管細胞の収集培養初代ラットインナー髄

アルギニン·バソプレシン（AVP）は腎校長細胞による水の再吸収を促進を通じて体内の水分の恒常性の微調整を制御します。ここでは、AVP-媒介水再吸収の根底にある分子機構の解明に適した管細胞を集め初代ラット内側の延髄の栽培のためのプロトコルを提示します。

アルギニン·バソプレシン（AVP）はダクト校長細胞とそれによって微調整の体水分ホメオスタシスを集めることにより、水腎再吸収を促進します。 AVPは、細胞の表面上バソプレシンV2受容体（V2R）に結合し、それによって、cAMPの合成を誘導する。これは、水路アクアポリン2（AQP2）のリン酸化の変化をもたらす細胞内シグナル伝達プロセスを刺激する。プロテインキナーゼは、AQP2をphoshorylates、それによって主要な尿からの水の再吸収を促進する形質膜に細胞内の小胞からAQP2の転座をトリガします。主要細胞内の下垂体またはAVP-活性化シグナリングからAVP放出の収差はそれぞれ、中央または腎性尿崩症を引き起こす可能性があり、血中血漿AVPレベルは、慢性心不全および抗利尿ホルモン不適合分泌症候群などの心血管疾患に関連付けられています。

ここでは、cultivati​​ためのプロトコルを提示する急行V2RとAQP2内因ダクト（IMCD）細胞を収集初代ラット内側の延髄の上。細胞は、AQP2の制御の根底にある分子メカニズムを解明するのに適しているので、AVP媒介性の水再吸収の調節不全に関連する疾患の治療のための新規薬剤標的を発見する。 IMCDネズミ腎細胞は、内側髄質から得られ、六から八日播種後の実験のために使用される。 IMCD細胞は規則的な細胞培養ディッシュ、フラスコ、異なる形式のマイクロタイタープレートで培養することができ、手順は数時間を必要とし、標準的な細胞培養実験室に適している。

腎集合管主な細胞では、アルギニン·バソプレシン（AVP）は、原形質膜への水チャネルアクアポリン2（AQP2）の挿入を刺激による水再吸収を制御します。 AVPは、アデニリルシクラーゼことにより、cAMP形成を刺激するGタンパク質共役型バソプレッシン-2受容体（V2R）に結合する。このシグナリングカスケードの開始は、プロテインキナーゼA（PKA）の活性化をもたらす。 PKAは、原形質膜への細胞内小胞からの再分配のための重要なトリガーである、256（S256）セリンでAQP2をリン酸化する。膜挿入は、浸透勾配に沿って水の再吸収と微調整の体内の水分の恒常性を容易にします。

原因AVP分泌またはAVP-活性化シグナリング原因かの収差AVP媒介水再吸収の調節不全は、深刻な病気に関連付けられています。 V2RまたはAQP2の突然変異によって引き起こさ減少水の再吸収はELEVのに対し、腎性尿崩症につながるated血漿AVPレベルは、慢性心不全および不適切な抗利尿ホルモンの分泌（SIADH）の症候群などの心血管疾患の過度の水再吸収に関連付けられています。

AVP媒介水再吸収の重要性だけではなく、病気でその意義に由来する。 AQP2有利子に小胞と形質膜と融合のAVP-誘発転座は、現在十分に理解されていない厳密にcAMP依存性エキソサイトーシス過程を表します。 cAMP依存性エキソサイトーシスのための他の例としては、腎臓とHにおけるレニン分泌⁺胃の中に分泌されています。したがって、腎主要細胞内AQP2-転座を支配する分子メカニズムの解明だけでなく、他の細胞型で同様の分子プロセスを理解するのに役立つだけでなく、AVP-媒介水再吸収の障害に関連する疾患の治療のための新しい治療法に道を開くことが。

EAQP2を制御lucidatingメカニズムは、集合管主な細胞モデルを必要とします。このため、異なる哺乳類の腎臓細胞株の数が用意されています。しかしながら、これらのモデルはいくつかの欠点を有する。多くの細胞系におけるAQP2のタンパク質レベルが低い（ 表1; MDCK ^{M1、HEK293、COS-7、、LLC-PK1）1-10、}異所性に過剰発現する他の人間^{（MCD4、WT10）11,12}またはラット（CD8） ¹³ AQP2。 MCD4およびCOS-7細胞ではV2受容体が発現していない。我々の知る限りそこ腎髄質内層集合管、AQP2式が最も豊富である腎臓のその部分から派生して利用できるモデルなど恒久的な細胞株はありませんが、皮質集合管^1,11,13-16から。このような細胞モデルは、広く使われている例不死mpkCCD（ 例えば ^17）、または最近設立mTERT-CCD ¹⁴細胞株のためのものです。両方の細胞株内因的に発現AQP2とV2Rが、それらは由来しているので皮質集合ダクトは、最も可能性の高いダクト（IMCD）細胞を収集し、内側延髄に比べ異なるプロテオームが含まれています。彼らは、例えば別のNaを表現しなければならない⁺交通システム。

ここでは、V2RとAQP2内因を表現文化プライマリーIMCD細胞にプロトコルを提示します。このモデルは、したがって、最も近い腎集ダクト内の生理学的状況を示す。文化を確立したように、標準実験装置他の研究室は、簡単にこのアプローチを採用することができます必要があります。

1。準備

1. 培養皿の準備
   1. 4で解凍コラーゲンタイプIV O / N°C、0.1％滅菌酢酸に溶かし。使用するボリュームは、細胞が播種されるようにされている料理の種類や数によって異なります。 2μgの個/ cm ^2を使用します。
   2. 室温で1時間、少なくとも料理をインキュベートし、蒸留水（A. tridest）で2回洗浄する。
   3. 料理は適切に乾燥させます。
2. 媒体の補充
   1. 、500mlの培地に1.75グラムのブドウ糖を追加することで、最大4.5グラム/ Lに血糖値を上げます。培地600ミリオスモルへを調整するには、それぞれ、200ミリオスモルと100ミリオスモルによって浸透圧を高めるために、100mMのNaClと100mMの尿素を加える。
   2. 600ミリオスモルDMEM培地に1％非必須アミノ酸、1％ultroser、500μMの非添加、20 U / mlのナイスタチン及び0.25μgの/ mlのゲンタマイシン（50μgの/ mlの濃度とストック溶液の1:200希釈）を追加新たに準備の日に。
3. 酵素溶液
   1. DPBS含有0.25μgの/ mlのゲンタマイシンおよびナイスタチンに1 mg / mlのヒアルロニダーゼおよび2.2 mg / mlのコラゲナーゼを追加します。 2腎臓内部の髄質の消化のため、この酵素溶液1mlを準備します。溶液を濾過滅菌しなければならず、50ミリリットルファルコンチューブに格納されている。

2。ダクト（IMCD）細胞を回収初代ラットインナー髄の栽培

すべての動物の取り扱い手順は、ローカルおよび連邦法に準拠して行わなければならない。

1. CO ₂のラット（CO ₂で飽和ボックスで）またはイソフルラン（; 2から2.5パーセントイソフルランとエアーフロー350〜400ミリリットル/分のU-400麻酔ユニット、Univentor株式会社、マルタ）Anaesthetize。白っぽい内側と外側の暗い髄質の境界の正確な検出を可能出血のために動物の首を刈る。また、出血が孤立し、赤血球の数を最小限に抑えることができます。腎臓を取り出し、氷の上で（上記参照）ゲンタマイシンおよびナイスタチンを補っ滅菌DPBSでそれらを洗ってください。すべてのさらなるステップは、滅菌クリーンベンチの条件下で実施されるべきである。
2. 過剰な液体を除去する滅菌湿布にDPBS溶液から腎臓を転送します。滅菌ピンセットとハサミで脂肪腎臓カプセルを取り外します。
3. 腎臓はまだ圧縮で固定された、外側（皮質）側の縦軸横に少しカット。完全にカットスルーするのが、腎盂に接続し、一枚でそれを残していないことを確認してください。
4. 湾曲したハサミで丁寧にロゼきらめくアウター髄質に囲まれている白っぽい内側の髄質を解剖。氷の上を60mm培養皿にゲンタマイシンおよびナイスタチンを含む、DPBSでそれらを収集します。
5. すべて髄質たら氷の上に分離し、収集され、それらは単にバッファで覆われているレベルにDPBSの量を減らす。 5のキューブに髄質をカットする滅菌カミソリの刃を使用して、ミリメートル^3。
6. 炎に簡単にそれを保持することによって溶融、滅菌パスツールピペットの鋭い端を丸める。ピペットは、続行する前に冷却されていることを確認します。
7. 丸みを帯びたパスツールピペットを用いて、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼ（1.3.1を参照）を用いて新たに調製滅菌酵素溶液を含有する50ミリリットルファルコンチューブに組織懸濁液を移す。しっかりと蓋を閉め、37℃で1.5のための定期的な卓上水浴中で連続攪拌（220回転）の下でインキュベート - 2時間。
8. サスペンションを均一混濁になるまで、懸濁液の粉砕のために、ラウンドパスツールピペット（上記参照）と、上下に数回混合物をピペット。
9. 300 xgで5分間16℃の懸濁液を遠心上清を捨て、再びゲンタマイシンおよびナイスタチンと遠心分離機を含む、DPBSで徹底的にペレットを再懸濁します。一度この洗浄工程を繰り返します。
10. 完全培地と種子、それらをCで細胞を再懸濁しulture料理および/またはマイクロタイターウェルプレート。 2髄質（1動物）の調製は、1を60mm培養皿に十分な細胞が得られます。
11. 24時間後、600ミリオスモルDMEMで細胞を2回洗浄し、新鮮な培地を追加します。来週中に、細胞を2〜3回（ 図1）を洗浄する必要があります。 6-8日播種後、IMCD細胞を実験に使用することができる。実験を開始する前に、24時間非添加およびナイスタチンを含まない培地でそれらをインキュベートすることを忘れないでください。そうでなければAQP2は形質膜に排他的に配置される。

初代ラットIMCD細胞の正常な栽培は6-8日播種後コンフルエントな単層（ 図2）になります。 60ミリメートル培養皿あたり約6×10 ^6個の細胞があります。これらはIV型コラーゲン、基底膜成分を¹⁸でコーティングしたような細胞がしっかりと、培養皿に付着する。したがって、IMCD細胞はいくつかの徹底した洗浄手順の中でも切り離すことはありません。最大培養細胞の80％は、内因V2RとAQP2を表明。 AQP2を欠いた細胞がインターカレート細胞、ヘンレ、直細血管または内側髄質間質細胞のループの細い手足由来非IMCD細胞と考えられているのに対し、これらは、主要な細胞である。我々は先に示したように、600ミリオスモルの培地浸透圧はAQP2 ¹⁹のダウンレギュレーションを防ぎます。また、AQP2発現は膜透過性のcAMPアナログ非添加で媒体を補充することによって維持される。 AQP2プラズマMEMBを低減するために、RANE表現したがって、その細胞内局在IMCD細胞を支持するためには、実験前に非添加約24時間せずに維持する必要があります。 AQP2のほとんどは、制御条件下での形質膜に局在している場合は、非添加を含まない培養の時間を長くする必要がある。標準バッファさ60mm培養皿で培養した細胞の溶解は、1.5 mgタンパク質^10が得られます。

AVPまたはフォルス、アデニル酸シクラーゼを直接活性化因子、形質膜（ 図2）、細胞内小胞からAQP2転位の短期刺激（30分）時。加えて、AVPまたはフォルスコリン（ 図^3）10と30分の挑戦時IMCD細胞増加AQP2式。 AQP2豊富の増加は、強化された転写と翻訳とは無関係です。フォルスコリンまたはAVP刺激は、pのレベルの減少に関連付けられているP38-マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（P38-MAPK）の阻害につながるAQP2のセリン261およびそのポリユビキチン化の減少でhosphorylation。このように、刺激によるAQP2豊富の増加が減少プロテアソーム分解¹⁰に帰されている。一緒になって、IMCD細胞がAQP2を制御するメカニズムを調査できます。

表1。 AQP2制御機構の研究のための哺乳類の腎臓細胞株 。 CAKI、mpkCCDとmTERT-CCD細胞がAQP2内因を表現。 COS-7、HEK293、LLC-PK1、M1およびMDCK細胞株で、AQP2はほとんど検出することができる。異所AQP2過剰発現CD8、MCD4とWT10細胞。

図1。 IMCD細胞培養を確立するための手順の概略図は 、 実験手順、実験のために好ましい平日の順序であるが示された。初代ラットIMCD細胞を0日目に播種し、そして1週間後の実験のために使用される。括弧内の数字は、 "議定書"の下に記載され、それぞれの実験の手順を参照してください。

図2。 AVPまたはフォルスコリンによる刺激時の細胞質膜にAQP2挿入。IMCD細胞は制御条件の下でのままにするか、またはどちらか37℃で30分間、100 nmのAVPまたは10μMのフォルスコリンで刺激した細胞はDESCとして免疫蛍光顕微鏡で分析した^10;（カールツァイスマイクロイメージング、イエナ、ドイツLSM 710）前ribed。 ^20,21;核はDAPIで可視化した、AQP2はカスタムメイドの抗体（抗体H27赤）で検出した。上部パネル、XYスキャン、下のパネル、XZスキャン。スケールバーは20μm。

図3。バソプレシン（AVP）とフォルスコリンによる刺激時AQP2タンパク質量が増加します。IMCD細胞は、未処理のまま（UTR）どちらか37℃で30分間100 nMのAVP（）または10μMのフォルスコリン（F）℃までで刺激した細胞を溶解し、グリコシル化複合体（AQP2 CG）、（AQP2 HM）マンノース高いとAQP2グリコシル非（AQP2 NG）前述の¹⁰としてAQP2（SC-9882、サンタクルス）に対して特異的な抗体を用いたイムノブロットにより検出した。たローディングコントロールとして、α-チューブリン（CP06、カルビオケム）が検出されました。示されては> 3電子の代表結果であるxperiments。分子量（70kDa）を有する示されている。

私たちは、初代ラットIMCD細胞の調製と培養するための詳細なプロトコルを提示します。アプローチでは、1匹のラット²⁰から細胞21 cm ^2とまで得られます。実験は、標準的な細胞培養装置を必要とし、約6時間以内に一人で行うことができる。したがって、このアプローチは、標準的な実験方法として好適である。

初代ラットIMCD細胞を96ウェルプレートから60ミリメートルの料理に至るまで、サイズの異なる培養皿に播種することができます。しかし、384ウェルフォーマットでの成長のための手順は、最適化が必要。私たちは、成長が減速を60 mm以上の皿を使用しないでください。細胞は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、DNA / RNA分離、免疫蛍光顕微鏡、のCa ^{2 +}イメージングと電気生理学^10,22,23などの様々な実験に適しています。

播種後約6〜8日には、主IMCD細胞がconflに栽培されているuent単分子層（ 図2）。セルの高さは、3 -平均値^24、および細胞上5μmではしっかり取り付けられ、内因AQP2高レベルの発現を維持している。 AQP2の免疫蛍光顕微鏡検出は、細胞の80％までのことをアップすることを示しAQP2陽性校長細胞（ 図^3、10,20）を表します。形態学的に細胞が長く、ストレートセルの枠線、二時五十九核と細胞質内に埋め込 ​​まれた核、およびいくつかの著名な細胞質顆粒²⁰によって特徴付けられる。培養物の残りの20％AQP2陰性細胞の同定は、明確に定義されていない。マリックらは^、20セルの境界を視覚化する位相差顕微鏡およびタイトジャンクションの免疫蛍光顕微鏡分析を行った。 AQP2陰性細胞では彼らは隣接セルと1核小体を持つ突出核にくぼみや陥入と湾曲したセルの枠線を観察した。ストッキングAQP2陽性細胞のものとは異なるが、この形態にオピニオン、マリックらは AQP2陰性細胞の大部分がインターカレー細胞であることが示唆された。また、文化は明らかに少数の線維芽細胞^20を含んでいます。これらの細胞は主要細胞overgrowing起動時に培養液を10日間以上栽培されている場合、彼らは明らかになる。我々の培養条件の芽の下に典型的な線維芽細胞の外観が表示されません。ラインでは、Gonzalzez ら 5-8日播種^25日以降同様の主要IMCD細胞培養における間質細胞を発見した。

プライマリIMCD細胞培養物は、わずかに異なる方法で調製したが、上述のものは他の研究室で使用されている同様の特性を有している。たとえば、チョウらコラーゲン²⁶でコーティングされていないプラスチック表面上の種子主要IMCD細胞。どちらのプロトコルに従って調製主IMCD細胞が同じような高品質で見える例えばとしての両方が細胞内Ca ^{2 +}測定値^22,23,26に適している。プライマリーIMCD細胞で発現するmRNAやタンパク質の包括的リストはAffimetrix技術²⁷と質量プロテオーム解析^28（も参照使用転写プロファイリングから得られたhttp://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ）。

多くの初代細胞用として主IMCD細胞の制限は、低トランスフェクション率^{（≈1％29）を}含む。エンコーディングプラスミドまたはタンパク質自体がマイクロインジェクションされている場合このように、タンパク質の過剰発現は、（ 例えば ^30）は、ほぼ唯一の可能性があります。さらに制限が主IMCD細胞の適切な細胞の極性の欠如である。 AVP、AQP2転位に応答して、主に側底形質膜（ 図2）に変換する。正しい極性を誘導するため、当社試験、 すなわち は、種々のフィルタの細胞を増殖させることにより、頂端細胞膜へのトランスロケーションAQP2を誘導するために、まだ成功していない。

まとめると、上述したように確立された第一のIMCD細胞は、AQP2を制御するための機械を有し、従ってAQP2調節を研究するのに適したモデルである。しかし、それらの使用は、動物を必要とし、従って、他の確立されたモデル系で行うことができない実験に限定されるべきである（上記参照）と他のモデル系で得られた結果を検証するため。

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

この作品は、ドイツ学術振興（; KL 1415/3-2とKL 1415/4-2 DFG）によってサポートされていました。

A correction was made to Culturing Primary Rat Inner Medullary Collecting Duct Cells. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:

Enno Klussmann

instead of:

Enno Klussman