Orthotopique transplantation d'intestin grêle chez le rat

Transplantation d'intestin grêle est devenue une option thérapeutique reconnue pour les patients atteints d'insuffisance intestinale irréversible. Notre modèle expérimental de transplantation de l'intestin chez les rats petite orthotopique est un outil fiable pour répondre immunologique sous-jacente et les processus inflammatoires qui compliquent la transplantation intestinale.

Transplantation d'intestin grêle est devenue une option clinique acceptée pour les patients atteints du syndrome de l'intestin court et l'échec de la nutrition parentérale (insuffisance intestinale irréversible). Dans les centres spécialisés amélioration opérationnelle et les stratégies de gestion ont conduit à un excellent court et à moyen terme patient et la survie du greffon tout en offrant une qualité de vie élevée ^1,3. Contrairement à la transplantation plus fréquente d'autres organes solides (c.-à-cœur, le foie), de nombreux mécanismes sous-jacents de la fonction du greffon et des modifications immunologiques induites par la transplantation intestinale ne sont pas entièrement connues ^6,7. Les épisodes de rejet aigu, septicémie et l'insuffisance chronique du greffon sont les principaux obstacles encore qui contribuent à moins favorable des résultats à long terme et d'entraver un emploi plus répandu de la procédure en dépit d'un nombre croissant de patients sous nutrition parentérale à domicile qui pourraient potentiellement bénéficier d'une telle greffe. L'intestin grêle contientun grand nombre de leucocytes passagers communément appelé dans le cadre de l'intestin système lymphoïde associé (GALT), cette partie étant la raison de la forte immunogénicité du greffon intestinal. La présence et la proximité de nombreux commensaux et pathogènes dans l'intestin, explique la sévérité des épisodes de septicémie fois greffe intégrité de la muqueuse est compromise (par exemple par le rejet). Pour faire avancer le domaine de l'informatique intestinales et la transplantation multiviscérale plus générés à partir de modèles animaux fiables et réalisables est nécessaire. Le modèle proposé ici combine à la fois la fiabilité et la faisabilité une fois établi dans une manière normalisée et peuvent fournir de précieuses informations sur les sous-jacents complexes moléculaires, les mécanismes cellulaires et fonctionnels qui sont déclenchés par transplantation intestinale. Nous avons utilisé avec succès et affiné la procédure décrite depuis plus de 5 ans dans notre laboratoire ^8-11. Le JoVE basé sur la vidéo format est particulièrement utile pour démontrer la procédure complexeDure et éviter les pièges initiaux pour les groupes envisagent d'établir un modèle de rongeur orthotopique enquête transplantation intestinale.

1. Fonctionnement des bailleurs de fonds

1. Le rat donneur doit rester à jeun pendant 24 heures (accès libre à l'eau / solution de glucose).
2. Pour induire une anesthésie par inhalation isoflurane, commencez avec 2% pulvérisateur standard, puis réduire à 1% après avoir effectué une laparotomie. Effectuer un pincement de l'orteil pour vérifier la sédation.
3. Raser l'abdomen et le nettoyer avec préparation de la peau 3 fois (Kodan). Effectuez ensuite une incision médiane après administration sous-cutanée de l'analgésique.
4. Après la greffe est enveloppé dans de la gaze imbibée salée, séparer les adhérences physiologiques entre le pancréas et du côlon ascendant délicatement avec un coton-tige (sous le microscope chirurgical avec un grossissement de 6x).
5. Ligaturer et diviser les vaisseaux coliques iléo-cæcaux et droite et centre en utilisant 7-0 soie. Après le côlon ascendant est étalée sur le côté droit de la veine mésentérique supérieure (VMS), les vaisseaux coliques iléo-cæcaux, droite et centrale peuvent être identifiées pour la ligature et la division en utilisant 7-0 liens.
6. Rétracter l'estomac vers le haut, de sorte que l'ensemble de SMV est redressé et exposée. Utilisez une pince moustique de rachat. La pince est maintenue en masse à modeler mis en forme selon les besoins.
7. Ligaturer et diviser les veines pancréatico-duodénaux en provenance du SMV. Toutes les petites veines pancréatico-duodénaux provenant du SMV doit être soigneusement identifiée, ligaturé avec 7-0 soie et divisé avant que le tissu pancréatique peut être retiré de la greffe.
8. Ligaturer et diviser le tissu conjonctif perdent y compris tous les vaisseaux lymphatiques entre le SMV et de l'aorte abdominale. Avec la greffe toujours sur le côté droit de l'abdomen, la perte du tissu conjonctif, y compris tous les vaisseaux lymphatiques entre le SMV et de l'aorte abdominale est accessible. Ce tissu conjonctif doit être ligaturés en utilisant 7-0 soie et divisée pour éviter lymphorrhée postopératoire du greffon intestinal.
9. Ligaturer et de diviser l'artère rénale droite. Après le tissu conjonctif est divisé, l'artère rénale droite est accessible et est ligaturée et sectionnée en utilisant 7-0 soie.
10. Systémique heparinise le rat en utilisant 200 unités d'héparine iv dans la veine du pénis.
11. Ligaturer les artères marginales, et de diviser l'intestin grêle à la jonction duodéno-jéjunale et à l'iléon terminal.
12. L'aorte est ligaturé proximale à l'origine de la SMA. La veine porte est découpée à la confluence avec la veine splénique. Puis le greffon est récolté avec son pédicule vasculaire composé du SMA avec un segment aortique.

2. Procédure Backtable

1. Perfuser le greffage utilisant 3 ml de solution de l'Université du Wisconsin (UW) à 4 ° C par l'intermédiaire du conduit aortique et irriguer la lumière intestinale à partir de la fin du jéjunum avec 30 ml d'Uro-Nebacetin solution de N à 4 ° C (lumen d'irrigation est obligatoire) .

Immédiatement après l'extraction de la greffe, le conduit aortique est utilisé pour la perfusion avec 3 ml solution UW réfrigérés. Pour cela, un cathéter 20 G iv surune seringue de 10 ml est utilisé. La perfusion doit être observé pour s'écouler librement de la veine porte divisée. Pour l'irrigation intestinale avec Nebacetin, une seringue de 50 ml est utilisé.

2. Stocker le greffage en solution UW à 4 ° C au cours de la préparation du destinataire.

3. Fonctionnement du destinataire

1. Le rat receveur doit rester à jeun pendant 24 heures (accès libre à l'eau / solution de glucose).
2. Pour induire une anesthésie par inhalation isoflurane, commencez avec 2% pulvérisateur standard, puis réduire à 1% après avoir effectué une laparotomie. Effectuer un pincement de l'orteil pour vérifier la sédation.
3. Raser l'abdomen et le nettoyer avec préparation de la peau 3 fois (Kodan). Effectuez ensuite une incision médiane après administration sous-cutanée de carprofène 5 mg / kg sc peropératoire analgésie.
4. Enroulez le destinataire dans l'intestin normal de gaze imbibée solution saline et le placer sur la poitrine du destinataire.
5. Ouvrez le rétropéritoine carrément avec Q-tips, et exposer le abdominal aorte et la veine cave inférieure juste au-dessous des artères rénales vers le bas au niveau des vaisseaux iliaques, le cas échéant également utiliser microciseaux. Ligaturer les tribuaries petites lombaires et la colonne vertébrale de l'aorte et la veine cave en utilisant 7-0 soie pour éviter la perte de sang. (Pour ce faire, modifiez le zoom à 16x microscope chirurgical.)
6. Clampage de l'aorte et la veine cave inférieure au-dessous des vaisseaux rénaux proximal gauche et au-dessus de la bifurcation iliaque distal à l'aide des clips de microvaisseaux. Une seule pince est utilisée proximale distale ainsi que pour serrer les deux navires simultanément. Inciser les deux navires antérieurement en utilisant un microknife et laver le sang restant.
7. Créer une anastomose termino-latérale entre le segment aortique et aorte greffé le destinataire à l'aide d'un fil de suture continue 10-0 Prolene .. Initialement, le greffon est placé sur le côté droit de l'abdomen (la tête du rat placé à 12 heures) pour effectuer les points paroi arrière de l'anastomose artérielle et attachant de la suture inférieure séjour. Then, le greffon est mis sur le côté gauche de l'abdomen (la tête du rat placé à 9 heures) afin d'exposer et de suturer la paroi avant de l'anastomose.
8. Une anastomose termino-latérale entre la veine porte et IVC greffé du destinataire s'effectue également à l'aide de fils de suture en cours d'exécution 10-0 Prolene. Avec le rat fixes situées sur le côté (tête en position 9 heures), le greffon est positionné sur le côté gauche de l'abdomen et une suture inférieure séjour est placé. L'anastomose est démarré avec la paroi arrière de l'intérieur du récipient. Après la suture inférieure séjour est liée, les points paroi avant peut être effectuée à partir de l'extérieur.
9. Retirer les pinces distales d'abord, puis par les pinces supérieures. Tout saignement anastomotique est contrôlée par la pression directe à l'aide de coton-tiges. Le greffon doit être vérifiée reperfusion égale et rapide.
10. Réséquer l'intestin grêle du destinataire entière après la ligature des vaisseaux mésentériques. Les bénéficiaires subissent entérectomie montant, la préservation de 2-3 cm de projéjunum ximal et 1 cm d'iléon distal.
11. Rétablir la continuité entérique par proximale (jéjuno-jéjunostomie) et distale (iléo-iléostomie) de bout en bout à l'aide d'une anastomose intestinale interrompu une couche de suture avec 6-0 Monocryl. Environ 16 points de suture sont nécessaires pour compléter les anastomoses.
12. Rincer la cavité péritonéale avec une solution saline normale jusqu'à ce que propre. Administrer 2 ml de sérum physiologique par voie intrapéritonéale pour le remplacement des liquides. Ensuite, fermez l'abdomen à l'aide d'un surjet de Vicryl 3-0 avec la couche musculaire en plus d'une suture cutanée continue.
13. Dans la période postopératoire, les rats doivent être conservés à jeun (avec accès à l'eau et une solution de glucose) pour un autre h 24 puis redémarré le rat standard chow et eau ad libitum. Analgésie avec carprofène doit être administré pendant 3 jours (voir posologie ci-dessous).

Cours normal des activités post-opératoire

Les animaux transplantés devrait se remettre rapidement de la procédure sous une lampe chauffante pendant environ 1 h. L'hypothermie est une cause majeure de mortalité postopératoire et doit être soigneusement évité intra-et postopératoire. Pertes liquidiennes intra-opératoires doivent être remplacés par injection sous-cutanée de 2,5 ml solution saline normale et de 2,5 ml de glucose 5% tous les 8 heures, pendant les 24 premières heures. Les rats doivent également avoir accès gratuitement à une solution de glucose (ou un régime de gel) et de l'eau par voie orale pendant les 24 premières heures postopératoires. Après cette période, ils doivent retrouver un comportement alimentaire normal avec un accès gratuit à rat standard chow et eau ad libitum. La douleur est contrôlée par l'administration du carprofène 5 par jour mg / kg sc pendant trois jours, du premier coup doit être administré à l'induction anesthésique. Antibioprophylaxie péri-opératoire n'est nécessaire que dans le cadre allogénique, et peut être administré au cours des jours 5-7 (ampicilline 15 mg / kg sc, q. 12 h). Généralapparence, l'état de la fourrure ainsi que l'apparence muqueuse devrait être normal. Après le POD 1 le niveau d'activité devrait revenir à l'état pré-opératoire, le comportement apathique ou anormal suggère des complications chirurgicales début. Après la perte initiale pouvant aller jusqu'à 20% du poids corporel chez les rats vont commencer à prendre du poids à nouveau autour du jour postopératoire 6-8 et aura atteint près de 90% de leur poids préopératoire normalement autour du jour postopératoire 14 (dans le cadre isogénique sans rejet).

Les complications postopératoires

Comme indiqué plus haut, un abdomen distendu, le comportement apathique, l'arrêt de l'alimentation et des changements dans l'apparence générale (fourrure ébouriffée, la sécrétion des yeux) doivent être considérés comme des symptômes de complications possibles. Les animaux doivent être vus par le chirurgien et un vétérinaire. Conditions comme la déshydratation, état inflammatoire due à une péritonite, due à une sténose de l'anastomose du côlon iléus, insuffisance de médicaments contre la douleur et d'autres doivent être la règled et traitée. Si l'animal ne se rétablit pas malgré le traitement, l'arrêt de l'expérience doit être évaluée au cas par cas en fonction de l'application des règlements expérimentation animale.

Figure 1a. Instruments.
1. Microscope (LEICA)
2. Appareil d'anesthésie (Eickemeyer)

Figure 1b. Instruments.
3. Rasoir
4. Bistouri électronique (GEIGER)
5. Pinces chirurgicales
6. DeBakey Pince recourbée
7. Pince courbes petite
8. Micropincettes courbe
9. Micro Pince droite 1
10. Micro Pince droite 2
11. Porte-aiguille micro
12. Porte-aiguille
13. Pince Mosquito
14. Ciseaux 1
15. Ciseaux 2
16. Microciseaux
17. Micro Scalpel

Figure 1c. Instruments.
18. Microclamps
19. Canules et Q-Tips (non représenté)
20. Seringues (50 ml, 10 ml, 2,5 ml, 1 ml)

Figure 1c. Instruments.
21. Solution UW pour le stockage de greffage
22. Antibiotiques (Uro-nebacetin N) pour l'irrigation lumière du greffon
23. UW pour la perfusion du greffon
24. Une solution saline normale
25. Vaisselle avec du sérum physiologique (pour backtable)

Figure 2. Poids moyen post-opératoire (données cumulées). La figure 2 montre le poids moyen post-opératoire après transplantation orthotopique du côlon petite. Après la perte initiale pouvant aller jusqu'à 20% du poids corporel chez les rats commencent à prendre du poids à nouveau autour du jour postopératoire 6-8 et aura atteint 90% de leur pré-opératoirerative poids normalement autour du jour postopératoire 14 (dans le cadre isogénique sans rejet / immunosuppression). Figure 2 représente les données de perte de poids, pas de survie, la diminution du nombre d'animaux disponibles pour mesurer la perte de poids est principalement due à sacrifing d'animaux pour des expériences.

La figure 3. L'tissu pancréatique (flèche) doit être présente dans le côlon.

Figure 4. Après ligature et en divisant le perdre tissu conjonctif, y compris tous les vaisseaux lymphatiques entre SMV et de l'aorte abdominale, l'artère rénale droite (flèche) est divisé entre les ligatures de soie.

Figure 5. Perfusion du greffon avec une solution UW par le conduit aortique.

Figure 6. Après la préparation du destinataire veine cave et de l'aorte les vaisseaux sont exposés, prêt pour le serrage.

Figure 7. Croix pince est effectuée sur la veine cave et de l'aorte en utilisant simultanément microclamps.

Figure 8. (A) L'anastomose aorto-aortique est effectuée en utilisant des sutures séjour. (B) Après l'achèvement de l'anastomose aorto-aortique, l'anastomose porto-cave sera effectuée suivant. La suture séjour inférieur est déjà en place.

Figure 9. (A) L'anastomose porto-cave est démarré après la suture second séjour est en place. (B) Après completion de l'anastomose porto-cave.

Figure 10. Après avoir enlevé les pinces du greffon reperfuses bien.

Figure 11. (A) Placement de sutures de fixation pour l'anastomose du côlon. (B) Terminé anastomose intestinale.

Bien que les modèles de transplantation intestinale chez le rat ont été décrits dès le ⁵ 1970ies dans la plupart des modèles récemment utilisés impliquent hétérotopique transplantation intestinale en utilisant des techniques différentes ^13. Bien que les procédures hétérotopiques en général ont l'avantage de techniques de microchirurgie plus facile et plus facile accessibilité de la greffe d'évaluation, hétérotopique transplantation intestinale a le gros inconvénient de ne pas prendre en compte les interactions multiples de l'intestin transplanté petite et ses aspects fonctionnels tels que l'activité contractile et la fonction de barrière muqueuse qui caractérise une greffe orthotopique dans le cadre d'un hôte majorité des commensaux et pathogènes. Notre groupe a acquis une grande expérience avec le modèle orthotopique décrit ici, et nos résultats suggèrent que la plupart des altérations spécifiques causés par inflammatoires et la réponse immunitaire adaptative doivent être évalués dans le contexte de la pro fonctionnellepriétés de l'intestin transplanté petit comme la contractilité et l'intégrité des muqueuses. Fait à noter, les techniques employées anastomotiques ici ne comprennent pas l'utilisation de menottes artérielles ou veineuses, dont certains ont été présentés afin de faciliter la procédure et de réduire le temps d'ischémie critique chaud, surtout dans des modèles de transplantation multiviscérale ^12,14. Bien qu'il puisse être nécessaire de recourir à des techniques manchette dans des modèles rongeurs de transplantation multiviscérale, le potentiel complicative des poignets nous a conduit à éviter les techniques similaires à ce modèle de transplantation intestinale unique. Nous n'avons pas tenté d'utiliser des techniques de drainage portail dans ce modèle. En plus d'être techniquement difficile (le diamètre petit portail veine pourrait conduire à des problèmes de drainage veineux), ce qui rendrait l'ensemble du modèle plus difficile à établir - c'est un fait que, dans de drainage intestinal transplantation clinique systémique est utilisé dans la majorité des cas. Ainsi, la technique décrite reflets pratique clinique associé à la faisabilité technique. Portail de drainage des greffons n'a pas été démontré d'être associé à des résultats supérieurs dans plusieurs études cliniques et expérimentales ^2,4. Fois ischémie suffisamment courts d'environ 35 minutes nécessaires pour la survie des animaux stable peut être obtenu après l'achèvement de la courbe d'apprentissage pour ce modèle.

Orthotopique transplantation d'intestin grêle selon ce protocole peut être appris par un chercheur expérimenté microchirurgicalement après chaque opération d'environ 30-40. La visualisation réalisée par la forme JoVE permet l'observation visuelle directe et une reproduction précise des techniques employées qui mène éventuellement à la mise en place rapide de la méthode et le sacrifice des animaux de moins. Les points critiques sont les hémorragies, le temps d'ischémie chaude et froide et de l'intestin insuffisance anastomotique sténose /. Le temps d'ischémie froide dans ce cadre expérimental n'est pas aussi crucial que chaude ischetemps mia mais ne devrait pas dépasser 45 minutes. Le temps d'ischémie chaude doit être d'environ 35 minutes et de ne pas dépasser 45 minutes, ce qui pourrait entraîner une augmentation de la mortalité post-opératoire. Le donneur idéal et le poids destinataire est d'environ 200 g parce que les petits rats ne tolèrent pas bien la procédure et le poids de plus de 300 g est associé à la graisse intra-abdominale excessive. Les rats perdre jusqu'à 20% du poids du corps dans la période post-opératoire directe, mais devrait commencer à prendre du poids à nouveau après 6-8 jours après l'opération (figure 2). Bilans de santé quotidiens (vigilance, de la fourrure et l'apparence muqueuse, le poids, la qualité et la fréquence des selles) doit être effectuée avant que l'animal est sacrifié. Nous recommandons l'administration quotidienne d'antibiotiques et d'analgésiques pendant au moins les trois premiers jours, comme décrit ci-dessus. Après la pratique initiale, en particulier de l'intestin anastomoses microvasculaires et, ce modèle offre fiable et stable survie à long terme de l'ordre de 80-90% dans le cadre isogénique. Dans le allogesurvie réglage nique est généralement plus faible, dépend principalement de phénomènes immunologiques telles que le rejet aigu et chronique et peut varier considérablement en fonction du traitement immunosuppresseur utilisé et testé.

Notes techniques: La durée de fonctionnement des bailleurs de fonds devrait être d'environ 45 minutes. L'opération bénéficiaire ne devrait pas beaucoup dépasser 1,5 heures. Un coussin chauffant devrait être utilisé régulièrement pour éviter l'hypothermie chez le receveur. Pour faciliter l'accès vasculaire, la veine latérale de la queue de la canule peut être destinataire au début de la procédure à l'aide d'un cathéter intraveineux G 22. Irrigation de la lumière intestinale, telles que décrites ci-dessus peut ne pas être nécessaire, en omettant cette étape a à notre connaissance aucun effet négatif sur les résultats et la mortalité.

Exigences de l'étude des animaux: Les animaux sont maintenus en fonction de l'application des lois et règlements de la République fédérale d'Allemagne, État Rhénanie du Nord-Westphalie. Les numéros des documents en vertu de laquelle til expérimentations ont été approuvés peut être demandé à l'auteur correspondant.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.