Sıçanlarda Ortotopik Küçük Bağırsak Nakli

İnce bağırsak transplantasyonu irreversibl bağırsak yetmezliği olan hastalar için kabul edilen bir tedavi seçeneği haline gelmiştir. Sıçanlarda ortotopik ince barsak nakli Bizim deneysel model intestinal transplantasyon komplike yatan immünolojik ve inflamatuvar süreçleri ele güvenilir bir aracı olarak hizmet vermektedir.

İnce bağırsak transplantasyonu parenteral beslenme kısa bağırsak sendromu ve yetmezliği (geri dönüşümsüz intestinal yetmezlik) olan hastalar için kabul edilen bir klinik seçenek haline gelmiştir. Özelleşmiş merkezlerde ameliyat iyileşme ve yaşam ^1,3 yüksek kalite sunarken yönetme stratejileri mükemmel kısa ve orta vadeli hasta ve greft sağkalım sağlamıştır. Diğer katı organların daha yaygın nakli aksine (örneğin kalp, karaciğer) intestinal transplantasyon ile indüklenen greft fonksiyonu ve immünolojik değişiklikler birçok yatan mekanizmaları tamamen bilinen ^6,7 değildir. Rejeksiyon, sepsis ve kronik greft yetmezliği Episodes hala az avantajlı uzun dönem sonuçlarında katkıda bulunan ve potansiyel olarak böyle bir nakli yararlanacak evde parenteral beslenme hasta giderek artan sayısına rağmen prosedür daha yaygın istihdam önündeki temel engellerdir. Ince bağırsak içeriryolcu lökositlerin çok sayıda genellikle ilişkili lenfoid bağırsak sistemi (GALT) bağırsak greft yüksek immünojenitenin nedeni bu parçası olmak parçası olarak anılacaktır. Greft mukozal bütünlüğü (rejeksiyon örneğin) tehlikeye kez varlığı ve bağırsak birçok kommensal ve patojenlerin yakınlığı sepsis ataklarının şiddeti açıklar. Güvenli ve uygun hayvan modellerinde elde daha fazla bağırsak-ya da çoklu organ transplantasyon veri alanında ilerleme için gereklidir. Modeli Burada bir kez standart bir şekilde kurulan güvenilirlik ve fizibilite hem birleştirir ve bağırsak nakli ile tetiklenen yatan kompleks moleküler, hücresel ve fonksiyonel mekanizmaları hakkında değerli bilgiler verebilir sağladı. Biz başarıyla Laboratuvarımızda ^8-11 fazla 5 yıldır kullanılan ve tarif prosedür rafine var. Jüpiter Video tabanlı biçimde kompleks prosedürü göstermek için özellikle yararlıdırDure ve bağırsak nakli araştıran ortotopik kemirgen modeli kurmak için planlama grupları için ilk tuzaklardan kaçınmak.

1. Donör Operasyonu

1. Donör sıçan 24 saat (su / glukoz solüsyonu ücretsiz erişim) için oruç tutulmalıdır.
2. İzofluran inhalasyon anestezi uygulamak için, standart atomizer üzerinde% 2 ile başlamak ve daha sonra laparotomi gerçekleştirdikten sonra% 1 azaltır. Sedasyon kontrol etmek için bir ayak tutam gerçekleştirin.
3. Karın Tıraş ve cilt hazırlık 3 kez (Kodan) ile temizleyin. Sonra analjezik subkutan uygulamadan sonra median insizyon gerçekleştirin.
4. Greft tuzlu batırılmış gazlı bez sarılmış sonra, pankreas ve bir Q-ucu (6x büyütme ile cerrahi mikroskop altında) hafifçe çıkan kolon arasındaki fizyolojik yapışıklıklar ayırın.
5. Arter ve 7-0 ipek kullanılarak ileoçekal ve orta ve sağ kolik damarları bölün. Çıkan kolon superior mezenterik ven sağ tarafında (SMV) dışarı yayılır sonra, ileoçekal sağ ve orta kolik damarları 7-0 bağları kullanarak ligasyonu ve bölünmesi için tespit edilebilir.
6. Tüm SMV dışarı doğruldu ve maruz böylece yukarı doğru mide çekin. Retraksiyon bir sivrisinek kelepçe kullanın. Kelepçe gerektiğinde bir şekil haline getirilir hamuru kütlesi tarafından tutulur.
7. Arter ve SMV gelen pankreatobiliyer-duodenal damarlar bölün. Pankreatik doku greft çıkarılmalıdır önce SMV kaynaklanan tüm küçük pankreatobiliyer-duodenum damarlar dikkatle tespit 7-0 ipek ile bağlandı ve bölünmesi gerekir.
8. Arter ve SMV ve abdominal aorta arasındaki tüm lenfatikler dahil kaybetmek bağ dokusu bölün. Hala karnın sağ tarafında greft ile, SMV ve abdominal aorta erişilebilir arasındaki tüm lenfatikler dahil bağ doku kaybedebilir. Bu bağ doku 7-0 ipek kullanılarak bağlandı ve bağırsak greft gelen postoperatif lymphorrhea önlemek için bölünmesi gerekir.
9. Arter ve sağ renal arter bölün. Bağ dokusu ayrılmıştır sonra, sağ renal arter accessibl olurve e ile bağlandı ve 7-0 ipek kullanılarak ayrılmıştır.
10. Sistemik penil ven yoluyla heparin iv 200 birimlerini kullanarak sıçan heparinise.
11. Marjinal arterler Arter ve duodenostenoz jejunal kavşakta ve terminal ileumdan ince bağırsak bölün.
12. Aort SMA kökeni proksimale bağlandı edilir. Portal ven splenik ven ile birleştiği noktada kesmiş edilir. Sonra greft, aort segmenti olan SMA, vasküler pedikül oluşan ile hasat edilir.

2. Backtable Prosedürü

1. Aort kanal aracılığıyla 4'te Wisconsin solüsyonu (UW) University ° C'de 3 ml kullanılarak greft serpmek ve 4 ° C (lümen sulama zorunlu edilir) Uro-Nebacetin N çözelti, 30 ml ile jejunum ucundan bağırsak lümeninde sulamak .

Hemen greft ekstraksiyon uygulandıktan sonra, aort boru 3 ml soğutulmuş UW solüsyonu ile perfüzyon için kullanılır. Bu, bir 20 G iv kateter10 ml lik bir şırınga kullanılır. Perfüzat bölünmüş portal ven özgürce dışarı akmasına dikkat edilmelidir. Nebacetin ile bağırsak sulama için, 50 ml'lik bir şırınga kullanılır.

2. Alıcının hazırlanması sırasında 4 ° C'de UW çözüm greft saklayın.

3. Alıcı Operasyonu

1. Alıcı sıçan 24 saat (su / glukoz solüsyonu ücretsiz erişim) için oruç tutulmalıdır.
2. İzofluran inhalasyon anestezi uygulamak için, standart atomizer üzerinde% 2 ile başlamak ve daha sonra laparotomi gerçekleştirdikten sonra% 1 azaltır. Sedasyon kontrol etmek için bir ayak tutam gerçekleştirin.
3. Karın Tıraş ve cilt hazırlık 3 kez (Kodan) ile temizleyin. Sonra analjezi için Carprofen 5 mg / kg sc subkutan uygulamadan sonra median insizyon gerçekleştirin.
4. Normal salin batırılmış gazlı bez alıcı barsak sarın ve alıcının göğüs üzerine yerleştirin.
5. Q-ipuçları ile dobra dobra retroperiton açın ve abdominal maruzSadece gerekirse aşağı iliak damarlar seviyesine böbrek damarları, aşağıda nal aorta ve vena kava inferior da microscissors kullanın. Kan kaybını önlemek için 7-0 ipek kullanılarak aort ve vena kava dan küçük bel ve omurga tribuaries Arter. (Bunu yapmak için, 16x cerrahi mikroskop zoom değiştirin.)
6. Distale mikrodamar klipler kullanarak sol renal damarların proksimal ve iliak bifurkasyon Aşağıda, yukarıda aorta ve IVC çapraz klemp. Sadece tek bir kelepçe aynı anda her iki damar sıkıştırmak için distal olarak hem de proksimal kullanılır. Anteriorde bir microknife kullanarak hem damarları kesilirken ve kalan kan yıkayın.
7. Sürekli 10-0 Prolene sütür kullanarak greft aort segmenti ve alıcının infrarenal aorta arasında bir uç-yan anastomoz oluşturun .. Başlangıçta, greft düşük fiyatının dikiş arteryel anastomoz ve bağlama arka duvarına dikiş gerçekleştirmek için karnın sağ tarafında (12'de konumlandırılmış sıçan kafası) üzerine yerleştirilir. Thtr, greft anastomoz ön duvarı açığa ve dikiş karın (9 o'clock konumlandırılmış sıçan başkanı) sol tarafına teslim edilmektedir.
8. Greft portal ven ve alıcının IVK arasında bir uç-yan anastomoz 10-0 Prolene kullanarak sütürlerinin tarafından aynı şekilde gerçekleştirilir. Sıçan ile hala yalan yanlara (9 munda kafası), greft karnın sol tarafında konumlandırılmış ve daha düşük bir konaklama sütür yerleştirilir. Anastomoz damar içeriden arka duvar ile başladı. Alt kenet bağlı kalmak sonra, ön duvar dikiş dışarıdan gerçekleştirilebilir.
9. Üst kelepçeler ardından ilk distal kelepçeleri sökün. Herhangi anastomotik kanama Q-ipuçlarını kullanarak doğrudan basınç tarafından kontrol edilir. Greft eşit ve hızlı reperfüzyon kontrol edilmelidir.
10. Mezenterik damarların ligasyonu sonrası tüm alıcının ince bağırsak rezeksiyonu. Alıcılar pro 2-3 cm koruyarak, subtotal enterektomi geçmesiximal jejunum ve ileum distalinde 1 cm.
11. Proksimal (Jejuno-jejunostomi) ve distal (ileo-ileostomi) uçtan 6-0 Monocryl bir kesintiye tek katmanlı sütür kullanılarak intestinal anastomozlar bitirmek. Tarafından enterik süreklilik Restore Yaklaşık 16 sütürler anastomozlar tamamlamak için ihtiyaç vardır.
12. Temizlenene kadar normal salin ile periton boşluğuna sulayın. Sıvı replasmanı için normal serum fizyolojik intraperitoneal 2 ml uygulayın. Sonra 3-0 kas tabakası için Vicryl artı sürekli bir cilt sütür ile devamlı sütür kullanılarak karın kapatın.
13. Postoperatif dönemde sonrasında ratlar standart sıçan yemi ve su ad libitum tarihinde yeniden bir 24 saat boyunca (su ve glikoz çözeltisi erişim) oruç tutulmalıdır. Carprofen ile analjezi 3 gün (aşağıda dozaj bakınız) uygulanmalıdır.

Normal postoperatif seyir

Nakledilen hayvanların yaklaşık 1 saat için bir ısı lambası altında prosedürü hızla kurtarmak gerekir. Hipotermi postoperatif mortalitenin önemli bir nedenidir ve dikkatle intra-ve postoperatif kaçınılmalıdır. İntraoperatif sıvı kayıpları 2.5 ml serum fizyolojik sc enjeksiyonu artı 2.5 ml Glukoz% 5, ilk 24 saat için her 8 saatte tarafından değiştirilmesi gerekir. Sıçanlarda da postoperatif ilk 24 saat glukoz solüsyonu (veya jel diyet) ve su po ücretsiz erişim olmalıdır. Bu dönemden sonra da standart sıçan yemi ve su ad libitum ücretsiz erişim normal beslenme davranışı kazanmak gerekir. Ağrı anestezi indüksiyonu tatbik edilecek ilk atışta, üç gün carprofen 5 mg / kg sc günlük idaresi tarafından kontrol edilir. Ameliyat sırasında antibiyotik profilaksisi sadece allojenik ortamda ihtiyaç vardır ve 5-7 gün (ampisilin 15 mg / kg sc, q. 12 saat) fazla tatbik edilebilir. Genelgörünüş, kürk koşul hem de mukozal bir görünüm normale döner. POD 1 sonra aktivite düzeyi preoperatif durumuna dönmesi gerekir, apatik veya anormal davranışlar erken cerrahi komplikasyonlar göstermektedir. Vücut ağırlığının% 20 kadar ilk kaybından sonra sıçanlar günde 6-8 civarında tekrar kilo almaya başlayacak ve (rejeksiyon olmadan izogenik ayarı) günde yaklaşık 14 normalde preoperatif ağırlığının yaklaşık% 90 ulaşmış olacak.

Ameliyat sonrası komplikasyonlar

Yukarıda belirtildiği gibi, bir karında şişlik, apatik davranış, beslenme kesilmesi ve genel görünüm (karıştırdı kürk, gözleri salgılanması) değişikliklerin olası komplikasyonların belirtileri olarak kabul edilmelidir. Hayvanlar cerrah ve bir veteriner tarafından görülmelidir. Barsak anastomoz darlığı nedeniyle peritonit, ileus nedeniyle dehidratasyon, inflamatuvar durumu gibi koşullar, yetersiz ağrı kesiciler ve diğer kural olmalıdırdışarı d ve tedavi. Hayvan tedaviye rağmen geri vermezse, deney kesilmesi hayvan deneyi yasal düzenlemelerin uygulanması göre vaka bazında bir durumda üzerinde değerlendirilmesi gerekir.

Şekil 1a. Araçlar.
1. Mikroskop (LEICA)
2. Anestezi cihazı (EICKEMEYER)

1b Şekil. Araçlar.
3. Tıraş makinesi
4. Elektronik neşter (GEIGER)
5. Cerrahi forseps
6. DeBakey kavisli bir forseps
7. Kavisli forseps küçük
8. Mikro forseps kavisli
9. Mikro düz 1 forseps
10. Mikro düz 2 forseps
11. Mikro iğne tutucu
12. İğne tutucu
13. Sivrisinek kelepçe
14. Makas 1
15. Makas 2
16. Microscissors
17. Mikro Bisturi

1c Şekil. Araçlar.
18. Microclamps
19. Canulas ve Q-İpuçları (resimsiz)
20. Enjektörler (50 mi, 10 ml, 2.5 ml, 1 mi) çözündürüldü

1c Şekil. Araçlar.
21. Greft depolama için UW solüsyonu
22. Greft lümen sulama için antibiyotikler (Üro-nebacetin N)
23. Greft perfüzyon için UW
24. Normal salin
25. Normal salin ile Bulaşık (backtable için)

Şekil 2. Ortalama postoperatif ağırlık (kümülatif verileri). Şekil 2 ortotopik ince barsak transplantasyonu sonrasında postoperatif ortalama ağırlığı gösterir. Vücut ağırlığının% 20 kadar ilk kaybından sonra sıçanlar günde 6-8 civarında tekrar kilo almaya başlar ve preop% 90 ulaşmış olacaktırgünde 14 (red / immünsüpresyon olmadan izogenik ayarı). Şekil 2 çevresindeki normal rejeneratif ağırlık kaybı verileri değil, hayatta kalma, ölçmek için kullanılabilir hayvanların azalan sayıda kilo kaybı Hayvanların deneylerde sacrifing kaynaklanmaktadır temsil eder.

Şekil 3,. Pankreas dokusu (ok) kolon kaldırılması gerekir.

Şekil 4. Ligating ve SMV ve abdominal aorta arasındaki tüm lenfatikler dahil bağ doku kaybetmek, sağ renal arter (ok) ipek harfleri arasında bölünür bölünmesi sonra.

Şekil 5. UW solüsyonu ile greft Perfüzyon aort kanal aracılığıyla.

Şekil 6. Alıcı vena kava ve aort hazırlandıktan sonra damarların maruz kalan, sıkma için hazırdır.

Şekil 7. Çapraz kelepçe vena kava ve eşzamanlı aort microclamps kullanılarak yapılır.

Şekil 8. (A) aorto-aortik anastomoz kaldıktan dikiş kullanılarak gerçekleştirilir. (B) aorto-aortik anastomoz tamamlanmasından sonra, bir sonraki portocaval anastomoz gerçekleştirilir. Alt kalmak sütür yerde zaten.

Şekil 9. (A) portocaval anastomoz ikinci kalmak sütür sonra başlatılır yerde. (B) c sonraportocaval anastomoz ompletion.

Şekil 10. Greft iyi reperfuses kelepçeler çıkarılmasından sonra.

Şekil 11. Barsak anastomozu için kalış sütür (a) Yerleştirme. (B) barsak anastomoz Tamamlandı.

Sıçanlarda intestinal transplantasyon modelleri 1970'lerde ⁵ gibi erken olarak tarif edilmiş olsa da son zamanlarda kullanılan modellerin en farklı teknikler kullanılarak ¹³ heterotopik bağırsak nakli içerir. Genel olarak heterotopik işlemleri daha kolay mikrocerrahi teknikleri ve değerlendirme için greft kolay erişilebilirlik avantajı varken, heterotopik intestinal transplantasyon hesaba nakledilen ince barsağın birden etkileşimleri ve kontraktil aktivitesi gibi fonksiyonel yönlerini almayan büyük dezavantajı var ve kommensal ve patojenlerin büyük bir konak bağlamında ortotopik greft karakterize mukozal bariyer fonksiyonu. Bizim grup burada anlatılan ortotopik model ve bulguları ile büyük bir deneyim kazanmıştır inflamatuar ve adaptif immün yanıtları nedeniyle spesifik değişikliklerle birçok fonksiyonel yanlısı bağlamında değerlendirilmesi gerektiğini göstermektedirkontraktilite ve mukozal bütünlük gibi nakledilen küçük bağırsak örnekler alınarak. Unutmayın ki, burada istihdam anastomoz tekniklerinin prosedürü kolaylaştırmak ve özellikle multivisceral nakli ^12,14 modellerinde, kritik sıcak iskemi süresini azaltmak için gösterilmiştir bazıları arteriyel veya venöz kolluklar, en kullanımını içermez. Bu kolluklar complicative potansiyel tek ince bağırsak transplantasyonu bu modelinde benzer teknikler önlemek için bize yol açmıştır multivisceral nakli, kemirgen modellerinde manşet teknikler istihdam etmek gerekli olabilir rağmen. Bu modelde portal drenaj teknikleri kullanmaya teşebbüs değil. Apart teknik açıdan zorlayıcı olmaktan (küçük portal ven çapı venöz sorunlara neden olabilir), hangi kurmak için tüm model zorlaştıracak - klinik intestinal transplantasyon sistemik drenajı vakaların çoğunda kullanılan bir gerçektir. Böylece, açıklanan teknik dönüşlüteknik fizibilite ile birlikte klinik uygulamada ECTS. Greftlerin Portal drenaj birçok deneysel ve klinik çalışmalarla ^2,4 üstün sonuçlar ile ilişkili olduğu gösterilmiştir olmamıştır. Kararlı hayvan hayatta kalması için gerekli yaklaşık 35 dakika arasında yeterli derecede kısa iskemi kez Bu model için öğrenme eğrisi tamamlanmasından sonra elde edilebilir.

Bu protokole göre Ortotopik ince barsak transplantasyonu yaklaşık 30-40 prosedürlerini yerine getirdikten sonra bir mikrocerrahi deneyimli araştırmacı tarafından öğrenilebilir. Vallahi biçimi tarafından sağlandığı gibi görselleştirme doğrudan görsel gözlem ve muhtemelen yöntemi ve daha az hayvan kurban hızlı kurmasa kullanılan teknikler doğru şekilde yeniden üretilmesini sağlar. Kritik nokta, soğuk ve sıcak iskemi süresi ve barsak anastomoz darlığı / yetmezliği kanıyor. Bu deneysel ortamda soğuk iskemi zamanı sıcak ische kadar önemli değildirmia zaman ama 45 dakikayı geçmemelidir. Sıcak iskemi süresi 35 dakika civarında olduğu ve bu yüksek mortaliteye neden olabilir Ayrıca, 45 dakikayı geçmemelidir. Küçük sıçan 300 g üzerinde iyi ve kilo prosedürü tahammül yok, çünkü ideal bir donör ve alıcı ağırlığı 200 g civarındadır aşırı karın yağ ile ilişkilidir. Sıçanlar doğrudan postoperatif dönemde vücut ağırlığının% 20 kadar kaybetmek ama ameliyattan 6-8 gün (Şekil 2) sonra tekrar kilo almaya başlamalıdır. Hayvan kurban kadar günlük sağlık kontrolleri (uyanıklık, kürk ve mukozal görünüm, ağırlık, dışkı kalitesi ve sıklığı) yapılmalıdır. Yukarıda tarif edildiği gibi, en az ilk üç gün için antibiyotik ve analjezi ve günlük uygulama önerilmektedir. İlk uygulama sonrasında, özellikle mikrovasküler ve barsak anastomoz, bu model izogenik ortamda yaklaşık olarak% 80-90 arasında güvenilir ve istikrarlı uzun süreli sağkalım sağlar. Alloge yılındanic ortamda hayatta kalma, genellikle daha düşük bir akut ve kronik rejeksiyon gibi immünolojik fenomen, esas olarak bağlıdır ve ikinci test edilmiş ve immünosüpresif protokolüne göre geniş ölçüde değişebilir.

Teknik notlar: Donör işlem süresi yaklaşık 45 dakika olmalıdır. Alıcı ameliyatı çok 1,5 saati geçmemelidir. Bir ısıtma pedi alıcı hipotermi önlemek için rutin olarak kullanılmalıdır. Damar kolay erişim için, alıcının yanal kuyruk damarı bir 22 G damar içi kateter kullanılarak işlem başlangıcında kanüle edilebilir. Yukarıda açıklandığı gibi intestinal lümen, Sulama bilgimize bu adımı vardır sonucu ve mortalite üzerine olumsuz etkileri ihmal, gerekli olmayabilir.

Hayvan çalışma gereksinimleri: hayvanlar, Almanya Federal Cumhuriyeti, Devletin Kuzey Ren-Westfalia yürürlükteki kanunlar ve yönetmeliklere uygun tutuldu. Belge numaraları hangi t altındaO deneyler yazara talep edilebilir onaylanmıştır.

Çıkar çatışması ilan etti.