Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür

Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını kolaylaştırır In vitro Göç, kendini yenileme ve nöral krest multipotency çalışmak için yöntemler.

Embriyonik nöral krest (NC), nöral tüpün dorsalinde kaynaklanan multipotent progenitör nüfusu mezenkimal geçiş (EMT) bir epitel uğrar ve farklı hücre tipleri ^1-3 sebebiyet veren, embriyo boyunca göç eder. NC de hedef organlar ^4-6 farklılaşması ve olgunlaşması etkilemek için eşsiz bir yeteneği vardır. In vitro eksplante zaman, NC ataları kendini yenileme geçmesi, göç ve nöronlar, glia, düz kas hücreleri, kıkırdak ve kemik dokusu da dahil olmak üzere değişik türde farklılaşırlar.

NC multipotency ilk. Kuş nöral tüp ^7-9 eksplant tanımlanmıştır NK hücrelerinin in vitro izolasyonunda proliferasyon, göç ve multipotency dahil NC dinamikleri çalışmaya kolaylaştırır edildi. Kuş ve sıçan sistemlerinde daha fazla çalışmalar embriyo ¹⁰ geri nakledilen zaman eksplante NK hücreleri, NK potansiyelini korumak olduğunu göstermiştir-13. Bu doğal hücresel özellikleri eksplante NC ataları korunur Çünkü nöral tüp eksplant testi in vitro NC eğitim için cazip bir seçenek sunar.

Memeli NC daha iyi anlaşılmasını sağlamak amacıyla, birçok yöntem NC nüfus yalıtmak için istihdam edilmiştir. NC kökenli ataları sonrası göçmen NC progenitörlerin ^11,14-20 dinamiklerini incelemek için embriyo ve yetişkin hem de post-göçmen konumları kültüre edilebilir, ancak bunlar nöral tüp göç gibi NC progenitörlerin izolasyon optimum muhafaza sağlar NC potansiyeli hücre ve göçmen özellikleri ^13,21,22. Bazı protokoller, özellikle ataları ^11,13,14,17 için zenginleştirilmiş bir NC nüfusu izole etmeye fluorescence activated cell sorting (FACS) kullanır. Ancak, erken evre embriyo ile başlatırken, analizler için yeterli hücre sayıları erken NC alan nüfus izolasyonu karmaşıklaştıran, FACS ile elde etmek zorbireysel embriyolardan ns. Burada, bir Wnt1-Cre aktive soy muhabiri ²³ dayanan yaklaşık% 96 oranında saf NC nüfus FACS ve sonuçları dayanmayan bir yaklaşım açıklanmaktadır.

Burada sunulan yöntemi sıçan NC ^11,13 kültürü için optimize protokolleri uyarlanmıştır. Bu protokol daha önceki yöntemlere göre avantajları 1) hücre FACS)) göreceli olarak saf NC nüfusu, 3 elde etmek için gerekli değildir premigratory NC hücreleri izole edilir ve 4), bir besleyici tabakası, 2 yetiştirilen değildir sonuçlar kolayca olmalarıdır sayılabilir. Bundan başka, bu protokolü farklı genetik manipülasyon ile NC özelliklerinin çalışma kolaylaştırıcı, herhangi bir mutant fare modelinde gelen NC izole edilmesi için kullanılabilir. Bu yaklaşımın sınırlaması NC NC ^2,24-28 hayatta kalması, göç ve farklılaşmayı etkileyen bilinmektedir embriyo bağlamında kaldırılır olmasıdır.

1. Hazırlanması Tabaklar

1. Her zaman steril tekniği kullanın.
2. Dulbecco PBS (DPBS) içerisinde 3.3 mL 'lik bir son hacim içine insan plazmasından FN stoğu 100 uL seyreltilmesiyle fibronektin (FN) hazırlayın. Nihai konsantrasyon 30 ug / mL 'dir ve bu 1 hafta süreyle 4 ° C'de saklanabilir.
3. FN çözümü ile steril doku kültürü dört sıra plakanın her alt örtün ve 15 dakika bekletin. Tüm yüzeyi kaplı olduğundan emin olun. Bu kez (2. ve 3. adımları) sırasında ortam olun.
4. Çözüm FN ve plakaları kurumasını bekleyin çıkarın. Yavaşça 500 uL DMEM, kaldır DMEM ile kuyu durulayın, ve Öz-Yenileme 500 uL (SR), orta (aşağıya bakınız) ekleyin. _CO2 5 oranında içeren nemlendirilmiş inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edilir. Plakalar kullanımdan önce kuru olacak şekilde Diseksiyon önce yaklaşık bir saat tamamlar.

2. SR Orta hazırlanması

1. Vagal ve gövde NC kültürü içinon embriyolar (yaklaşık bir kumu, fare hattı genetik arka plan bağlı olarak), SR orta 25 mL hazırlamak. 12,5 mL, düşük glukoz DMEM, 7.5 mL Neurobasal Orta, 25 uL retinoik asit (117 uM son konsantrasyon) ve 25 ul 2-mercaptoethanol (50 mM nihai konsantrasyon) birleştirir. İyice karıştırın.
2. 3.75 ml Civciv Embriyo Özü, 250 uL N ₂ tuz takviyesi, 500 uL B27 takviyesi ve 250 uL penisilin streptomisin (% 1 final konsantrasyon) ekleyin. 0.22 um bir filtreden orta filtre.
3. 10 uL steril IGF1 (20 ug / mL son konsantrasyon) ve 20 ul steril bFGF (20 ug / mL son konsantrasyon) eklenir. Tersine çevirerek karıştırın. 4 ° C'de depolamak

3. Yıkama Orta hazırlanması

1. Için yaklaşık 10 embriyo yıkama orta 50 ml hazırlamak. 35 mL düşük glikoz DMEM, 15 mL Neurobasal Orta ve 500 uL penisilin streptomisin (% 1 final konsantrasyon) ile 50 mg BSA birleştirin. 0.22 ile Steril filtremikron filtre.

4. Kollajenaz / dispase hazırlanması

1. 100 mg / mL kollajenaz / dispase için 5 mL DPBS 50 uL ekleyin. İyice karıştırın.
2. 0.2 um bir şırınga ile filtre on iki iyi plaka üç kuyu her birine 1.5 mL filtre ve ekleyin. Kalan kuyulara pipetle yaklaşık 1 ml yıkama ortamı. Disseke doku sindirmek için hazır olana kadar buz üzerinde tüm plaka saklayın.
3. Steril bir jilet ile P20 ve P1000 pipet filtre ucu ipuçları kesin. Sadece ucu eğimli kenar aşağıda kesin. P1000 cut off P20 izole doku parçalarını aktarmak için kullanılacak ise tüm embriyo transfer etmek için kullanılacaktır.

5.. 9.5 DPC Embriyolar gelen vagal ve Trunk Nöral Tüp Ayırma

1. Zamanlanmış gebelikler için, vajinal fişi ile baraj sabah fişi görülmektedir öğle saatlerinde 0.5 DPC kabul edilir. 9.5 DPC de rahim kurban ve kaldırın.
2. Uterustan desidua kaldırın ve yavaşça rdesidua gelen embriyo aldır. Sonra bu protokol ile deneyimli, steril DPBS bir defada 3-4 9.5 DPC embriyo izole. Steril teknik ve sterilize diseksiyon aletler kullanın. Instruments otoklav, ısı sterilizasyon veya etanol içinde inkübasyonu ile sterilize edilebilir.
3. Anterior vagal NC için: insülin iğneleri kullanarak, orta kulak taslakları da nöral tüp kesti. ^4. hücre gruplarının arka kenarı tekrar kesin. Faringeal kemerler ve kalp kaldırmak için nöral tüp ventral doku kesin.
4. Gövde NC için: insülin iğneleri kullanılarak, hücre grubu 16-22 (ya da embriyo önceki 22 hücre gruplarının sahne daha gelişimsel olarak ise son hücre gruplarının) arasındaki nöral tüp kısmını kaldırın.
5. Yolk kesesi ve genotiplendirme için kalan embriyonik doku tutun.

6. Sigara nöral Ektoderm ve Mezodermin Kaldırma

1. 10 dakika için oda sıcaklığında kollajenaz / dispase içine bölümleri içeren sinirsel tüp yeris. Hemen yıkama ortamda yıkayın.
2. Steril DPBS doku dönün. Steril insülin iğneleri kullanarak, yavaşça dokusundan olmayan nöral ektoderm kaldırmak ve uzak nöral tüp Somitlerin ayırın. Hücre gruplarının doku mezodermin son kalan parçaları bir cut-down P20 ucu ile hafifçe triturating tarafından kaldırılabilir. Nöral tüp zarar için dikkatli olun. Öğütme sırasında yakından gözlemleyin.
3. Yıkama orta bir ikinci ve üçüncü 30 saniye yıkama yoluyla izole sinir yerleştirilir.
4. SR orta bir kez yıkayın ve (Adım 1.3) daha önce hazırlanan bir FN kaplı kuyunun merkezi haline izole nöral tüp yerleştirin. Steril su bir tabak ile hipoksi odası Nemlendirme. Hipoksi odasına çanak yerleştirin ve% 3 O ₂ (1% karışımı O _2,% 6 CO _2,% 93 N ₂ içeren bir tank kullanmak) karışık gaz odası yıkayın.
5. Daima tha sağlamak için son derece dikkatli odası elet eksplantları rahatsız olan ve kuyularının merkezi kalır.
6. 37 ° C'de inkübe Adımları 5-6 Özeti Şekil 1 'de gösterilmiştir.

7. Nöral Tüp çıkarılması

1. Inkübasyondan 24 saat sonra, nazikçe uzak steril bir insülin iğnesi kullanarak göç eden hücrelerin nöral tüpün kenarına alay tarafından nöral tüp kaldırın. Çıkarın ve adım 6.2 gibi steril bir P20 kesim kullanarak ortamdan nöral tüp atmak ve taze SR orta (Şekil 2) ile orta yerine. Bu en kolay ters bir mikroskop kullanılarak yapılır.

8. Temsilcisi Sonuçlar

Hipoksik koşullarda ° C, NK hücreleri neredeyse saf nüfus (Şekil 3a) nöral tüp uzak göç etmiş 37 inkübasyondan 24 saat sonra. Bazen, ideal kültürler daha az güçlü çıkıntılar vermeyecektir. Örneğin, bu, 24 saat sonra t mümkündürdiye nöral tüp kendi üzerine kıvrılmış olacak ve NC nöral tüp (Şekil 3b) uzağa göç olmaz. Bazen nöral tüp fibronektin kaplı plakaları takmak değil.

Bizim deneyimlerimize göre, sub-optimal NC göç ya da nöral tüp eki ile ilgili sorunlar olumsuz sırasıyla normoksi koşulları veya fibronektin konsantrasyonu etkilenebilir. Kollajenaz / dispase Enzimatik aktivite toplu ve sindirim zaman biraz değişir uygun şekilde ayarlanması gerekir, ancak on beş dakika daha uzun doku sindirmek değil. Kollajenaz / dispase doku içeren sinirsel tüpün Overdigestion da eksik çıkıntılar ile sonuçlanacaktır. Hücre gruplarının doku kolayca kollajenaz / dispase inkübe edildikten sonra nöral tüp kaldırılmaz ise, nöral tüp on dakika daha uzun süre inkübe edilebilir. Bazen nöral tüp substrat eklemek olmayacak. Bu durumda, fibronec çift kontrolkalay konsantrasyonu ve hipoksi koşulları.

Normoksik koşullar kültürü vahşi tip NC için kullanılabilmesine rağmen, hipoksik koşulları daha yakından in vivo ortamda ^29,30 in taklit edebilirler. Deneyimlerimize göre, hipoksik koşullarda zaman kültür mutant NC kritik hale geldi. Örneğin, Foxd3 mutant NC normoksik koşullar kültive edildiğinde, gövde NC kontroller ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalır hücre outgrowth sahipti. Eksplantları hipoksik koşullar (Şekil 4) kültive edildiğinde, outgrowth boyutunda bu farkı çıkarıldı. Ayrıca, yabani tip nöral tüp eksplantları normoksi kültüre edildiğinde, kaspaz-pozitif hücre sayısı (veriler gösterilmemiştir) hipoksi kültüre benzer eksplantlarının o zaman daha büyüktü. Hipoksi tüm NC kültürünü koruyarak, karşılaştırmaları daha kolay kontrol dinamikleri ve mutant kültürler arasında yapılabilir.

Şekil 1. NC izolasyon Genel şematik. A) embriyodan ilgi bölgeleri parçalara ayır. B) kollajenaz / on dakika (on beş dakikayı aşmayan) için dispase nöral tüp Digest. C) yıkama ortamda yıkayın. D) non-nöral ektoderm ve mezoderm uzak parçalara ayır. EF) yıkama ortamda iki kez yıkayın. Kendini yenileme ortamda G) Levha. % 3 O ₂ hipoksik koşullarda 37 ° C'de inkübe edilir.

Şekil 2. Eksplant gelen nöral tüp adımsal kaldırılması. Nöral tüp olmayan NC hücreleri ile kirlenmesini önlemek için 24-48 saat sonra uzaklaştırılmalıdır. A) nöral tüp ve NC akıbet (düz çizgi) arasındaki sınır dikkat edin. B) bir insülin iğnesi ile nöral tüpün kenarı boyunca kesin. C) nöral tüp atın ve taze kendini yenileme orta ile orta yerine. Kesikli çizgi outgrowth kapsamını göstermektedir. Kısaltma: NT, nöral tüp.

Şekil 3. Temsilcisi sonuçları örnekleri. Hipoksik koşullarda kendinden yenilenmesi ortam içinde 24 saat inkübasyondan sonra A) Tipik eksplant outgrowth (tireli çizgi) outgrowth kapsamını göstermektedir. B) kültüründe 48 saat sonra NC akıbet açısından Büyütülmüş. Düşük outgrowth verim C) Daha az ideal bir kültür. A ve C, aynı koşullar altında kültüre edildi. Görüntüler kültür sağlamlık doğal geniş olduğunu gösterir. Bu kollajenaz / dispase sindirimler nöral tüp izolasyon, FN konsantrasyonu, hipoksik koşullarda ve zaman verimliliği etkilenebilir.

Şekil 4. Normoksi karşı hipoksi NC eksplant kültürlerinde in vitro inceleme. Normoksik kültür koşullarında 48 saat sonra nöral tüp eksplantları göç Kontrolü (yabani tip) NK hücreleri. Buna karşılık, mutant Foxd3NC büyük normoksi hücre çıkıntılar (NC çıkıntılar kırmızı hatlarını işareti kenarları) azalmıştı. Karşılaştırılabilir eksplantlarında hipoksik koşullarda yetiştirilen alındığında, Foxd3 mutant NC eksplantları sonraki analizlerde izin kontrollerine nispeten büyüdü. Not Bu davranış, in vivo Foxd3 mutant NC davranışı ile ilişkili olduğu bulunmuştur.

Dikkat dikkat bu yaklaşımın başarısı için embriyonun gelişim aşamasında dikkat edilmelidir. Erken fare embriyo Somitlerin sayan bir çöp içinde embriyo eşleme ve izolasyon için nöral tüpün doğru bölgelerin belirlenmesinde aşaması için hem kritik önem taşımaktadır. Embriyo arasındaki bir ya da iki Somitlerin bir varyasyonu yapılan deney çözünürlüğü bağlı olarak, gelişim zamanlama makul bir aralığı içindedir. 9 ve 9.5 DPC arasında bir embriyo 17 ve 25 Somitlerin arasında olacaktır. Embriyo fazla 25 Somitlerin varsa, NC daha gelişimsel zaman gelişmiştir, ve NC çıkıntılar kültüründe daha az sağlam olacaktır. Embriyo ve bu nedenle NC, gelişim aşamasında deneylerin sonucunu etkilemeye zaman hücre gruplarının sayısına bağlı olarak embriyo Sahneleme deneylerde hassas kolaylaştırır. 9,5 DPC embriyo olarak, vagal NC tanımlanan ön-arka sınırlar içinde dorsal nöral tüp göç ediyor: orta kulak taslakları gelen hücre gruplarının 7.Benzer şekilde, gövde NC 24 hücre gruplarının seviyeleri hücre gruplarının 8 de nöral tüp göç ediyor. Bu protokolde belirtilen NC progenitörlerin farklı toplumlarda izole etmek için, bu etki her birimizin içinde alt bölgeler ayrık izole edilmiştir. Kullanılan nöral tüpün bölgenin deney tasarımı ve çalışılan NC ön-arka bölgeye bağlı olarak değişiklik gösterir.

Kültürü koşulları, orta ve inkübasyon koşullar, özellikle fare NC Kültür için adapte edilmiştir dahil olmak üzere, yukarıda tarif. Benzer SR ortamda anılan birinci sıçan NC ¹¹ kültürü için kullanılmıştır. Bizim ellerde, Neurobasal Orta ilavesi ile bu sıçan orta, fare NC progenitörlerin sağlam bir akıbet üretir. Ayrıca, önceki çalışma kültürü kuş NK hücrelerinin aksine besleyici bir tabaka bu yöntemi kullanarak ^11,13,21,22 memeli NC kültürü için gerekli değildir. Normoksik Conditi kuş ve memeli hem NC kültür detaylandıran birçok protokol varken ons ^9,22, biz ²³ (Şekil 4), alanında ²⁰ kişiyle birlikte, hipoksi daha yakından fizyolojik oksijen düzeyleri taklit muhtemelen çünkü gibi hipoksik koşullarda kültüre fare NK hücreleri, burada büyük yardımcıları hayatta kalma ve kendini yenileme tarif bulduk embriyo ^20,29,30 içinde.

Onkogenezinde ifadesi değerlendirilmesi büyük ölçüde NC hücreleri ve bunların türevleri farklılaşmış bulunması kolaylaşmaktadır. Bu Foxd3 ifadesi, p75, ve NC kök hücreler için Sox10 içerir. Farklılaştırılmış NC belirteçleri miyofibroblastlar için alfa düz kas aktin (SMA), melanosit için glia, mikroftalmi ilişkili transkripsiyon faktörü (MITF) için glial fibriller asidik protein (GFAP) ve beta-III tubulin, protein gen product 9.5 (PGP9.5 dahil nöronlar için) ve peripherin. Bu belirteçler NC progenitörlerin eksplant verimliliği ve farklılaşmasını belirlemek için kullanılabilir.

Sonuç olarak, fare embriyolardan NC hücreleri izole edilmesi için, bu yöntem FACS kullanılmadan premigratory NC hücrelerin bir besleyici yapışık serbest kültürü üretir. Bu hücrelerin kullanıldığı deneylerde analizi kolaylıkla belirlenebilir. Bu teknik basit iken, göç, kendini yenileme ve farklılaşma NC özellikleri çalışma için uygulamaları sınırsız. Dahası, genetik olarak modifiye edilmiş fare embriyolardan NC izole NC göç, hayatta kalma, ve / ya da farklılaşma bağlamında, özellikle gen ve yollarının doğrudan çalışma için olanak sağlar.

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Biz video yardım için Marc Wozniak kabul etmek istiyorum. Biz de kültür sıçan NK hücreleri için orijinal protokol için UT Southwestern az Sean Morrison kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Akademik Destek Programı desteklenen ve NIH (HD36720 ve HD036720-11S109) ve PAL için AHA 11GRNT7690040, NAM için AHA (0615209B) ve NIH (NS065604) den predoctoral burslar, ve ERP gelen hibelerle oldu Bir NIH eğitim bursu T32HD007502 tarafından desteklenmektedir.