쥐 Orthotopic 작은 창자 이식

작은 창자 이식은 되돌릴 장 실패 환자에 대한 인정 치료 옵션이되었습니다. 쥐의 orthotopic 작은 창자 이식 우리의 실험 모델은 장 이식을 복잡하게 기본 immunologic과 염증 프로세스를 처리 할 수​​있는 신뢰할 수있는 도구로 제공하고 있습니다.

작은 창자 이식은 비경 영양 짧은 창자 증후군과 실패 (돌이킬 수없는 장 실패) 환자에 대한 임상 승인 옵션이되고 있습니다. 전문 센터에서 수술을 향상과 생활 ^1,3의 높은 품질을 제공하는 동시에 관리 전략은 우수한 단기 및 중간 기간 환자와 이식 생존으로 이어 왔습니다. 다른 고체 기관의보다 일반적인 이식과 달리 (예 : 심장, 간) 장 이식에 의해 유도 그라프 트 기능과 immunologic의 변경의 여러 기본 메커니즘은 완전히 알려져 ^6,7 없습니다. 급성 거부, 패혈증 및 만성 이식 실패의 에피소드는 아직 덜 유리한 장기 성과에 기여하고 잠재적으로 이러한 이식의 혜택을받을 수 집 비경 영양에 대한 환자의 증가에도 불구하고 절차의보다 광범위한 고용을 방해 주요 장애물입니다. 소장을 포함여객 leucocytes의 큰 숫자가 일반적으로 내장 관련된 림프 시스템 (갈트) 장 이식의 높은 immunogenity 이유의이되는 부분의 일부라고. 이식 점막 무결성 (거절의 예를 들어) 손상되면 존재 속에서 많은 commensals과 병원균의 근접 패혈증 에피소드의 심각도를 설명합니다. 안정적이고 실현 가능한 동물 모델에서 생성 된 더 많은 장 및 multiorgan 이식 데이터의 필드를 이동하는 것은 필요합니다. 모델은 여기에 한 번 표준화 된 방식으로 설립 신뢰성과 타당성을 모두 결합하여 장 이식에 의해 실행되는 기본 복잡한 분자, 세포 및 기능 메커니즘에 중요한 통찰력을 제시 할 수 있습니다 제공됩니다. 우리는 성공적으로 우리의 실험실 ^8-11에서 5 년 이상 동안 사용 설명 절차를 수정했습니다. 주피터 동영상 기반 형식은 복잡한 proce을 설명 할 때 특히 유용합니다dure 및 장 이식을 조사 orthotopic 쥐 모델을 구축 할 계획 그룹에 대한 초기 함정을 피하십시오.

1. 기부자 운영

1. 기증 쥐 24 시간 (물 / 혈당 솔루션을 무료로 이용하실 수)에 금식 보관해야합니다.
2. Isoflurane 흡입 마취를 유도하기 위해 표준 분무기에 2 %로 시작하고 개복술을 수행 한 후 1 % 줄일 수 있습니다. 진정 작용을 확인 발가락 핀치을 수행합니다.
3. 복부를 면도하고 피부 시험을 치루 3 회 (Kodan)로 청소하십시오. 그런 다음 진통제의 피하 투여 후 중간 절개를 수행합니다.
4. 이식은 생리 불린 거즈에 싸서되면 췌장 및 Q-팁 (6x 확대와 함께 수술 현미경)을 부드럽게 오름 콜론 사이의 생리 adhesions를 구분합니다.
5. Ligate와 7-0 실크를 사용하여 ileocecal & 중간 & 오른쪽 복통 혈관을 나눕니다. 오름 콜론은 장간막 정맥의 오른쪽 (SMV)에 퍼져 후, ileocecal 오른쪽 중간 잘록 창자 선박은 7-0 관계를 사용하여 결합 및 분할에 대한 식별 할 수 있습니다.
6. 전체 SMV는 정리와 노출되어 있도록 위쪽으로 배를 철회. 철회를위한 모기 겸자를 사용하십시오. 클램프는 필요에 따라 모양으로 형성 plasticine 질량에 의해 개최됩니다.
7. Ligate와 SMV에서 오는 pancreatico - 십이지장 정맥을 나눕니다. 췌장 조직 이식에서 제거 할 수 있습니다 전에 SMV에서 발생하는 모든 작은 pancreatico - 십이지장 정맥은 신중하게, 확인 7-0 실크로 출혈도 잡았와 구분해야합니다.
8. Ligate와 SMV과 복부 대동맥 사이 lymphatics를 포함하여 손실 결합 조직을 나눕니다. 여전히 복부의 오른쪽에있는 그라프로는 SMV 및 복부 대동맥에 액세스 할 사이 lymphatics 등의 결합 조직을 잃게됩니다. 이 결합 조직은 7-0 실크를 사용하여 출혈도 잡았와 장 이식의 수술 lymphorrhea을 피하기 위해 나눌 수 있어야합니다.
9. Ligate와 오른쪽 신장 동맥을 나눕니다. 결합 조직이 분열 한 후, 오른쪽 신장 동맥은 accessibl된다전자와는 출혈도 잡았와 7-0 실크를 사용하여 구분됩니다.
10. 체계적으로 음경 정맥을 통해 헤파린 IV 200 단위를 사용하여 쥐를 heparinise.
11. 한계 동맥을 Ligate하고 duodeno-jejunal 교차로에서와 터미널 회장에서 작은 창자를 나눕니다.
12. 대동맥은 SMA의 출처에 proximally 출혈도 잡았 있습니다. 포털 정맥은 지라 정맥과 합류에 가로로되어 있습니다. 그런 다음 이식은 대동맥 세그먼트와 SMA 자사의 혈관 작은 꽃자루로 구성된을 수확하고 있습니다.

2. Backtable 절차

1. 대동맥 도관을 통해 4에 위스콘신 솔루션 (UW)의 대학 ° C의 3 ML을 사용하여 이식을 Perfuse와 4 ° C (루멘 관개는 필수입니다)에서 Uro​​-Nebacetin N 솔루션의 30 ML과 jejunal 끝에서 장 내강을 관개 .

즉시 이식을 추출 후 대동맥 도관은 3 ML 차가운 UW 솔루션과 재관류에 사용됩니다. 에서이 들어, 20 G IV 카테터10 ML의 주사기가 사용됩니다. perfusate은 나누어 포털 정맥에서 자유롭게 밖으로 흘러하기 위해 관찰해야합니다. Nebacetin있는 장 관개를 들어, 50 ML의 주사기가 사용됩니다.

2. 받는 사람의 준비 기간 동안 4 ° C에서 UW 솔루션에 이식을 저장합니다.

3. 받는 운영

1. 받는 사람 쥐 24 시간 (물 / 혈당 솔루션을 무료로 이용하실 수)에 금식 보관해야합니다.
2. Isoflurane 흡입 마취를 유도하기 위해 표준 분무기에 2 %로 시작하고 개복술을 수행 한 후 1 % 줄일 수 있습니다. 진정 작용을 확인 발가락 핀치을 수행합니다.
3. 복부를 면도하고 피부 시험을 치루 3 회 (Kodan)로 청소하십시오. 그런 다음 intraoperative 진통제에 대한 Carprofen 5 밀리그램 / kg SC의 피하 투여 후 중간 절개를 수행합니다.
4. 정상적인 생리 불린 거즈에받는 장을 정리하고받는 사람의 가슴에 놓습니다.
5. Q-팁과 퉁명스럽게 retroperitoneum를 열고 abdomi 노출단지 필요한 경우 다운 엉덩 혈관의 수준에 신장 혈관, 아래 NAL 대동맥과 아래 대정맥은 microscissors을 사용합니다. 혈액 손실을 방지하기 위해 7-0 실크를 사용하여 대동맥과 대정맥에서 작은 허리와 척추 tribuaries을 Ligate. (이 작업을 수행하려면 16X에 수술 현미경 줌을 변경할 수 있습니다.)
6. distally microvessel 클립을 사용하여 왼쪽 신장 혈관 proximally와 엉덩 분기 위 아래에있는 대동맥과 IVC를 건너서 - 클램프. 하나의 클램프를 동시에 혈관 클램프에 distally뿐만 아니라 proximally 사용됩니다. anteriorly microknife를 사용하여 모두 혈관을 절개하고 나머지 피를 씻어.
7. 연속 10-0 Prolene의 봉합을 사용하여 그라프 트 대동맥 세그먼트과받는 사람의 infrarenal 대동맥 사이의 엔드 - 투 - 측 문합 부위를 만들기 .. 처음에는 이식은 낮은 숙박 봉합의 동맥 문합하고 매듭 묶느라 뒷면 벽 바늘을 수행 할 수있는 복부의 오른쪽 (12시 위치 쥐의 머리)에 배치됩니다. 일실내, 이식은 문합의 전면 벽을 노출하고 봉합 할 수있는 복부 (8시와 9시에 위치 쥐의 머리)의 왼쪽으로 설정되어 있습니다.
8. 그라프 트 포털 정맥과받는 사람의 IVC 사이의 엔드 - 투 - 측 문합은 10-0 Prolene을 사용하여 봉합을 실행하여 마찬가지로 수행됩니다. 쥐와 함께 누워있는 옆으로는 (9시 위치에 머리), 이식은 복부의 왼쪽에 위치하며 낮은 숙박 봉합이 배치됩니다. 문합은 선박 내부에서 다시 벽으로 시작됩니다. 낮은 숙박 봉합이 연결된 후 전면 벽 바늘은 외부에서 수행 할 수 있습니다.
9. 상단 클램프 다음 먼저 말초 클램프를 제거합니다. 모든 anastomotic의 출혈은 Q-팁을 사용하여 직접 압력에 의해 제어됩니다. 이식은 동등하고 신속하게 reperfusion를 확인한다.
10. 창 자간 막 혈관의 결합 후 전체받는 사람의 작은 창자를 잘라내 다. 수상자는 프로로부터 2-3 센티미터 보존 소계 enterectomy을 받다ximal 공장 및 말초 회장의 1cm.
11. 근위 (jejuno-jejunostomy)과 말초 (ileo-ileostomy) 엔드 - 투 6-0 Monocryl을 중단 한 레이어 봉합을 사용하여 장 문합을 종료합니다.이 장의 연속성을 복원 약 16 봉합은 문합을 완료하기 위해 필요합니다.
12. 깨끗한 때까지 정상적인 생리와 복막 캐비티를 관개. 유체 교체 정상적인 생리 intraperitoneally 2 ML을 관리 할 수​​ 있습니다. 그런 다음 3-0 근육 레이어 Vicryl 플러스 지속적으로 피부 봉합과 연속 봉합을 사용하여 복부를 닫습니다.
13. 수술 기간에서 쥐 그런 다음 표준 쥐 수유와 물 광고 libitum에 다시 시작 또 다른 24 시간에 (물과 포도당 솔루션에 액세스 할 수있는) 금식 보관해야합니다. carprofen있는 진통제는 3 일 (이하 복용량을 참조) 관리해야합니다.

일반 수술 과정

이식 동물은 약 ​​1 시간에 대한 열 램프 아래의 절차에서 신속하게 복구해야합니다. 저체온은 수술 사망률의 주요 원인이며, 신중하게 내부 및 postoperatively 피해야한다. Intraoperative 유체 손실 2.5 ML 정상적인 생리의 SC 주입 플러스 2.5 ML 포도당 5퍼센트 첫 24 시간마다 8 시간으로 대체해야합니다. 쥐도 postoperatively 첫​​ 24 시간에 포도당 용액 (또는 겔 다이어트)와 물 PO를 무료로 이용하실 수 있습니다해야합니다. 이 기간 후에는 표준 쥐 수유와 물 광고 libitum에 무료로 액세스 할 수있는 정상적인 먹이 동작을 다시해야합니다. 통증은 마취 유도에서 관리 할 첫 번째 샷과 함께 3 일 동안 carprofen 5 밀리그램 / kg SC 매일의 관리에 의해 제어됩니다. Perioperative 항생제 예방은 allogenic 설정에 필요한 있으며, 5~7일 (암피실린 15​​ 밀리그램 / kg SC, Q. 12 시간)을 통해 관리 할 수​​ 있습니다. 일반외모, 모피 조건뿐만 아니라 점막 모양은 정상이어야합니다. POD 1 일 이후 활동 수준이 수술 전 상태로 돌아해야 apathic하거나 비정상적인 동작이 조기 수술 합병증을 제안합니다. 체중의 20 %까지의 초기 손실 후 쥐가 수술 일 6-8 주위에 다시 무게를 얻기 위해 시작하고 (제거하지 않고 isogenic 설정에서) 수술 일 14 주위에 일반적으로 자신의 수술 전 체중의 90 % 정도에 도달 한 것입니다.

수술 후 합병증

위의 언급 한 바와 같이, 팽창 복부, apathic 행동, 먹이의 중지 및 일반 외모 (뻗치고 털, 눈에서 분비)의 변경은 가능한 합병증의 증상으로 간주해야합니다. 동물은 외과 의사와 수의사에 의해 볼 수 있어야합니다. 장 문합의 협착으로 인해 복막염, 장폐색으로 인해 탈수, 염증 상태와 같은 조건은 부족 통증은 약물과 다른 규칙이어야합니다아웃 d와 치료. 동물이 치료에도 불구하고 회복되지 않는 경우에는 실험의 중지는 동물 실험 규정을 적용에 따라 사례별로 평가해야합니다.

그림 1a. 악기.
1. 현미경 (LEICA)
2. 마취 장치 (EICKEMEYER)

1B 그림. 악기.
3. 고리 대금업자
4. 전자 메스 (가이거)
5. 외과 포셉
6. DeBakey가 휘어 포셉
7. 구부러진 집게 작은
8. 마이크로 포셉가 휘어
9. 마이크로는 곧바로 1 포셉
10. 마이크로는 곧바로 두 집게
11. 마이크로 니들 홀더
12. 니들 홀더
13. 모기 클램프
14. 가위 1
15. 가위 2
16. Microscissors
17. 마이크로 메스

1C 그림. 악기.
18. Microclamps
19. Canulas 및 Q-팁 (도시되지 않음)
20. 주사기 (50 ML, 10 ML, 2.5 ML, 1 ML)

1C 그림. 악기.
21. 이식 저장 UW 솔루션
22. 그라프 트 루멘 관개를위한 항생제 (Uro-nebacetin N)
23. 이식 재관류에 대한 UW
24. 일반 염분
25. 정상적인 생리와 요리 (backtable 용)

그림 2. 평균 수술 중량 (누적 데이터). 그림 2는 orthotopic 작은 창자 이식 후 평균 수술 무게를 보여줍니다. 체중의 20 %까지의 초기 손실 후 쥐가 수술 일 6-8 주위에 다시 무게를 얻기 위해 시작과 preop의 90 %에 도달합니다수술 일 14 일 (거부 / immunosuppression없이 isogenic 설정에서). 그림 2 주위 일반적으로 erative 무게는 체중 감량 데이터가 아닌 생존을 측정 할 수 동물의 감소 번호 체중 감량이 실험 동물의 sacrifing에 주로 때문입니다를 나타냅니다.

그림 3. 췌장 조직 (화살표)는 대장에서 제거해야합니다.

그림 4. ligating과 SMV과 복부 대동맥 사이의 모든 lymphatics 등의 결합 조직을 잃어, 오른쪽 신장 동맥 (화살표)가 실크 ligatures 사이에 나누어집니다 분할 후.

그림 5. UW 솔루션과 이식의 재관류 대동맥 도관을 통해.

그림 6.받는 대정맥과 대동맥의 준비 후 혈관이 노출되어 클램핑을위한 준비.

그림 7. 크로스 클램프는 대정맥 동시에 대동맥 microclamps를 사용하여 수행됩니다.

그림 8. (A) aorto - 대동맥 문합은 숙박 봉합을 사용하여 수행됩니다. (b)는 aorto - 대동맥 문합 완료 후, portocaval 문합은 다음을 수행 할 수 있습니다. 낮은 숙박 봉합은 장소에 이미 있습니다.

그림 9. (A) portocaval 문합가 두 번째 숙박 봉합 한 후 시작이 곳입니다. (B) C 한 후portocaval 문합의 ompletion.

그림 10. 이식이 잘 reperfuses 클램프를 제거 후.

그림 11. 장 문합을위한 숙박 봉합의 (A) 위치. (B) 장 문합 부위를 수료.

쥐의 장 이식 모델 1970ies ^5로 일찍 설명되어 있지만 최근 고용 모델의 대부분은 다른 기술이 ^13을 사용하여 heterotopic 장 이식을 포함한다. 일반적으로 heterotopic 절차를 쉽게 microsurgical 기법과 평가를위한 이식을보다 쉽게​​ 접근 할 수있는 장점을 가지고 있지만, heterotopic 장 이식이 계정에 이식 된 작은 창자의 여러 상호 작용과 수축 활동 등의 기능 측면을 복용하지의 가장 큰 단점을 가지고 있으며 commensals과 병원균의 광대 한 호스트의 맥락에서 orthotopic 이식을 특징 점막 장벽 기능. 우리 그룹이 여기에 설명 orthotopic 모델 및 결과를 갖춘 넓은 경험을 쌓았습니다하면 염증과 적응 면역 반응에 의해 발생하는 특정 변경의 많은 기능 프로와 함께 맥락에서 평가되어야하는 것이 좋습니다수축성 및 점막 무결성과 같은 이식 작은 변의 perties. 참고 여기 사용 된 anastomotic 기술은 절차를 촉진하고 특히 multivisceral 이식 ^12,14의 모델에서 중요한 따뜻한 국소 빈혈 시간을 줄이기 위해 표시되었습니다 일부의 동맥이나 정맥의 수갑의 사용이 포함되어 있지 않습니다. 그것은 소매의 complicative 잠재력이 하나의 장의 이식이 모델에서 유사한 기술을 피하기 위해 우리를 이끌었습니다 multivisceral 이식의 쥐 모델에 커프 기술을 채용해야 할 수도 있습니다 있지만. 우리는이 모델 포털 배수 기술을 사용하려고하지 않았습니다. 이외에도 기술적으로 도전이되는 것을 (작은 포털 정맥 직경이 정맥 유출 문제로 이어질 수), 즉 설정할 전체 모델을 더 어렵게 만들지 것 - 그게 임상 장 이식 조직 배수에 대부분의 경우에 사용되는 사실입니다. 따라서, 설명 기술의 refl기술 타당성과 결합 임상 연습을 ects. 이식의 포털 배수는 여러 임상 및 실험 연구 ^2,4에서 우수한 결과와 관련된 것으로 표시되지 않았습니다. 안정적인 동물의 생존에 필요한 약 35분의 충분히 짧은 국소 빈혈 시간이 모델에 대한 학습 곡선의 완료 후에 달성 할 수 있습니다.

이 프로토콜에 따라 Orthotopic 작은 창자 이식은 약 30-40 절차를 수행 한 후 microsurgically 경험이 풍부한 연구자에 의해 배울 수 있습니다. 주피터 형식에 의해 달성으로 시각화 직접 시각적 관찰하고 가능한 방법과 적은 동물을 제물로 바치는 빠르게 구축에 이르게 고용 기술의 정확한 재현 할 수 있습니다. 중요한 점은, 추위와 따뜻한 국소 빈혈 시간과 장 anastomotic의 협착증 / 부족을 피를 흘리고있다. 이 실험 설정에서 추위 국소 빈혈 시간은 따뜻한 ische만큼 중요하지 않습니다미아 시간 만 45 분을 초과 할 수 없습니다. 따뜻한 국소 빈혈 시간은 35 분 정도이어야하며이 높은 수술 사망률의 원인이 될 수 있습니다으로도, 45 분을 초과 할 수 없습니다. 작은 쥐가 300g으로 잘와 무게 절차를 용납하지 않기 때문에 이상적인 기증자와받는 사람 무게는 200g에 있습니다이 과도한 intraabdominal 지방과 연결되어 있습니다. 쥐들이 직접 수술 시대에 체중의 20 %까지 잃게되지만 postoperatively 6~8일 (그림 2) 후 다시 체중을 얻기 위해 시작합니다. 동물이 희생 될 때까지 매일 건강 수표는 (경계, 모피 점막 모양, 무게, 대변의 품질과 주파수) 수행해야합니다. 우리는 위에서 설명한대로 적어도 처음 세 일 동안 항생제와 진통제의 일상 관리를 권장합니다. 초기 연습 후, 특히 microvascular과 장 문합의이 모델은 isogenic 설정에서 80-90 % 정도의 신뢰성과 안정적인 장기 생존을 제공합니다. alloge에서NIC 설정 생존은 일반적으로 낮은 급성 및 만성 거부 등의 immunologic 현상에 주로 의존하고 사용하고 테스트 면역 처방에 따라 크게 다를 수 있습니다.

기술 노트 : 기증 작업 시간이 45 분해야합니다. 받는 작업이 많은 1.5 시간을 초과 할 수 없습니다. 가열 패드는받는 사람에 저체온증 방지하기 위해 정기적으로 사용되어야합니다. 쉽게 혈관 액세스, 수신자의 측면 꼬리 정맥은 22 G 정맥 카테터를 사용하여 프로 시저의 시작 부분에서 cannulated 할 수 있습니다. 위의 설명에 따라 장 내강의 관개는 우리의 모든 지식이 단계가 결과와 사망률에 부정적인 영향을 생략하지 필요한되지 않을 수 있습니다.

동물 연구 요구 사항 : 동물 독일 연방 공화국, 주 노스 라인 - Westfalia의 적용 법률과 규정에 따라 유지되었습니다. 문서 번호있는 t 이하그는 실험은 해당 작성자의 요청하실 수 있습니다 승인되었습니다.

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.