Coltura primaria Rat midollare interna Raccolta cellule del dotto

Arginina-vasopressina (AVP) controlla la messa a punto del corpo omeostasi acqua facilitando il riassorbimento di acqua da parte delle cellule principali renali. Qui vi presentiamo un protocollo per la coltivazione di ratto primario midollare interna raccogliere cellule del dotto adatti per la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base di riassorbimento di acqua AVP-mediata.

Arginina-vasopressina (AVP) facilita il riassorbimento di acqua da parte renale raccogliendo cellule principali del dotto e quindi una messa a punto del corpo omeostasi acqua. AVP si lega ai recettori V2 della vasopressina (V2R) sulla superficie delle cellule e induce quindi la sintesi di cAMP. Questo stimola processi di segnalazione cellulari che portano ai cambiamenti nella fosforilazione del canale dell'acqua aquaporina-2 (AQP2). Proteina chinasi A phoshorylates AQP2 e innesca così la traslocazione di AQP2 da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica facilitando riassorbimento di acqua da urina primaria. Aberrazioni di AVP liberazione dalla segnalazione ipofisi o AVP-attivato nelle cellule principali possono causare il diabete insipido centrale o nefrogenica, rispettivamente, un plasma sanguigno livello AVP elevata è associata a malattie cardiovascolari come l'insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico.

Qui vi presentiamo un protocollo per cultivatiil ratto di primaria midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule, che esprimono V2R e AQP2 endogena. Le cellule sono adatti per chiarire i meccanismi molecolari alla base del controllo di AQP2 e quindi di scoprire nuovi bersagli farmacologici per il trattamento di malattie associate alla disregolazione del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata. Cellule IMCD sono ottenuti da topo renale midollare interna e sono utilizzati per esperimenti da sei a otto giorni dopo la semina. Cellule IMCD possono essere coltivate in piatti normali di coltura cellulare, boccette e piastre micro-titolo di formati diversi, la procedura richiede solo poche ore, ed è adatto per laboratori standard di coltura cellulare.

Nella raccolta di cellule principali del dotto renali, arginina-vasopressina (AVP) controlla il riassorbimento dell'acqua stimolando l'inserimento del canale dell'acqua aquaporina-2 (AQP2) nella membrana plasmatica. AVP si lega alla proteina-accoppiato vasopressina di tipo-2 recettore G (V2R) stimolare ciclasi e quindi formazione di cAMP. Apertura di questa cascata di segnalazione porta all'attivazione della proteina chinasi A (PKA). PKA fosforila AQP2 a serina 256 (S256), che è la chiave di innesco per la sua ridistribuzione da vescicole intracellulari nella membrana plasmatica. L'inserimento della membrana facilita il riassorbimento dell'acqua lungo un gradiente osmotico e di una messa a punto del corpo omeostasi acqua.

Disregolazione del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata, a causa della secrezione di AVP aberrazioni o cause di segnalazione AVP-attivati ​​o è associata a malattie gravi. Diminuzione del riassorbimento di acqua causata da mutazioni di V2R o AQP2 porta a diabete insipido nefrogenico, mentre un elevated livello di AVP plasma sanguigno è associato a un eccessivo riassorbimento di acqua a malattie cardiovascolari come l'insufficienza cardiaca cronica e la sindrome da inappropriata secrezione di ormone antidiuretico (SIADH).

Il significato di riassorbimento dell'acqua AVP-mediata deriva non solo dalla sua implicazione nella malattia. La traslocazione AVP-indotta di vescicole AQP2-cuscinetto a e la fusione con la membrana plasmatica rappresenta un processo di esocitosi strettamente cAMP-dipendente, che attualmente non è ben compreso. Altri esempi per una esocitosi cAMP-dipendente sono secrezione di renina nel rene e H ⁺ secrezione nello stomaco. Pertanto, delucidazione dei meccanismi molecolari che regolano la traslocazione-AQP2 in cellule renali principali non solo aiuta a comprendere i processi molecolari simili in altri tipi cellulari, ma può anche aprire la strada a nuove terapie per il trattamento di malattie associate a disturbi del riassorbimento dell'acqua AVP-mediata .

Elucidating meccanismi AQP2 controllo richiede la raccolta modelli di cellule principali del dotto. Per questo un certo numero di differenti linee cellulari di rene di mammifero sono disponibili. Tuttavia, questi modelli hanno diversi inconvenienti. In molti sistemi di celle a livello della proteina di AQP2 è basso (Tabella 1; M1, HEK293, COS-7, MDCK, LLC-PK1) ^1-10, altri ectopicamente iperesprimono umani (MCD4, WT10) ^11,12 o ratto (CD8) ¹³ AQP2. In MCD4 e cellule COS-7 il recettore V2 non viene espresso. A nostra conoscenza non vi è alcuna linea cellulare permanente come un modello disponibile, che è derivato dal renale midollare interna dotto collettore, la parte del rene AQP2 cui espressione è più abbondante, ma dal dotto collettore corticale ^1,11,13-16 . Tali modelli cellulari sono per esempio il diffuso immortalato i mTERT-CCD ¹⁴ linee cellulari di recente istituzione mpkCCD (ad esempio ¹⁷⁾ o. Entrambe le linee cellulari esprimono endogenamente AQP2 e V2R, ma dal momento che sono derivati ​​daldotto collettore corticale molto probabilmente contiene un proteoma diverso rispetto a midollare interna dotto collettore (IMCD) cellule. Devono per esempio esprimere diversa Na ⁺ sistemi di trasporto.

Qui vi presentiamo un protocollo per colture primarie cellule IMCD esprimono V2R e AQP2 endogeno. Questo modello, quindi, rappresenta più fedelmente la situazione fisiologica nel dotto collettore renale. Come istituisce la cultura richiede solo normali attrezzature di laboratorio altri laboratori possono facilmente adottare questo approccio.

1. Preparazione

1. Preparare i piatti della cultura
   1. Disgelo collagene tipo IV O / N a 4 ° C e sciogliere in 0,1% di acido acetico sterile. Il volume da utilizzare dipende dal tipo e dal numero di piatti in cui le cellule devono essere seminato. Usare 2 ug / cm ^2.
   2. Incubare piatti almeno per 1 ora a RT e lavare due volte con acqua distillata (A. tridest).
   3. Lasciare i piatti ad asciugare correttamente.
2. La supplementazione di medie
   1. Aumentare il livello di glucosio fino a 4,5 g / L aggiungendo 1,75 g di glucosio a 500 ml di terreno. Per regolare il mezzo a 600 mosmol, aggiungere 100 mM NaCl 100 mM e urea, per aumentare l'osmolarità da 200 mosmol e 100 mosmol, rispettivamente.
   2. Aggiungere 1% di acidi non essenziali aminoacidi, 1% ultroser, 500 pM dbcAMP, 20 U / ml nistatina e 0,25 mcg / ml gentamicina (diluizione 1:200 di soluzione madre con una concentrazione di 50 ug / ml) a 600 mosmol mezzo DMEM fresco il giorno della preparazione.
3. Soluzione enzimatica
   1. Aggiungere 1 mg / ml di ialuronidasi e 2,2 mg / ml di collagenasi di DPBS-contenente 0,25 mg / ml di gentamicina e nistatina. Preparare 1 ml di questa soluzione di enzimi per la digestione di 2 rene midollare interna. La soluzione deve essere sterilizzata per filtrazione ed è memorizzato in 50 ml provette Falcon.

2. La coltivazione di primaria Rat midollare interna dotto collettore (IMCD) Cells

Tutte le procedure di movimentazione animali devono essere effettuati in conformità con la legislazione locale e federale.

1. Anestetizzare topi in CO ₂ (in una scatola saturo di CO ₂₎ o isoflurano (U-400 Anestesia unità, Univentor Ltd., Malta, il flusso d'aria 350-400 ml / min con 2-2.5% isoflurano). Decapitare gli animali per i sanguinamenti che consente il rilevamento esatto del confine tra il biancastro interiore e la midollare esterna più scura. Inoltre, il sanguinamento minimizza il numero di eritrociti isolati. Rimuovere i reni elavarli in DPBS sterile addizionato con gentamicina e nistatina (vedi sopra) in ghiaccio. Gli ulteriori passi devono essere effettuate in condizioni sterili banco pulito.
2. Trasferire i reni dalla soluzione DPBS su una compressa sterile per rimuovere il liquido in eccesso. Rimuovere la capsula renale grasso con pinze e forbici sterili.
3. Avendo il rene ancora risolto nel comprimere, taglio leggermente vicino all'asse longitudinale del (corticale) lato esterno. Assicurarsi di non tagliare completamente, ma di lasciarla in un unico pezzo, collegato nella pelvi renale.
4. Con forbici curve con attenzione sezionare la midollare interna biancastra, che sono circondati dal luccicante midollare esterna rosato. Li Raccogliere in DPBS, contenente gentamicina e nistatina in una capsula di Petri 60 millimetri sul ghiaccio.
5. Una volta che tutti midollare sono isolati e raccolti su ghiaccio, ridurre il volume di DPBS ad un livello in cui essi sono solo coperti con tampone. Utilizzare una lametta sterile per tagliare la midollare a cubetti di 5³ mm.
6. Fondere e arrotondare la punta di una pipetta Pasteur sterile tenendolo per breve tempo in una fiamma. Assicurarsi che la pipetta viene raffreddata prima di continuare.
7. Trasferire la sospensione dei tessuti per i 50 ml provette Falcon contenenti preparati al momento soluzione enzimatica sterile con ialuronidasi e collagenasi (vedi 1.3.1) utilizzando il arrotondata pipetta Pasteur. Chiudere il coperchio e incubare a 37 ° C sotto continua agitazione (220 rpm) a bagnomaria tavolo regolare per 1,5 - 2 ore.
8. Per triturazione della sospensione, la miscela pipettare su e giù diverse volte al tondo pipetta Pasteur (vedere sopra) finché la sospensione diventa torbida omogenea.
9. Centrifugare la sospensione per 5 minuti a 300 xg e 16 ° C. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet a fondo in DPBS, contenente gentamicina e nistatina e centrifugare di nuovo. Ripetere questa fase di lavaggio una volta.
10. Risospendere le cellule in terreno completamente integrato e loro seme in cpiatti ultura e / o piastre e micro-titolazione. La preparazione di 2 midollare (1 animali) produce cellule sufficiente per un 60 millimetri piatto di coltura.
11. Dopo 24 ore, lavare le cellule due volte con 600 mosmol DMEM e aggiungere mezzo fresco. Durante la settimana successiva le cellule devono essere lavati 2-3 volte (Figura 1). 6-8 giorni dopo la semina, le cellule IMCD possono essere usate per esperimenti. Ricordate di incubare loro in mezzo senza dbcAMP e nistatina per 24 ore prima di iniziare l'esperimento. Altrimenti AQP2 sarà situato esclusivamente nella membrana plasmatica.

La coltivazione di successo di cellule IMCD primari di ratto si tradurrà in un monostrato confluente 6-8 giorni dopo la semina (Figura 2). A 60 millimetri piatto di coltura sono circa 6 x 10 ⁶ cellule. Le cellule strettamente aderire alle piastre di coltura, in quanto questi sono stati rivestiti con collagene di tipo IV, un componente membrana basale ^18. Pertanto, le cellule IMCD non staccarsi nemmeno durante le diverse procedure di lavaggio accurato. Fino al 80% delle cellule in coltura esprimono V2R endogeno e AQP2. Queste sono le cellule principali, mentre le cellule mancanti AQP2 sono considerate cellule intercalate, cellule non-IMCD derivate da arti sottili di Henle, vasa recta o cellule interstiziali midollari interiori. Come abbiamo precedentemente indicato, l'osmolarità media di 600 mosmol impedisce down-regolazione di AQP2 ^19. Inoltre, l'espressione AQP2 è mantenuto dalla completa il mezzo con il cAMP membrana permeabile analogico dbcAMP. Per ridurre il AQP2 plasma membespressione rane e quindi di favorirne la localizzazione intracellulare delle cellule IMCD dovrebbero essere tenuti senza dbcAMP circa 24 ore prima di esperimenti. Se il grosso della AQP2 è localizzata nella membrana plasmatica in condizioni di controllo, il tempo di coltivazione dbcAMP-libero dovrebbe essere prolungato. Lisi delle cellule coltivate in 60 millimetri capsule di Petri in tamponi standard produce 1,5 mg di proteina ^10.

Su stimolo a breve termine (30 min) con AVP o forskolina, un attivatore diretto di ciclasi, AQP2 trasloca da vescicole intracellulari alla membrana plasmatica (Figura 2). Inoltre, AQP2 espressione in cellule IMCD aumenta sopra un min sfida 30 con AVP o forskolina (Figura 3) ^10. L'aumento di AQP2 abbondanza è indipendente migliorata trascrizione e traduzione. Forskolina o stimolazione AVP determina l'inibizione di p38-mitogeno-activated-protein-chinasi (p38-MAPK), che è associato con una diminuzione del livello di phosphorylation a serina 261 di AQP2 e una riduzione della sua poli-ubiquitinazione. Pertanto, l'aumento di AQP2 abbondanza dopo stimolazione è attribuito alla diminuita degradazione del proteasoma ^10. Nel loro insieme, le cellule IMCD permettono di indagare i meccanismi che controllano AQP2.

Tabella 1. Mammiferi linee cellulari renali per studi di AQP2 meccanismi di controllo. Cellule CAKI, mpkCCD e mTERT-CCD esprimono AQP2 endogeno. In COS-7, HEK293, LLC-PK1, M1 e linee cellulari MDCK, AQP2 è difficilmente rilevabile. CD8, MCD4 e WT10 cellule iperespressione AQP2 ectopica.

Figura 1. Rappresentazione schematica della procedura per la creazione di colture cellulari IMCD. Indicati sono l'ordine dei passaggi sperimentali ed i giorni della settimana preferito per gli esperimenti. Cellule IMCD primari di ratto vengono seminate il giorno 0 e 1 settimana dopo vengono utilizzati per gli esperimenti. I numeri tra parentesi si riferiscono alle rispettive fasi sperimentali descritte sotto la voce "Protocollo".

Figura 2. AQP2 inserisce nella membrana plasmatica dopo stimolazione con forskolina o AVP. IMCD cellule sono state lasciate in condizioni di controllo o sia stimolate con 100 nM AVP o 10 pM forskolina per 30 min a 37 ° C. Le cellule sono state analizzate tramite microscopia a immunofluorescenza described prima (LSM 710; Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germania) ^10. I nuclei sono stati visualizzati con DAPI, AQP2 è stato rilevato con un anticorpo misura (rosso; anticorpo H27) ^20,21. Pannello superiore, scansioni xy; pannello inferiore, scansioni xz. Barre di scala, 20 micron.

Figura 3. AQP2 proteiche abbondanza aumenta dopo stimolazione con vasopressina (AVP) e forskolina. Cellule IMCD stati lasciati non trattati (UTR) o sia stimolate con 100 nM AVP (A) o 10 pM forskolina (F) per 30 min a 37 ° C. Le cellule sono state lisate e complesso glicosilata (AQP2 cg), alta mannosio (AQP2 hm) e non AQP2 glicosilata (AQP2 ng) è stato rilevato da immunoblot utilizzando anticorpi specifici contro AQP2 (sc-9882, SantaCruz) come descritto in precedenza ^10. Come controllo di caricamento è stato rilevato α-tubulina (CP06, Calbiochem). Mostrato è un risultato rappresentativo da> 3 experiments. Pesi molecolari sono indicati (kDa).

Vi presentiamo un protocollo dettagliato per la preparazione e la coltura di cellule IMCD primari di ratto. L'approccio produce fino a 21 cm ² di cellule da un ratto ^20. L'esperimento richiede apparecchiatura standard coltura cellulare e può essere effettuata da una sola persona entro circa 6 ore. Pertanto, questo approccio è adatto come metodo di laboratorio standard.

Cellule IMCD primari di ratto possono essere seminate in piastre di coltura di diverse dimensioni, che vanno da 96 pozzetti per 60 millimetri piatti. Tuttavia, per la crescita in formato ben 384 la procedura richiede l'ottimizzazione. Evitiamo di utilizzare stoviglie superiore a 60 mm come la crescita rallentata. Le cellule sono adatti per una varietà di esperimenti come Western blotting, immunoprecipitazione, DNA / RNA isolamento, immunofluorescenza, Ca ^{2 +} imaging e elettrofisiologia ^10,22,23.

Circa 6-8 giorni dopo la semina, le cellule IMCD primari sono cresciuti ad un conflmonostrato confluente (Figura 2). L'altezza della cella è di 3 - 5 micron in media ^24, e le cellule sono strettamente collegati e mantenere un elevato livello di espressione endogena AQP2. Immunofluorescenza rilevazione microscopica di AQP2 indica che fino al 80% delle cellule rappresentano cellule principali AQP2-positive (figura 3; ^10,20). Morfologicamente le cellule sono caratterizzate da lunghi bordi rettilinei celle, un nucleo integrato nel citoplasma da uno a tre, e diversi nucleoli prominenti granuli citoplasmatici ^20. L'identità del restante 20% di cellule AQP2-negativi nella cultura non è stata definita in modo inequivocabile. Maric et al. Effettuata microscopia a contrasto di fase e analisi al microscopio di immunofluorescenza di giunzioni strette di visualizzare i bordi delle celle ^20. Nelle cellule AQP2-negativi hanno osservato i bordi delle celle curvi con rientranze e invaginazioni alle loro cellule vicine e un nucleo che sporge con uno nucleolo. Basdisponibile in questa morfologia che è distinta da quella delle cellule AQP2-positive, Maric et al. suggeriva che la maggioranza delle cellule AQP2-negativi sono intercalati cellule. Inoltre, la coltura contiene apparentemente pochi fibroblasti ^20. Diventano evidenti solo se le colture sono coltivate per più di 10 giorni in cui queste cellule iniziano overgrowing principali cellule. Sotto la nostra condizione di coltura di fibroblasti non visualizzare un tipico aspetto dei fibroblasti. In linea, Gonzalzez et al. Trovato cellule interstiziali in simili colture primarie di cellule IMCD 5-8 giorni dopo la semina ^25.

Colture cellulari primarie IMCD preparati in modi leggermente diversi, ma che possiedono proprietà simili, come quelli sopra descritti sono utilizzati in altri laboratori. Per esempio, Chou et al. Seme cellule primarie IMCD su superfici di plastica che non sono rivestite di collagene ^26. Le cellule IMCD primarie preparate secondo entrambi i protocolli sembrano di analogo di alta qualitàcome per esempio entrambi sono adatti per Ca ^{2 +} intracellulare misurazioni ^22,23,26. Liste complete di mRNA e proteine ​​espresse nelle cellule IMCD primari sono stati ottenuti da profilatura trascrizionale utilizzando la tecnologia Affimetrix ²⁷ e spettrometria di massa proteoma analisi ²⁸ (vedi anche http://dir.nhlbi.nih.gov/papers/lkem/imcd ).

Limitazioni di cellule IMCD primarie, come per molte pile, comprendono il tasso di trasfezione bassa (≈ 1% ^29). Così sovraespressione delle proteine ​​è quasi possibile solo se i plasmidi codifica o delle proteine ​​stesse sono microiniettati (esempio ^30). Un'ulteriore limitazione è la mancanza di una corretta polarità cellulare delle cellule IMCD primarie. In risposta a AVP, AQP2 trasloca prevalentemente nella membrana plasmatica basolaterale (Figura 2). Le nostre prove per indurre la polarità, cioè per indurre traslocazione di AQP2 alla membrana plasmatica apicale, facendo crescere le cellule in vari filtri non hanno ancora avuto successo,.

Nel loro insieme, le cellule IMCD primarie, stabilite come sopra descritto, possiedono i macchinari per il controllo di AQP2 e sono quindi un modello adatto per studiare AQP2 regolamento. Tuttavia, il loro uso richiede animali e dovrebbe pertanto essere limitato agli esperimenti che non possono essere effettuate in altri sistemi modello stabiliti (vedi sopra) e per la validazione dei risultati che sono stati ottenuti in altri sistemi modello.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; KL KL 1415/3-2 e 1415/4-2).

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Enno Klussmann

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Enno Klussman