그들은 예를 들어 다른 나 표현해야 ⁺ 교통 시스템입니다.

여기, 우리는 V2R 및 AQP2 내생 적 표현 문화의 기본 IMCD 세포 프로토콜을 제시한다. 이 모델은, 그러므로, 신장 수집 덕트에서 가장 밀접하게 생리적 상황을 나타냅니다. 문화를 확립하는 것이 필요하기는 표준 실험실 장비 기타 실험실은 쉽게이 방법을 채택 할 수 있습니다.

1. 준비하기

1. 배양 접시를 준비
   1. 해동 콜라겐 유형 4에서 IV O / N ° C와 0.1 % 멸균 아세트산에 용해. 사용하는 볼륨은 세포가 파종을 작성할 수있는 요리의 종류와 수에 따라 달라집니다. 2 ㎍ / cm ^2를 사용하십시오.
   2. 적어도 RT에서 1 시간 동안 요리를 품어 증류수 (A. tridest)로 두 번 씻는다.
   3. 요리가 제대로 건조하도록 허용합니다.
2. 매체의 보완
   1. 500 ML 매체에 1.75 g의 포도당을 추가하여 최대 4.5 g / L의 포도당 수준을 높일 수 있습니다. 매체 600 mosmol으로 조정하려면, 각각 200 mosmol 100 mosmol하여 삼투압을 증가, 100 mM의 NaCl을 100 MM의 요소를 추가합니다.
   2. 600 mosmol DMEM 배지에 1 % 비 필수 아미노산, 1 % ultroser, 500 μM의 DBcAMP, 20 U / ㎖ 스타틴 0.25 ㎍ / ㎖ 겐타 마이신 (50 ㎍ / ㎖의 농도 원액 1:200 희석)을 추가 갓 준비의 날에.
3. 효소 솔루션
   1. 에 1 밀리그램 / ML 히알루 2.2 MG / ML 콜라를 추가 DPBS 함유 0.25 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신과 스타틴을. 2 신장 내부 medullae의 소화에 대한이 효소 용액 1 ㎖를 준비합니다. 이 솔루션은 여과 멸균되어야하며, 50 ML 팔콘 튜브에 저장됩니다.

2. 차 쥐 내부 수질의 재배 덕트 (IMCD) 세포를 수집

모든 동물의 처리 절차는 로컬 및 연방 법률을 준수 실시하여야한다.

1. CO _2의 쥐 (CO _2로 포화 상자) 또는 isoflurane을 (; ~ 2.5 % isoflurane을 가진 공기 흐름 350-400 ML / 분 U-400 마취 장치, Univentor 회사, 몰타)을 마취시키다. 흰 안쪽과 어두운 바깥 수질 경계의 정확한 검출을 허용 출혈 동물의 목을 베십시오. 또한, 출혈 격리 적혈구의 수를 최소화합니다. 신장을 제거하고얼음 겐타 마이신과 스타틴 (위 참조) 보충 멸균 DPBS에서 그들을 씻어. 모든 추가 단계는 무균 클린 벤치 조건 하에서 실시하여야한다.
2. 과도한 액체를 제거하는 살균 압축에 DPBS 용액으로부터 신장을 전송합니다. 멸균 집게와 가위로 지방 신장 캡슐을 제거합니다.
3. 신장은 여전히​​ 압축에 고정 바깥 쪽 (피질) 측의 종축 옆에 약간 잘라 데. 완전히 극복 할 수 있지만, 신장 골반에 연결 한 조각에 남기지 않도록해야합니다.
4. 곡선 가위로 조심스럽게 장미 반짝이는 외부 수질에 둘러싸여 흰 내부 medullae를 해부. 얼음에 60mm 배양 접시에 겐타 마이신과 스타틴을 포함 DPBS에서 그들을 수집합니다.
5. 모든 medullae이 고립 얼음에 수집되면, 그들은 그냥 버퍼로 덮여 수준으로 DPBS의 양을 줄일 수 있습니다. 5 큐브로 medullae를 잘라 살균 면도칼을 사용하여mm ^3.
6. 화염으로 짧게 잡고 녹여 멸균 파스퇴르 피펫의 예리한 끝을 라운드. 피펫 계속하기 전에 냉각되어 있는지 확인합니다.
7. 둥근 파스퇴르 피펫을 사용하여 히알루 및 콜라게나 제 (1.3.1 참조) 갓 준비한 살균 효소 솔루션을 포함하는 50 ML 팔콘 튜브에 조직 현탁액을 전송합니다. 단단히 뚜껑을 닫고 37 ° C 1.5 일반 탁상 물 목욕 연속 교반 (220 rpm)가 아​​래에서 알을 품다 - 2 시간.
8. 서스펜션의 분쇄를 들어, 정지 균일 혼탁 될 때까지 라운드 파스퇴르 피펫 (위 참조)를 여러 번 내려 혼합물을 피펫.
9. 300 XG에서 5 분, 16 ° C.를위한 현탁액을 원심 분리기 상층 액을 버리고 침전물을 다시 겐타 마이신과 스타틴과 원심 분리기를 포함 DPBS에 철저 resuspend을. 한번이 세척 단계를 반복합니다.
10. 완벽하게 보완 매체와 C에 씨앗을에서 세포를 resuspend을ulture 요리 및 / 또는 미세 역가 웰 플레이트. 2 medullae (1 동물)의 준비를 한 60mm 배양 접시에 충분한 세포를 얻을 것입니다.
11. 24 시간 후, 600 mosmol DMEM로 두 번 세포를 씻으 신선한 매체를 추가합니다. 다음 주에 세포를 2 ~ 3 회 (그림 1) 세척해야한다. 6-8일 파종 후 IMCD 세포 실험에 사용할 수 있습니다. 실험을 시작하기 전에 24 시간 동안 DBcAMP 및 스타틴없이 매체를 배양해야합니다. 그렇지 않으면 AQP2는 플라즈마 막에서 독점적 위치합니다.

차 쥐 IMCD 세포의 성공적인 재배 6-8일 파종 후 합류 단층 (그림 2)가 발생합니다. 60mm 배양 접시 당 약 6 × 10 ⁶ 세포가 있습니다. 이들은 콜라겐 유형 IV, 기저막 구성 요소를 ^18로 코팅 된 것과 세포는 단단히 배양 접시에 부착. 따라서 IMCD 세포는 여러 철저한 세척 과정에서도 분리되지 않습니다. 까지 배양 세포의 80 %는 내생 V2R 및 AQP2를 표현한다. AQP2가 부족한 세포가 협재 세포 헨레, 바사 곧은 창자 또는 내부 수질 간질 세포의 루프의 얇은 사지에서 파생 된 비 IMCD 세포로 간주됩니다 반면, 이들은 주요 세포이다. 우리는 앞에서 설명한 바와 같이, 600 mosmol의 중간 삼투압는 AQP2 ¹⁹ 다운 규제를 방지 할 수 있습니다. 또한, AQP2 발현은 막 투과 캠프 아날로그 DBcAMP와 매체를 보완하여 유지됩니다. AQP2 플라즈마 MEMB을 줄이기 위해RANE 표현함으로써 그 세포 현지화 IMCD 세포를 선호하는이 실험 전에 DBcAMP 약 24 시간없이 유지되어야한다. AQP2의 대부분은 제어 조건 하에서 플라즈마 막에 국한되어있는 경우, DBcAMP없는 재배의 시간을 연장해야한다. 표준 버퍼의 60mm 배양 접시에서 자란 세포의 용해는 1.5 MG 단백질 ¹⁰ 얻을 수 있습니다.

AVP 또는의 forskolin, 아데 cyclase의의 직접적인 활성제, 플라즈마 막 (그림 2)의 세포 내 소포에서 AQP2 translocates로 단기 자극 (30 분)시. 또한, IMCD 세포에서 AQP2 발현은 AVP 또는의 forskolin (그림 3) ^10와 30 분 도전에 증가합니다. AQP2 풍부의 증가는 강화 된 전사와 번역의 독립적입니다. 의 forskolin 또는 AVP 자극은 P의 수준 감소와 관련된 P38-분열 물질 활성화 된 단백질 키니 아제 (P38-MAPK)의 억제로 연결AQP2의 세린 261과 폴리 - 유비퀴틴의 감소에 hosphorylation. 따라서, 자극에 따라 AQP2 풍요의 증가는 감소 프로 테오 저하 ¹⁰ 관찰 작용합니다. 함께 촬영 IMCD 세포는 AQP2를 제어하는​​ 메커니즘을 조사 할 수 있습니다.

표 1. AQP2 제어 메커니즘의 연구 포유류 신장 세포 라인. CAKI, mpkCCD 및 mTERT-CCD 세포는 AQP2 내생을 표현한다. COS-7, HEK293에서, LLC-PK1, M1 및 MDCK 세포주, AQP2는 거의 감지 할 수있다. ectopically CD8, MCD4 및 WT10 세포를 과발현 AQP2.

그림 1. IMCD 세포 배양을 확립하기위한 절차의 도식 표현. 실험 단계와 실험에 대한 선호 평일의 순서입니다 지적했다. 차 쥐 IMCD 세포는 0 일에 파종하는 1 주일 후 실험에 사용됩니다. 괄호 안의 숫자는 "프로토콜"에 설명 된 각각의 실험 단계를 참조하십시오.

그림 2. AVP 또는의 forskolin 자극에 따라 플라즈마 막에 AQP2를 삽입합니다. IMCD 세포 제어 상태에서 왼쪽 또는 하나 37 ℃에서 30 분 동안 100 nm의 AVP 또는 10 μM의의 forskolin로 자극 하였다 셀은 내림차순으로 면역 현미경으로 분석 하였다^10, (칼 자이스 MicroImaging, 예나, 독일 LSM 710) 전에 ribed. ^20,21; 핵 DAPI와 시각이었다 AQP2는 사용자 정의 - 만든 항체 (항체 H27 빨간색)로 검출되었다. 상단 패널, XY 스캔, 낮은 패널, XZ 검사. 스케일 바, 20 μm의.

그림 3. 바소프레신 ​​(AVP)과의 forskolin와 자극시 AQP2 단백 풍부한 증가합니다. IMCD 세포 치료 왼쪽 (UTR) 또는 하나 37에서 30 분간 100 nm의 AVP (A) 또는 10 μM의 forskolin (F) ° C.로 자극 하였다 세포 용해 된 복잡한 당화 (AQP2 CG), 만노오스 고 (AQP2 HM) 및 비 당화 AQP2 (AQP2 NG)는 AQP2 (SC-9882, 산타 크루즈) 앞에서 ¹⁰ 기술에 대하여 특정 항체를 사용하여 면역 블롯에 의해 발견되었습니다. 로딩 컨트롤로 α-튜 블린 (CP06, Calbiochem)이 검출되었다. 표시는> 3 전자의 대표 결과xperiments. 분자량 (kDa의) 표시됩니다.

우리는 차 쥐 IMCD 세포의 준비 및 배양에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 방법은 하나의 쥐 ^20의 세포의 21cm ^2까지 얻을 수 있습니다. 실험은 표준 세포 배양 장비가 필요하고 약 6 시간 안에 한 사람에 의해 수행 할 수 있습니다. 따라서이 방법은 표준 실험 방법으로 적합합니다.

차 쥐 IMCD 세포를 96 웰 플레이트에서 60mm 요리에 이르기까지 다양한 크기의 배양 접시에 분주 할 수 있습니다. 그러나 384도 형식의 성장을위한 절차는 최적화가 필요합니다. 우리는 성장 둔화로 60mm보다 큰 그릇을 사용하지 마십시오. 세포는 웨스턴 블롯, 면역 침전, DNA / RNA 분리, 면역 형광 현미경, 칼슘 ^{2 +} 이미징 및 전기 생리학 ^10,22,23 등 다양한 실험에 적합합니다.

파종 후 약 6-8일는 기본 IMCD 세포 confl로 성장하는uent 단층 (그림 2). 셀 높이가 3 - 평균 ^24, 그리고 세포에 5 μm의 긴밀하게 연결되고 내생 AQP2 발현의 높은 수준을 유지하고 있습니다. AQP2의 면역 미세한 검출까지 세포의 80 %은 AQP2 양성 주요 세포 (; ^10,20 그림 3)를 나타냅니다 나타냅니다. 형태 학적으로 세포는 긴 직선 셀 테두리, 1-3 핵소체와 세포질에 포함 핵, 여러 저명한 세포질 과립 ^(20)에 의해 특징입니다. 문화의 나머지 20 % AQP2-음성 세포의 신원이 명백하게 정의되지 않았습니다. 마릭 등은. 셀 경계에게 ^20을 시각화 꽉 접합의 위상 대비 현미경과 면역 형광 현미경 분석을 실시했다. AQP2-음성 세포에서 그들의 이웃 세포와 한 핵소체를 가진 돌출 핵 들여 쓰기 invaginations과 곡선 셀 테두리를 관찰했다. 바스ED는 AQP2-양성 세포의 구별되는이 형태에 마릭 등. AQP2-음성 세포의 대부분은 세포를 협재하는 것이 좋습니다. 또한, 문화는 분명히 몇 가지 섬유 아세포에게 ^20를 포함합니다. 이러한 세포의 주요 세포를 overgrowing 시작할 때 문화가 10 일 이상 재배하는 경우 그들은 단지 명백한됩니다. 우리의 문화 조건 아세포에서 일반적인 섬유 아세포 모양을 표시하지 않습니다. 라인, Gonzalzez 등. 5-8일 파종 ^{25 일} 이후 유사한 기본 IMCD 세포 배양에서 간질 세포를 발견했다.

기본 IMCD 세포 배양는 약간 다른 방식으로 준비하지만, 위에서 설명한 다른 실험실에서 사용되는와 유사한 특성을 가지고있는. 예를 들어, 추 등. 콜라겐 ²⁶ 코팅되지 않은 플라스틱 표면에 씨앗 기본 IMCD 세포. 두 프로토콜에 따라 제조 주요 IMCD 세포와 유사한 고품질의 것모두 내 Ca ^{2 +} 측정 ^22,23,26에 적합합니다 예를 들어 같은. 의 mRNA 및 기본 IMCD 세포에서 발현 단백질의 포괄적 인 목록은 Affimetrix 기술 ²⁷ 질량 분석 프로테옴 분석 ²⁸ (참조하여 전사 프로파일에서 얻은 http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd을 ).

많은 차 전지의 기본 IMCD 세포의 제한이 낮은 형질 전환 속도 (≈ 1 % ^29)가 있습니다. 인코딩 플라스미드 나 단백질 자체가 (예 : ³⁰⁾ 미세 주입하는 경우 따라서 단백질의 발현이 거의에서만 가능합니다. 추가 제한 사항은 기본 IMCD 세포의 적절한 세포 극성의 부족이다. AVP, 기저 외측 세포막 (그림 2)에 주로 AQP2 translocates 님의 질문에 답변. 시련은 극성, 즉 유도 은 다양한 필터에 세포를 증가하여 정점 플라즈마 막에 AQP2의 전위를 유도하기 위해 아직 성공하지 않았습니다.

종합적으로, 위에서 설명한대로 설정 기본 IMCD 세포, AQP2를 제어하기위한 기계를 가지고, 따라서 AQP2 규제를 공부에 적합한 모델입니다. 그러나, 그들의 사용은 동물을 필요로하기 때문에 다른 설치 모델 시스템 (위 참조)과 다른 모델 시스템에서 얻은 결과의 검증을 위해 수행 할 수없는 실험을 제한해야합니다.

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (, KL 1415/3-2와 KL 1415/4-2 DFG)에 의해 지원되었다.

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman