Выделение и культуры клеток нервного гребня из эмбриональных мышей нервной трубки

Выделение эмбриональных нервного гребня из нервной трубки облегчает использование В пробирке Методы изучения миграции, самообновления и multipotency из нервного гребня.

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types ^1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs^4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone.

NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube^7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo^10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro.

To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors^11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties^13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors^11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter²³.

The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC^11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC^2,24-28.

1. Подготовка пластин

1. Использование стерильных во все времена.
2. Подготовить фибронектин (FN) путем разбавления 100 мкл плазмы человека запас FN в конечном объеме 3,3 мл в PBS Дульбекко (DPBS). Конечная концентрация 30 мкг / мл, и это можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1 недели.
3. Крышка нижней части каждой скважины стерильной культуры тканей четыре хорошо пластины с решением FN и оставьте на 15 минут. Убедитесь, что вся поверхность покрыта. Сделать средств массовой информации в течение этого времени (шаги 2 и 3).
4. Удалить НФ решения и позволяют пластины для просушки. Аккуратно промойте скважин с 500 мкл DMEM, удалить DMEM, и добавить 500 мкл самообновления (SR) среды (см. ниже). Инкубировать при температуре 37 ° C в увлажненном инкубаторе, содержащем 5 процентов CO _2. Заполните эту примерно за час до вскрытия, так что пластины будет сухой перед использованием.

2. Подготовка SR среднего

1. Для культуры и блуждающего ствола NCиз десяти эмбрионов (примерно один помет, в зависимости от генетического фона мыши линии), подготовить 25 мл средней SR. Комбинат 12,5 мл DMEM низкий уровень глюкозы, 7,5 мл Neurobasal Средний, 25 мкл ретиноевой кислотой (117 мкМ конечная концентрация) и 25 мкл 2-меркаптоэтанол (50 мМ конечной концентрации). Все хорошо перемешать.
2. Добавить 3,75 мл куриного эмбриона экстракта, 250 мкл N ₂ соль добавки, 500 мкл B27 дополнения и 250 мкл пенициллин-стрептомицина (1% конечной концентрации). Фильтр среду через 0,22 мкм фильтр.
3. Добавить 10 мкл стерильной IGF1 (20 мкг / мл, конечная концентрация) и 20 мкл стерильной bFGF (20 мкг / мл конечной концентрации). Смешайте обращением. Хранить при температуре 4 ° C.

3. Подготовка Wash среднего

1. Для примерно 10 эмбрионов подготовить 50 мл промывочного среды. Комбинат 50 мг BSA с 35 мл DMEM низкий уровень глюкозы, 15 мл Neurobasal средних и 500 мкл пенициллин-стрептомицина (1% конечной концентрации). Стерильные фильтры с 0,22мкм.

4. Подготовка коллагеназы / dispase

1. Добавить 50 мкл 100 мг / мл коллагеназы / dispase до 5 DPBS мл. Все хорошо перемешать.
2. Шприц с фильтром 0,2 мкм процедить и добавить 1,5 мл в каждом из трех скважин на двенадцать и пластины. Внесите примерно 1 мл мытья среды в оставшиеся лунки. Храните всю пластинку на льду, пока готовы переварить расчлененный ткани.
3. Отрежьте кончики p20 и P1000 пипетки фильтра кончик стерильным лезвием. Вырезать чуть ниже скошенный край наконечника. Отсечения P1000 будет использоваться для передачи всего эмбриона в то время как p20 будет использоваться для передачи части изолированных тканей.

5. Изоляция блуждающего нерва и магистральные нервной трубки от 9,5 эмбрионов ЦОД

1. Для приурочен беременности, плотин с вагинальным плагин считается 0,5 ЦОД в полдень утром плагина не наблюдается. Жертва и удаление матки 9,5 DPC.
2. Удалить децидуальной из матки и аккуратно талить эмбрион от децидуальной оболочки. Как только опыт работы с этим протоколом, изолировать 3-4 9,5 DPC эмбрионов в то время, в стерильных DPBS. Использование стерильных и стерилизовать инструменты вскрытия. Инструменты можно стерилизовать автоклавированием, тепловой стерилизации или инкубации в этаноле.
3. Для переднего блуждающего NC: с помощью инсулина, иглы, сократить нервной трубки в середине ушной плакоды. Вырезать снова у заднего края ^4-й сегмент. Обрежьте ткань брюшной части нервной трубки для удаления глотки арки и сердца.
4. Для магистральных NC: с помощью инсулина, иглы, удалите часть нервной трубки между сомитов 16-22 (или последний сегмент, если эмбрионы умственно раньше, чем 22 сомитов).
5. Держите желточного мешка и оставшиеся эмбриональной ткани для генотипирования.

6. Удаление без нейронных эктодермы и мезодермы

1. Поместите нервной трубки содержащие сегментов в коллагеназа / dispase при комнатной температуре в течение 10 минутс. Немедленно промыть в промывочной среды.
2. Вернуться к стерильной ткани DPBS. Используя стерильные иглы инсулин, аккуратно удалить не-нейронных эктодермы из ткани и отделить сомитов от нервной трубки. Последние оставшиеся части мезодермы из сомитов тканей можно удалить, слегка растирая помощью урезанной p20 чаевые. Будьте осторожны, чтобы не повредить нервную трубку. Соблюдать это близко во время растирания.
3. Поместите изолированной нервной трубки через второй и третьей 30-секундный мыть мыть среды.
4. Мыть раз в средней SR, и поместить изолированной нервной трубки в центре FN-покрытием и которая была подготовлена ​​ранее (шаг 1.3). Увлажняйте гипоксии камеру с блюдом стерильной водой. Поместите блюдо в камере гипоксии и очистить камеру с газовой смеси до 3% O ₂ (использовать резервуар, содержащий смесь 1% O _2, 6% CO _2, 93% N _2).
5. Обращайтесь с камерой очень тщательно, чтобы обеспечить Thaт эксплантов это спокойно и по-прежнему в центре скважины.
6. Инкубировать при температуре 37 ° C. Резюме шаги 5-6 показано на рисунке 1.

7. Удаление нервной трубки

1. После 24 часов инкубации удалить нервной трубки, слегка дразнить края нервной трубки от мигрирующих клеток с помощью стерильной иглы инсулин. Удаляют нервной трубки из среды с использованием стерильного сокращение p20, как в пункте 6.2 и замените носитель свежей средой SR (рис. 2). Проще всего это сделать с помощью инвертированного микроскопа.

8. Представитель Результаты

После 24 часов инкубации при 37 ° C в условиях гипоксии, NC клетки мигрировали от нервной трубки в почти чистый населения (рис. 3а). Иногда, далеки от идеальных культур не даст надежные наросты. Например, вполне возможно, что после 24 часов тОн нервная трубка будет свернувшись калачиком на себя и НК не будет мигрировать от нервной трубки (рис. 3б). Иногда нервная трубка не будет привязан к фибронектина покрытие пластин.

По нашему опыту, неоптимальной NC миграции и проблем с приложением нервной трубки могут оказать негативное воздействие на условия или нормоксии концентрации фибронектина, соответственно. Ферментативной активности коллагеназы / dispase немного отличается от партии и время переваривания должна быть скорректирована соответствующим образом, однако, не переваривать ткань дольше, чем пятнадцать минут. Overdigestion нервной трубки, содержащей ткани коллагеназы / dispase также приведет к недостаточной наросты. Если сегмент тканей не так легко удалены из нервной трубки после инкубации в коллагеназа / dispase, нервной трубки можно инкубировать в течение более десяти минут. Иногда нервная трубка не будет прикрепляться к субстрату. Если это так, проверьте fibronecконцентрация олова и условиях гипоксии.

Хотя гипоксическим условиям могут быть использованы для культуры дикого типа NC, условиях гипоксии более тесно имитировать в естественных условиях окружающей среды ^29,30. По нашему опыту, условиях гипоксии стала критической, когда культивирование мутант NC. Например, когда Foxd3 мутант NC культивировали в гипоксическим условиям, ствол NC была значительно уменьшена клетки результат по сравнению с контрольной группой. Эта разница в размере результат был удален, когда эксплантаты культивировали в условиях гипоксии (рис. 4). Кроме того, при дикого типа нейронных эксплантов трубки культивировали в нормоксии, количество каспазы-положительных клеток было больше чем у аналогичных эксплантатов культивировались в условиях гипоксии (данные не представлены). Поддерживая все культуры НК в условиях гипоксии, сравнения могут быть более легко между динамикой управления и мутантных культур.

Рисунок 1. В целом схема выделения НК. А) Проанализируйте регионах, представляющих интерес с эмбрионом. B) Дайджест нервной трубки у коллагеназы / dispase в течение десяти минут (не превышает пятнадцати минут). C) Промойте в промывочной среды. D) Проанализируйте от не-нейронных эктодермы и мезодермы. EF) промыть дважды в промывочной среды. G) в себя плиты средней обновления. Инкубировать при температуре 37 ° С в 3% O ₂ условиях гипоксии.

Рисунок 2. Поэтапное удаление нервной трубки из эксплантов. Нервной трубки должны быть удалены после 24-48 часов, чтобы предотвратить загрязнение с не-NC клеток. А) Обратите внимание, что границы между нервной трубки и результат NC (сплошная линия). Б) Разрежьте вдоль края нервной трубки с инсулиновой иглой. C) Откажитесь от нервной трубки и заменить среднего свежей средой обновления себя. Пунктирная линия показывает степень результат. Сокращенное наименование: NT, нервной трубки.

Рисунок 3. Примеры представитель результаты. А) Типичный результат эксплантов после 24 часов инкубации в себя средние обновления в условиях гипоксии (пунктирная линия показывает степень результат). Б) увеличенное изображение результатом NC после 48 часов в культуре. C) меньше идеального культуры с низкой доходностью результат. И C культивировали при тех же условиях. Изображения демонстрируют естественный ареал культуры надежности. Это может повлиять на эффективность нейронных изоляции труб, концентрации FN, условиях гипоксии, и время в коллагеназа / dispase пищеварения.

Рисунок 4. В лабораторных анализов НК эксплантов культур в нормоксии против гипоксии. Контроль (дикий тип) NC клетки мигрировали из нейронных эксплантов трубку после 48 часов в гипоксическим условиям культуры. В отличие от Foxd3 мутантNC резко снизить клетки выросты в нормоксии (красный контур знака краям выростов NC). При сопоставимых эксплантов были выращены в условиях гипоксии, Foxd3 мутант NC эксплантов выросли сравнительно с контрольной группой, что позволяет последующего анализа. Обратите внимание, что такое поведение хорошо коррелирует с поведением Foxd3 мутант НК в естественных условиях.

Особое внимание следует обратить на стадии развития эмбриона, чтобы обеспечить успех этого подхода. Подсчет сомитов ранних эмбрионов мыши имеет решающее значение как для стадии эмбриона в соответствие мусора и правильно определить регионы нервной трубки для изоляции. Изменение одного или двух сомитов между эмбрионов в разумных пределах развивающего времени, в зависимости от разрешения эксперимент. Эмбриона в возрасте от 9 до 9,5 ЦОД будут иметь от 17 до 25 сомитов. Если эмбрион имеет более чем 25 сомитов, НК еще более продвинулась в развитии времени и NC наросты будут менее надежными в сфере культуры. Постановка эмбрионы на основе сомитов число способствует точности экспериментов, когда стадия развития эмбриона и, следовательно, NC, может повлиять на исход эксперимента. В 9,5 эмбриона DPC, блуждающего NC мигрирует из спинной нервной трубки в определенных передне-задней пределах: от середины к слуховым плакоды сомитов 7.Кроме того, ствол NC мигрирует из нервной трубки на уровне сомитов 8 сомитов 24. Для выделения отдельных популяций предшественников НК, как указано в этом протоколе, дискретные суб-регионов в рамках каждого из этих доменов являются изолированными. Области нервной трубки использовались будет меняться в зависимости от конструкции эксперимента и передне-задней области NC изучается.

Культура условий, описанных выше, в том числе средних и условия инкубации, специально адаптированных к культуре мышиных NC. Подобные средней SR был впервые использован для культуры крысы NC ^11. В наших руках, это крыса среде с добавлением Neurobasal среднего, производит надежные результат мышей прародители ЧПУ. Кроме того, в отличие от предыдущих работ культивирования клеток птичьего NC, фидерного слоя не является необходимым для культуры млекопитающих NC с помощью этого метода ^11,13,21,22. Хотя существуют многочисленные протоколы подробным и птиц и млекопитающих NC культуры в нормоксических заболе дополнений ^9,22, то ²³ (рис. 4), наряду с другими в области ^20, обнаружил, что культивирования мышиных клеток НК в условиях гипоксии, как описано здесь значительно средства выживания и самообновления, предположительно, из-за гипоксии более точно имитирует физиологический уровень кислорода в зародыше ^20,29,30.

Оценка экспрессии молекулярных маркеров значительно облегчает идентификацию клеток НК и их дифференцированной производных. К ним относятся выражения Foxd3, p75 и Sox10 для клеток НК стебля. Маркеры дифференцированных NC включают гладкие мышцы альфа актина (SMA) для миофибробластов, глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) для глии, микрофтальмия связанного фактора транскрипции (MITF) для меланоцитов, а также бета-III тубулина, белка продукт гена 9,5 (PGP9.5 ), а peripherin для нейронов. Эти маркеры могут быть использованы для определения эффективности эксплантов и дифференцировку предшественников NC.

В заключение, этот метод выделения НК клеток из эмбрионов мыши производит подачи бесплатно приверженцем культуры клеток premigratory NC без использования СУИМ. Анализ экспериментов с использованием этих клеток может быть легко определена. Хотя эта техника очень проста, ее применение для изучения характеристик НК миграции, самообновления и дифференцировки великое множество. Кроме того, изоляция NC из генетически модифицированных эмбрионов мыши позволяет непосредственного изучения отдельных генов и путей в контексте НК миграции, выживание, и / или дифференциации.

Нам нечего раскрывать.

Мы хотели бы поблагодарить Марка Возняка для видео-помощь. Мы также хотели бы признать, Шон Моррисон в Техасском Университете в оригинальный протокол для культивирования клеток крысы NC. Работа выполнена при поддержке Университета Вандербильта Медицинского центра академической поддержки программ и грантов от NIH (HD36720 и HD036720-11S109) и АНА 11GRNT7690040 в PAL, predoctoral стипендии от AHA (0615209B) и NIH (NS065604), чтобы Движение неприсоединения, а также ERP было поддерживается обучение NIH грант T32HD007502.