Ortotopico di intestino tenue di ratti

Trapianto di intestino tenue è diventata una opzione di trattamento per i pazienti con accettato irreversibile insufficienza intestinale. Il nostro modello sperimentale di trapianto ortotopico di intestino tenue nel ratto è uno strumento affidabile per affrontare immunologiche di base e processi infiammatori che complicano trapianto di intestino.

Trapianto di intestino tenue è diventata un'opzione accettata clinico per i pazienti con sindrome dell'intestino corto e il fallimento della nutrizione parenterale (irreversibile insufficienza intestinale). In centri specializzati migliorato operativa e le strategie di gestione hanno portato a eccellenti a breve e medio termine paziente e la sopravvivenza del trapianto con una qualità della vita elevata ^1,3. A differenza del più comune di trapianto di altri organi solidi (cuore cioè, fegato) molti meccanismi alla base della funzionalità del trapianto e alterazioni immunologiche indotte dal trapianto di intestino non sono del tutto noti ^6,7. Gli episodi di rigetto acuto, sepsi e insufficienza cronica del trapianto sono i principali ostacoli che contribuiscono ancora meno favorevole esito a lungo termine e ostacolare un impiego più diffuso della procedura, nonostante un numero crescente di pazienti in nutrizione parenterale domiciliare che avrebbe potenzialmente beneficiare di un tale trapianto. Il piccolo intestino contieneun gran numero di leucociti passeggeri comunemente indicato come parte del sistema linfoide associato intestino (GALT), essendo questa parte del motivo della immunogenity alta del graft intestinale. La presenza e la vicinanza di molti commensali e patogeni nell'intestino spiega la gravità degli episodi di sepsi volta innesto integrità della mucosa è compromessa (per esempio rigetto). Per far avanzare il campo di dati intestinali e trapianto multiorgano più generati da modelli animali affidabili e fattibile è necessario. Il modello fornito combina qui sia l'affidabilità e la fattibilità, una volta stabiliti in modo standardizzato e in grado di fornire informazioni preziose nei sottostanti complessi molecolari, meccanismi cellulari e funzionali che sono attivati ​​da trapianto di intestino. Abbiamo utilizzato con successo e raffinato la procedura descritta su più di 5 anni nel nostro laboratorio ^8-11. Il JoVE video-formato è particolarmente utile per dimostrare la procedura complessaDure e evitare le insidie ​​iniziali per i gruppi che intendono stabilire un modello ortotopico roditore indagando trapianto di intestino.

1. Donatori di funzionamento

1. Il topo donatore deve essere tenuto a digiuno per 24 ore (libero accesso all'acqua / soluzione di glucosio).
2. Per indurre l'anestesia isoflurano inalazione, inizia con il 2% di atomizzatore standard, e quindi ridurre a 1% dopo aver eseguito laparotomia. Eseguire un pizzico punta per controllare la sedazione.
3. Shave l'addome e pulire con la preparazione della pelle 3 volte (Kodan). Quindi, eseguire una incisione mediana dopo somministrazione sottocutanea di analgesico.
4. Dopo l'innesto è avvolto in soluzione salina garza imbevuta, separare le aderenze fisiologiche tra il pancreas e il colon ascendente delicatamente con un Q-tip (sotto il microscopio operatorio con un ingrandimento 6x).
5. Legare e sezionare i vasi coliche ileocecale e destra e centro con 7-0 seta. Dopo che il colon ascendente si sviluppa sul lato destro della vena mesenterica superiore (SMV), i vasi coliche ileocecale, destro e centrale può essere identificato per la legatura e la divisione con legami 7-0.
6. Disimpegno stomaco verso l'alto, in modo che l'intera SMV è raddrizzato ed esposta. Utilizzare un morsetto zanzara per lo svincolo. La pinza è detenuto da massa plastilina formata in forma, se necessario.
7. Legare e dividere i pancreatico-duodenali vene provenienti dalla SMV. Tutti piccole pancreatico-duodenale vene provenienti dal SMV deve essere accuratamente identificata, ligato con 7-0 seta e divisa prima che il tessuto pancreatico può essere rimosso dal trapianto.
8. Legare e sezionare il tessuto connettivo perde compresi tutti linfatici tra la SMV e l'aorta addominale. Con l'innesto ancora sul lato destro dell'addome, il tessuto connettivo perde compresi tutti linfatici tra la SMV e l'aorta addominale è accessibile. Questo tessuto connettivo deve essere ligati utilizzando 7-0 seta e diviso per evitare lymphorrhea postoperatoria dal graft intestinale.
9. Legare e sezionare l'arteria renale destra. Dopo che il tessuto connettivo è diviso, l'arteria renale destra diventa accessible ed è legata e sezionata utilizzando seta 7-0.
10. Sistemica heparinise il topo con 200 unità di eparina iv attraverso la vena del pene.
11. Legare le arterie marginali, e dividere il piccolo intestino al duodeno-digiunale giunzione e l'ileo terminale.
12. L'aorta è ligato prossimalmente all'origine della SMA. La vena porta è attraversata alla confluenza con la vena splenica. Poi l'innesto viene raccolto con il suo peduncolo vascolare che consiste della SMA con un segmento aortico.

2. Procedura Backtable

1. Perfondere l'innesto con 3 ml di soluzione University of Wisconsin (UW) a 4 ° C tramite il condotto aortica e irrigare il lume intestinale dall'estremità digiunale con 30 ml di soluzione Nebacetin Uro-N a 4 ° C (irrigazione lumen è obbligatorio) .

Immediatamente dopo l'estrazione della protesi, il condotto aortica è utilizzato per perfusione con 3 ml di soluzione refrigerata UW. Per questo, un catetere 20 G iv sullauna siringa da 10 ml viene utilizzato. Il perfusato deve essere osservato defluire liberamente dalla vena porta divisa. Per l'irrigazione intestinale con Nebacetin, una siringa da 50 ml viene utilizzato.

2. Memorizzare l'innesto in soluzione UW a 4 ° C durante la preparazione del destinatario.

3. Destinatario di funzionamento

1. Il ratto del destinatario deve essere tenuto a digiuno per 24 ore (libero accesso all'acqua / soluzione di glucosio).
2. Per indurre l'anestesia isoflurano inalazione, inizia con il 2% di atomizzatore standard, e quindi ridurre a 1% dopo aver eseguito laparotomia. Eseguire un pizzico punta per controllare la sedazione.
3. Shave l'addome e pulire con la preparazione della pelle 3 volte (Kodan). Quindi, eseguire una incisione mediana dopo la somministrazione sottocutanea di Carprofen 5 mg / kg sc per analgesia intraoperatoria.
4. Avvolgere l'intestino destinatario in soluzione salina normale garza imbevuta e posizionarlo sul petto del destinatario.
5. Aprire il retroperitoneo senza mezzi termini con Q-tips, ed esporre la addominalinal aorta e vena cava inferiore appena sotto i vasi renali fino al livello dei vasi iliaci, se necessario anche utilizzare microforbici. Legare le tribuaries piccole e spinali lombari dal aorta e vena cava con 7-0 di seta per evitare la perdita di sangue. (Per fare questo, modificare lo zoom a 16x microscopio chirurgico.)
6. Cross-clamp l'aorta e l'IVC sotto i vasi renale sinistra prossimalmente e sopra la biforcazione iliaca distalmente con clips microcircolo. Un solo morsetto viene utilizzato prossimale e distale per serrare contemporaneamente entrambe le navi. Incidere entrambe le navi anteriormente con un microknife e lavare il sangue residuo.
7. Creare un end-to-side anastomosi tra il segmento aortico sottorenale innesto e del destinatario utilizzando un continuo 10-0 sutura Prolene .. Inizialmente, l'innesto è posto sul lato destro dell'addome (la testa del ratto posizionato a ore 12) per eseguire le maglie parete posteriore della anastomosi arteriosa e legatura della sutura soggiorno inferiore. Then, l'innesto è rivolto verso il lato sinistro dell'addome (la testa del ratto posizionato a ore 9) per esporre e suturare la parete anteriore della anastomosi.
8. Un end-to-side anastomosi tra la vena porta innesto e IVC del destinatario viene eseguita similmente eseguendo usando suture 10-0 Prolene. Con il topo ancora sdraiato lateralmente (testa in posizione ore 9), l'innesto è posizionato sul lato sinistro dell'addome e una sutura soggiorno inferiore è posto. L'anastomosi viene avviata con la parete posteriore dall'interno del recipiente. Dopo la sutura soggiorno inferiore è legato, i punti della parete anteriore può essere eseguita dall'esterno.
9. Rimuovere i morsetti distali primi, seguiti da i morsetti superiori. Qualsiasi sanguinamento anastomotica è controllata dalla pressione diretta con Q-tips. L'innesto deve essere controllata per riperfusione uguali e veloce.
10. Resecare tenue del destinatario intero dopo la legatura dei vasi mesenterici. Destinatari sottoposti enterectomia subtotale, conservando 2-3 cm di proximal digiuno e 1 cm di ileo distale.
11. Ripristinare la continuità enterica da prossimale (jejuno-digiunostomia) e distale (ileo-ileale) end-to-end anastomosi intestinali utilizzando un interrotto uno strato di 6-0 Monocryl sutura. Circa 16 punti di sutura sono necessari per completare le anastomosi.
12. Irrigare la cavità peritoneale con soluzione fisiologica fino a completa pulizia. Somministrare 2 ml di soluzione salina normale per via intraperitoneale per la sostituzione del fluido. Quindi chiudere l'addome con una sutura continua con Vicryl 3-0 per lo strato muscolare più una sutura della pelle continua.
13. Nel periodo post-operatorio i topi dovrebbero essere tenuti a digiuno (con accesso ad acqua e una soluzione di glucosio) per un altro 24 h quindi riavviato sul ratto chow standard e acqua ad libitum. Analgesia con carprofen deve essere somministrato per 3 giorni (vedi dosi di seguito).

Normale decorso post-operatorio

Gli animali trapiantati dovrebbero recuperare rapidamente dalla procedura di cui una lampada di calore per circa 1 ora. L'ipotermia è una delle principali cause di mortalità postoperatoria e deve essere accuratamente evitata intra-e post-operatorio. Perdite di liquidi intraoperatori deve essere sostituito con un'iniezione sottocutanea di 2,5 ml di soluzione salina normale, più 2,5 ml di glucosio al 5% ogni 8 ore per le prime 24 ore. I ratti dovrebbero avere libero accesso a una soluzione di glucosio (o dieta gel) e l'acqua po per le prime 24 ore dopo l'intervento. Dopo questo periodo si dovrebbe riprendere il normale comportamento alimentare con libero accesso a cibo ratto standard e acqua ad libitum. Dolore è controllata dalla somministrazione di carprofen 5 mg / kg sc giorno per tre giorni, con il primo colpo da somministrare a induzione dell'anestesia. Profilassi antibiotica perioperatoria è necessaria solo in ambiente allogenico, e può essere somministrata in 5-7 giorni (ampicillina 15 mg / kg sc, q. 12 hr). Generaleaspetto, condizione di pelliccia e l'aspetto della mucosa dovrebbe essere normale. Dopo il POD 1 il livello di attività dovrebbe tornare allo stato pre-operatorio, un comportamento anomalo o apathic suggerisce complicanze precoci chirurgiche. Dopo la perdita iniziale fino al 20% del peso corporeo dei ratti inizierà ad aumentare di peso di nuovo in giro per giorno post-operatorio 6-8 e avrà raggiunto circa il 90% del loro peso pre-operatoria, normalmente, a giorno post-operatorio 14 (nel setting isogenico senza rigetto).

Le complicanze postoperatorie

Come affermato in precedenza, l'addome gonfio, comportamento apathic, interruzione di alimentazione e di variazioni di aspetto generale (fur arruffato, secrezione dagli occhi) devono essere considerati come sintomi di possibili complicazioni. Gli animali devono essere visti dal chirurgo e un veterinario. Condizioni come la disidratazione, stato infiammatorio a causa di una peritonite, a causa della stenosi della anastomosi ileo intestinale, farmaci antidolorifici insufficiente e gli altri devono essere la regolad e trattata. Se l'animale non recupera, nonostante il trattamento, la sospensione del esperimento deve essere valutata caso per caso a seconda delle norme di esperimenti con gli animali.

Figura 1a. Strumenti.
1. Microscopio (LEICA)
2. Anestesia apparecchi (EICKEMEYER)

Figura 1b. Strumenti.
3. Rasoio
4. Bisturi elettronico (GEIGER)
5. Pinza chirurgica
6. DeBakey pinza curva
7. Pinze curve piccolo
8. Micro pinza curva
9. Micro pinza dritto 1
10. Micro pinza diritto 2
11. Micro supporto dell'ago
12. Porta aghi
13. Mosquito morsetto
14. Forbici 1
15. Forbici 2
16. Microforbici
17. Micro Bisturi

Figura 1c. Strumenti.
18. Microclamps
19. Cannule e Q-Tips (non raffigurato)
20. Siringhe (50 ml, 10 ml, 2,5 ml, 1 ml)

Figura 1c. Strumenti.
21. Soluzione UW per stoccaggio graft
22. Antibiotici (Uro-nebacetin N) per l'irrigazione lumen innesto
23. UW per la perfusione innesto
24. Salina normale
25. Piatto con soluzione fisiologica (per backtable)

Figura 2. Peso medio post-operatorio (dati cumulativi). La figura 2 mostra il peso medio postoperatorio dopo ortotopico intestino tenue. Dopo la perdita iniziale fino al 20% del peso corporeo dei ratti iniziare ad ingrassare nuovamente intorno giornata postoperatoria 6-8 ed avrà raggiunto il 90% della loro preoppeso perativa normalmente intorno giorno post-operatorio 14 (nell'impostazione isogenico senza rigetto / immunosoppressione). Figura 2 rappresenta i dati di perdita di peso, non sopravvivenza, la diminuzione del numero di animali disponibili per misurare la perdita di peso è dovuta principalmente alla sacrifing di animali per gli esperimenti.

Figura 3. Il tessuto pancreatico (freccia) deve essere rimosso dal colon.

Figura 4. Dopo ligazione e dividendo il tessuto connettivo perde compresi tutti linfatici tra SMV e l'aorta addominale, l'arteria renale destra (freccia) è diviso tra legature seta.

Figura 5. Perfusione dell'innesto con soluzione UW attraverso il condotto aortica.

Figura 6. Dopo la preparazione del destinatario della vena cava e aorta i vasi sono esposti, pronti per il bloccaggio.

Figura 7. Morsetto a croce viene eseguita su vena cava e aorta contemporaneamente utilizzando microclamps.

Figura 8. (A) Il aorto-aortico anastomosi viene eseguita utilizzando suture. (B) Dopo il completamento della anastomosi aorto-aortico, l'anastomosi portocaval verrà effettuata successivo. La sutura soggiorno inferiore è già in atto.

Figura 9. (A) L'anastomosi portocaval viene avviato dopo la sutura secondo soggiorno è a posto. (B) dopo completion dell'anastomosi portocaval.

Figura 10. Dopo la rimozione delle pinze dell'innesto reperfuses bene.

Figura 11. (A) posizionamento di suture per l'anastomosi intestinale. (B) Completato anastomosi intestinale.

Mentre i modelli di trapianto intestinale nel ratto sono stati descritti già nel 1970ies ⁵ più dei modelli di recente attività subordinate coinvolgere eterotopico trapianto di intestino con tecniche diverse ^13. Mentre le procedure eterotopiche in generale hanno il vantaggio di tecniche microchirurgiche più facile accessibilità dell'innesto di valutazione, eterotopico trapianto di intestino ha il grande svantaggio di non prendere in considerazione le interazioni multiple del piccolo intestino trapiantato e suoi aspetti funzionali come attività contrattile e funzione barriera della mucosa che caratterizza un trapianto ortotopico nel contesto di una vasta schiera di commensali e patogeni. Il nostro gruppo ha maturato una grande esperienza con il modello qui descritto ortotopica ed i nostri risultati suggeriscono che molte delle specifiche alterazioni causate da risposte immunitarie infiammatorie e adattamento devono essere valutati nel contesto del pro funzionaleprietà dell'intestino trapiantato di piccole dimensioni come la contrattilità e l'integrità della mucosa. Da notare, le tecniche impiegate qui anastomotiche non includono l'uso di polsini arteriosi o venosi, alcuni dei quali sono stati indicati per facilitare la procedura e ridurre il tempo critico ischemia calda, specialmente in modelli di trapianto multiviscerale ^12,14. Anche se può essere necessario impiegare tecniche polsino in modelli di roditori di multiviscerale trapianto, il potenziale complicanti dei polsini ci ha portato ad evitare tecniche simili in questo modello unico di trapianto intestinale. Non abbiamo tentato di utilizzare le tecniche di drenaggio portale in questo modello. Oltre ad essere tecnicamente impegnativo (il piccolo diametro della vena porta potrebbe causare problemi di deflusso venoso), che renderebbe l'intero modello più difficile stabilire - è un fatto che in clinica drenaggio trapianto di intestino sistemica viene utilizzato nella maggior parte dei casi. Pertanto, la tecnica descritta reflette pratica clinica combinata con la fattibilità tecnica. Drenaggio Portale degli innesti non ha mostrato di essere associato con risultati superiori in diversi studi clinici e sperimentali ^2,4. Tempi di ischemia sufficientemente brevi di circa 35 minuti necessari per la sopravvivenza degli animali stabile può essere ottenuto dopo il completamento della curva di apprendimento per questo modello.

Ortotopico trapianto di intestino tenue in base a questo protocollo può essere appreso da un ricercatore esperto microchirurgica dopo aver eseguito le procedure di circa 30-40. La visualizzazione come ottenuto dal formato JoVE consente osservazione visiva diretta e riproduzione accurata delle tecniche impiegate che porta eventualmente alla rapida costituzione del metodo e sacrificio animale inferiore. I punti critici sono il sanguinamento, tempo di ischemia calda e fredda e l'intestino insufficienza stenosi anastomotica /. Il tempo di ischemia fredda in questa impostazione sperimentale non è così fondamentale come caldo ischetempo mia, ma non deve superare i 45 minuti. Il tempo di ischemia calda dovrebbe essere di circa 35 minuti e, inoltre, non superiore a 45 minuti, in quanto ciò potrebbe causare una maggiore mortalità postoperatoria. Il donatore ideale e il peso del destinatario è di circa 200 g, perché più piccoli ratti non tollerano la procedura di bene e di peso superiore a 300 g è associato con eccessiva di grasso intra-addominale. I ratti perdere fino al 20% del peso corporeo nel periodo postoperatorio diretta ma dovrebbe iniziare ad aumentare di peso dopo 6-8 giorni dall'intervento (Figura 2). Controlli sanitari giornalieri (attenzione, la pelliccia e l'aspetto della mucosa, peso, qualità delle feci e la frequenza) deve essere effettuata fino a quando l'animale viene sacrificato. Si consiglia la somministrazione giornaliera di antibiotici e analgesia per almeno i primi tre giorni come descritto sopra. Dopo pratica iniziale, in particolare del microvascolare e anastomosi intestinali, questo modello fornisce affidabile e stabile sopravvivenza a lungo termine di circa il 80-90% in ambito isogenico. Nel allogeimpostazione sopravvivenza nic è generalmente inferiore, dipende principalmente fenomeni immunologici come rigetto acuto e cronico e possono variare ampiamente a seconda del regime immunosoppressivo utilizzato e testato.

Note tecniche: Il tempo di funzionamento donatore dovrebbe essere di circa 45 minuti. L'operazione destinatario non deve superare gran 1,5 ore. Un blocco di riscaldamento deve essere utilizzato di routine per evitare l'ipotermia nel ricevente. Per un facile accesso vascolare, la vena caudale laterale del destinatario può essere incannulata all'inizio della procedura tramite un catetere endovenoso G 22. Irrigazione del lume intestinale, come sopra descritto non può essere necessario, omettendo questo passaggio è a nostra conoscenza effetti negativi sul risultato e mortalità.

Requisiti di studio degli animali: Gli animali sono stati tenuti secondo le leggi applicabili e dei regolamenti della Repubblica federale di Germania, Stato Renania Settentrionale-Vestfalia. I numeri del documento in base al quale tche gli esperimenti sono stati approvati possono essere richieste l'autore corrispondente.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.