בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את השימוש במבחנה שיטות לחקר ההגירה, התחדשות עצמית, ו multipotency של הרכס העצבי.

עובריים עצביים לפסגה (NC) היא האוכלוסייה אבי multipotent שמקורו ב היבט הגב של הצינור העצבי, עובר אפיתל המעבר mesenchymal (EMT) ו נודד ברחבי העובר, והוליד סוגי תאים שונים ^1-3. NC גם יש את היכולת הייחודית להשפיע על התמיינות והתבגרות של אברי המטרה ^4-6. כאשר explanted במבחנה, אבות צפון קרוליינה לעבור עצמית והתחדשות, להעביר להתמיין למגוון של סוגי רקמות כולל נוירונים, גליה, תאים שריר חלק, סחוס ועצמות.

Multipotency NC תוארה לראשונה מ explants של הצינור העצבי העופות ^7-9. בבידוד מבחנה של תאים צפון קרוליינה מאפשר לימוד NC Dynamics כולל התפשטות, הגירה, ו multipotency. עבודה נוספת במערכות העופות ואת העכברים הראו כי explanted תאים צפון קרוליינה NC לשמור על הפוטנציאל שלהם כאשר מושתלים בחזרה העובר ¹⁰-13. בגלל מאפיינים אלה הסלולר הטמונות נשמרים explanted אבות צפון קרוליינה, assay עצבית explant הצינור מספק אופציה אטרקטיבית ללימוד NC במבחנה.

כדי להשיג הבנה טובה יותר של NC יונקים, שיטות רבות הועסק לבודד אוכלוסיות NC. NC-derived אבות יכול להיות מתורבת מתוך הפוסט נודדות למקומות בעובר וגם למבוגרים ללמוד את הדינמיקה של פוסט נודדות אבות צפון קרוליינה ^11,14-20 עם זאת הבידוד של אבות צפון קרוליינה כפי שהם להגר הצינור העצבי מספק שימור מיטבי של NC תא הפוטנציאל ומאפיינים נודדות ^13,21,22. פרוטוקולים מסוימים להעסיק תא הקרינה מיון מופעל (FACS) כדי לבודד את האוכלוסייה NC מועשר עבור אבות מסוימים ^11,13,14,17. עם זאת, כאשר החל עוברים בשלבים מוקדמים, מספרים סלולריים הולמים עבור ניתוחים קשה להשיג עם FACS, שמסבך את בידודה של צפון קרוליינה מוקדם populatioNS מעוברים בודדים. כאן, נתאר גישה זו אינה מסתמכת על FACS ותוצאות ב האוכלוסייה כ 96% טהור NC על פי כתב Wnt1-Cre שושלת הופעל ^23.

השיטה המוצגת כאן הוא עיבוד פרוטוקולים מותאם לתרבות של עכברוש NC ^11,13. יתרונותיה של פרוטוקול זה לעומת שיטות קודמות הן כי 1) התאים לא גדלים על שכבה מזין, 2) FACS לא נדרש לקבל האוכלוסייה טהור יחסית NC, ​​3) premigratory תאים צפון קרוליינה מבודדות 4) התוצאות בקלות לכמת. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש הבידוד של צפון קרוליינה מהמודל כל עכבר מוטנטי, להקל על מחקר של מאפיינים צפון קרוליינה עם מניפולציות גנטיות שונות. הגבלה של גישה זו היא כי NC מוסר בהקשר של העובר, אשר ידוע להשפיע, הישרדות הגירה והבחנה של NC ^2,24-28.

1. הכנת פלטות

1. השתמש בטכניקה סטרילית בכל עת.
2. הכן fibronectin (FN) על ידי דילול 100 μL מלאי אדם FN פלזמה לתוך נפח סופי של 3.3 מ"ל ב PBS Dulbecco של (dPBS). הריכוז הסופי הוא 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​וזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע 1.
3. מכסים תחתית של כל אחד בצלחת סטרילית התרבות 4 רקמות היטב עם פתרון FN ולתת לשבת במשך 15 דקות. ודא את כל פני השטח מכוסה. הפוך את התקשורת במהלך תקופה זו (שלבים 2 ו -3).
4. הסר לחוץ Fn פתרון ולאפשר צלחות לייבוש. בעדינות ולשטוף בארות עם 500 DMEM μL, הסר DMEM, ולהוסיף 500 μL של התחדשות עצמית (SR) בינוני (ראו להלן). דגירה על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכילה 5 אחוז CO _2. להשלים כשעה לפני החיתוך כך הצלחות יהיה יבש לפני השימוש.

2. הכנת בינוני SR

1. לתרבות של NC מחנק והגומתוך עשרה עוברי (כ 1 המלטה, בהתאם לרקע הגנטי של הקו העכבר), להכין 25 מ"ל של מדיום SR. שלב 12.5 מ"ל גלוקוז נמוכה DMEM, 7.5 מ"ל Neurobasal בינוני, 25 חומצה retinoic μL (117 מיקרומטר הריכוז הסופי), ו 25 μL 2-mercaptoethanol (50 mM הריכוז הסופי). מערבבים היטב.
2. הוסף צ'יק 3.75 מ"ל תמצית העובר, 250 μL N ₂ תוספת מלח, 500 μL תוסף B27 ו 250 μL פניצילין, סטרפטומיצין (הריכוז הסופי 1%). סינון בינונית דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
3. הוסף 10 IGF1 סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז סופי) ו - 20 bFGF סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ"ל ​​בריכוז הסופי). מערבבים על ידי היפוך. לאחסן ב 4 ° C.

3. הכנת בינוני Wash

1. במשך כ 10 עוברים להכין 50 מ"ל של מדיום שטיפה. שלב 50 מ"ג BSA עם 35 מ"ל גלוקוז DMEM נמוך, בינוני 15 מ"ל Neurobasal, ו 500 μL פניצילין, סטרפטומיצין (1% ריכוז סופי). מסנן סטריליים עם 0.22מיקרומטר הסינון.

4. הכנת collagenase / dispase

1. הוסף 50 μL של 100 מ"ג / מ"ל ​​collagenase / dispase עד 5 dPBS מ"ל. מערבבים היטב.
2. מזרק מסנן עם 0.2 מיקרומטר לסנן ולהוסיף 1.5 מ"ל לתוך כל אחת משלוש הבארות של צלחת 12 באר. פיפטה כ 1 מ"ל בינוני לשטוף את הבארות הנותרות. אחסן את כל הצלחת על הקרח עד מוכנים לעכל את הרקמה גזור.
3. גזור קצות קצה פיפטה P20 ו p1000 מסנן בסכין גילוח סטרילית. גזור מתחת הקצה המחודד של קצה. לחתוך את p1000 ישמש להעביר את העובר כולו תוך P20 ישמש להעברת פיסות רקמה מבודדת.

5. בידוד מחנק צינור Trunk עצבית מ 9.5 עוברים DPC

1. עבור הריונות זמן קבועים, סכרים עם תקע הנרתיק נחשבים 0.5 DPC בצהריים בבוקר תקע הוא ציין. להקריב את ולהסיר את הרחם ב 9.5 DPC.
2. הסר את decidua מהרחם בעדינות Remove העובר מן decidua. חוויתי פעם אחת עם פרוטוקול זה, לבודד 3-4 9.5 עוברים DPC בכל פעם dPBS סטריליים. השתמש בטכניקה סטרילית ומכשירים הנתיחה מעוקרות. מכשירים ניתן לעקר על ידי עיקור, מעוקר חום או דגירה של אתנול.
3. עבור הקדמי מחנק NC: באמצעות מחטים אינסולין, לחתוך את הצינור העצבי על placode otic באמצע. חותכים שוב בקצה האחורי של somite 4 ^ה. חתוך הרקמה הגחון כדי הצינור העצבי להסיר את הקשתות הגרון והלב.
4. עבור NC הגזע: באמצעות מחטים אינסולין, להסיר את החלק של הצינור העצבי בין somites 16-22 (או somite האחרון אם הם עוברים שלב התפתחותי מוקדם יותר מאשר 22 somite).
5. שמור את שק החלמון וכל רקמה עוברית הנותרים עבור genotyping.

6. הסרת האאקטודרם ללא עצבית והמזודרם

1. מניחים בצינור העצבי המכיל קטעים לתוך collagenase / dispase בטמפרטורת החדר למשך 10 דקותs. מיד לשטוף בינוני לשטוף.
2. חזור רקמות dPBS סטריליים. שימוש במחטים סטריליות אינסולין, הוצא בעדינות האאקטודרם לא העצבית מרקמת ולהפריד את somites מן הצינור העצבי. החלקים האחרונים של והמזודרם מרקמות somite ניתן להסיר על ידי triturating בעדינות באמצעות חתך למטה P20 עצה. להיזהר לא לפגוע בצינור העצבי. להתבונן מקרוב במהלך טחינה דקה.
3. מניחים את הצינור העצבי מבודד באמצעות שטיפה 2 ו 3 2 30 בינוני לשטוף.
4. לשטוף פעם בינוני SR, ומקום בצינור העצבי מבודד למרכז גם FN מצופה שהוכנה קודם לכן (שלב 1.3). ללחלח את החדר היפוקסיה עם צלחת של מים סטריליים. מניחים את הצלחת לתוך תא היפוקסיה ולשטוף את החדר בגז מעורבת על 3% O ₂ (להשתמש במיכל המכיל תערובת של 1% מ _2, 6% CO _2, 93% N _2).
5. תמיד להתמודד עם הקאמרית מאוד בזהירות כדי להבטיח thaexplants T הם באין מפריע ולהישאר במרכז וולס.
6. דגירה על 37 ° C. סיכום של צעדים 5-6 מוצג באיור 1.

7. הסרת בצינור העצבי

1. לאחר 24 שעות של דגירה, הסר בצינור העצבי על ידי בעדינות מתגרה קצה הצינור העצבי מן התאים הנודדות באמצעות מחט סטרילית אינסולין. הסר וזורקים בצינור העצבי ממדיום באמצעות חתך P20 סטרילית כמו בשלב 6.2 ולהחליף בינוני עם בינוני SR טרי (איור 2). הדבר נעשה בקלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.

8. נציג תוצאות

לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס בתנאי חוסר חמצן, תאים צפון קרוליינה היגרו מן הצינור העצבי באוכלוסייה טהור כמעט (איור 3 א). לפעמים, פחות תרבויות אידיאליים לא תניב בצמחים חזקים. לדוגמה, ייתכן כי לאחר 24 שעות לאהוא בצינור העצבי יהיה מכורבל על עצמה ו NC לא יעברו מן הצינור העצבי (איור 3 ב). מדי פעם בצינור העצבי לא יצרף את הצלחות מצופה fibronectin.

מניסיוננו, תת אופטימלית הגירה NC או בעיות עם החיבור של הצינור העצבי יכול להיות מושפע לרעה בתנאי normoxia או ריכוז של fibronectin, בהתאמה. הפעילות האנזימטית של collagenase / dispase משתנה מעט על ידי אצווה זמן עיכול חייב להיות מותאם כראוי, לעומת זאת, לא לעכל את הרקמה יותר מרבע שעה. Overdigestion של הצינור העצבי המכיל רקמות collagenase / dispase תגרור בצמחים לקויה. אם הרקמה somite לא יוסר בקלות לאחר דגירה של collagenase / dispase של הצינור העצבי, הצינור העצבי ניתן מודגרות למשך זמן ארוך יותר מעשר דקות. לפעמים בצינור העצבי לא לצרף המצע. אם זה המקרה, בדוק fibronecפח ריכוז ותנאי חוסר חמצן.

למרות התנאים normoxic ניתן wild-type תרבות NC, תנאי חוסר חמצן לחקות באופן הדוק יותר בסביבה vivo ^29,30. מניסיוננו, בתנאי חוסר חמצן הפכה קריטית כאשר culturing מוטציה NC. לדוגמה, כאשר Foxd3 מוטציה NC היו בתרבית בתנאים normoxic, היה המטען NC תוצאה תא הקטינה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת. פער זה בגודל תוצאה הוסר כאשר explants היו בתרבית בתנאי חוסר חמצן (איור 4). יתר על כן, כאשר wild-type explants בצינור העצבי היה מתורבת normoxia, מספר caspase-חיוביים בתאים היה גדול יותר מזה של explants דומים בתרבית היפוקסיה (מידע לא מוצג). על ידי שמירה על כל התרבות NC ב היפוקסיה, השוואות יכולים יותר בקלות בין הדינמיקה של שליטה ותרבויות מוטציה.

> באיור 1. סכמטית כוללת של בידוד NC. א) לנתח אזורים של עניין מן העובר. ב) לקט בצינור העצבי של collagenase / dispase עשר דקות (לא יעלה על רבע שעה). ג) לשטוף בינוני לשטוף. D) לנתח משם האאקטודרם לא עצבית והמזודרם. EF) לשטוף פעמיים בינוני לשטוף. ז) צלחת בינונית התחדשות עצמית. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב 3% O ₂ בתנאי חוסר חמצן.

איור 2. הסרת בשלבים של הצינור העצבי מן explant. הצינור העצבי יש להסיר לאחר 24-48 שעות על מנת למנוע זיהום עם לא-NC תאים. א) הודעה הגבול בין הצינור העצבי ואת תולדה NC (קו מוצק). ב) גזור לאורך הקצה של הצינור העצבי עם מחט האינסולין. ג) מחק בצינור העצבי ולהחליף בינוני עם בינוני עצמית חדשה והתחדשות. קו מקווקו מציין היקף תוצאה. קיצור: NT, בצינור העצבי.

>
איור 3. דוגמאות מייצגות תוצאות. א) תוצאה explant בדרך כלל אחרי 24 שעות הדגירה במדיום התחדשות עצמית בתנאי חוסר חמצן (קו מקווקו מציין היקף תוצאה). ב) יתגדל לאור תוצאה NC לאחר 48 שעות בתרבית. ג) תרבות אידיאלי פחות עם תשואה תוצאה נמוכה. A ו-C היו בתרבית בתנאים זהים. תמונות להדגים את טווח טבעי חוסן התרבות. זה יכול להיות מושפע יעילות הבידוד בצינור העצבי, ריכוז של FN, תנאי חוסר חמצן, ולאחר זמן collagenase / dispase digestions.

איור 4. בניתוח חוץ גופית של תרבויות צפון קרוליינה explant ב normoxia לעומת היפוקסיה. בקרה (סוג בטבע) צפון קרוליינה התאים נדדו מן explants בצינור העצבי לאחר 48 שעות בתנאים תרבות normoxic. לעומת זאת, מוטציה Foxd3NC לא פחותה בהרבה בצמחים תא normoxia (סימן אדום לרמות שולי בצמחים NC). כאשר explants דומים גדלו בתנאי חוסר חמצן, Foxd3 מוטציה explants צפון קרוליינה גברה comparably לבקרות, המאפשר ניתוח שלאחר מכן. שימו לב, התנהגות זו קשורה גם עם התנהגות של Foxd3 מוטציה NC in vivo.

תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן בשלב ההתפתחותי של העובר על מנת להבטיח את ההצלחה של גישה זו. ספירת somites של עוברי עכברים מוקדם הוא קריטי גם לשלב התאמת עוברים בתוך פסולת וקביעת אזורים הנכונות של הצינור העצבי של בידוד. וריאציה של אחד או שניים somites בין העוברים נמצא בטווח סביר של עיתוי התפתחותי, תלוי ברזולוציה של הניסוי שנערך. העובר בין 9 ל 9.5 DPC תהיה בין 17 ו -25 somites. אם לעובר יש יותר מ -25 somites, צפון קרוליינה היא מתקדמת עוד יותר בזמן התפתחותית, ואת בצמחים צפון קרוליינה יהיה פחות חזק בתרבות. קביעת עוברים מבוסס על מספר somite מאפשר דיוק בניסויים כאשר בשלב ההתפתחותי של העובר, ולכן NC, יכול להשפיע על תוצאות הניסויים. בעובר DPC 9.5, NC מחנק נודד מן הצינור העצבי הגבי ב-anterior האחוריים גבולות מוגדרים: מ placode באמצע otic כדי somite 7.באופן דומה, תא המטען NC נודד מן הצינור העצבי ברמות somite 8 עד 24 somite. לבודד אוכלוסיות נפרדות של אבות צפון קרוליינה כמתואר בפרוטוקול זה, דיסקרטית תתי אזורים בתוך כל אחד התחומים האלה מבודדים. באזור של הצינור העצבי המשמש משתנה מבוססת על עיצוב של הניסוי ובאזור הקדמי, האחורי של NC הנלמד.

התנאים תרבות שתוארו לעיל, לרבות אמצעי ותנאי הדגירה, מותאמים במיוחד עבור תרבות של NC murine. דומה בינוני SR שימש לראשונה לתרבות של עכברוש NC ^11. בידיים שלנו, זה בינוני חולדה, עם תוספת של Neurobasal בינונית, מייצרת תוצאה החזקה של Murine אבות NC. יתר על כן, שלא כמו הקודמים culturing עבודה תאים העופות NC, שכבת מזין מיותר לתרבות של NC יונקים בשיטה זו ^11,13,21,22. אמנם יש פרוטוקולים רבים המפרטים תרבות NC גם העופות וגם היונקים ב normoxic conditi תוספות ^9,22, אנחנו ²³ (איור 4), יחד עם אחרים בתחום ^20, מצאו כי Murine culturing תאים צפון קרוליינה בתנאי חוסר חמצן שתוארו כאן הישרדות עזרי מאוד עצמית והתחדשות, יש להניח כי היפוקסיה יותר מקרוב מחקה רמות החמצן פיזיולוגיים בתוך העובר ^20,29,30.

הערכת ביטוי של סמנים מולקולריים מאוד מקל על זיהוי תאים צפון קרוליינה נגזרות הבדיל שלהם. אלה כוללים ביטוי Foxd3, p75, ו Sox10 בתאי גזע צפון קרוליינה. סמנים של NC הבדיל כוללים חלק השריר אלפא אקטין (SMA) עבור myofibroblasts, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) עבור, גליה microphthalmia הקשורים גורם שעתוק (MITF) עבור מלנוציטים, ו-III בטא טובולין, הגן חלבון המוצר 9.5 (PGP9.5 ), ו peripherin על הנוירונים. סמנים אלה יכולים לשמש כדי לקבוע את היעילות explant והבחנה של אבות NC.

לסיכום, זו שיטה לבודד תאים מעוברים צפון קרוליינה עכבר מייצר תרבות חופשית מזין חסיד של premigratory תאים צפון קרוליינה ללא שימוש FACS. ניתוח של ניסויים באמצעות תאים אלה ניתן בקלות לכמת. אמנם שיטה זו היא פשוטה, היישומים שלה עבור המחקר של תכונות של צפון קרוליינה, הגירה בידול עצמי התחדשות, הם עצום. יתר על כן, בידוד NC מ עוברי עכברים מהונדסים גנטית מאפשר לימוד ישיר של גנים ושבילים מסוימים בהקשר של NC הגירה, הישרדות, ו / או בידול.

אין לנו מה למסור.

ברצוננו להודות מארק ווזניאק לסיוע וידאו. אנו רוצים גם להודות שון מוריסון ב UT Southwestern בפרוטוקול המקורי של עכברים לתאים culturing NC. עבודה זו נתמכה הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט מרכז התמיכה של תוכנית אקדמית על ידי תרומות של NIH (HD36720 HD036720 ו-11S109) ו 11GRNT7690040 AHA ל PAL, מלגות predoctoral של AHA (0615209B) ו-NIH (NS065604) לווייטנאם, היה ה-ERP נתמך על ידי מתן הכשרה NIH T32HD007502.