Kolonizasyon Euprymna scolopes Squid tarafından Vibrio fischeri

Yöntemine göre Hawaiian Bobteylleri squid prosedür özetlenmektedir Euprymna scolopes Ve bakteriyel symbiont, Vibrio fischeri, Bakteriler tarafından kalamar ışık organın belirli kolonizasyon için izin tanıtıldı ayrı ayrı, sonra yükseliyor. Bakteriyel kaynaklı lüminesans ve doğrudan koloni sayımı ile kolonizasyon tespit açıklanmıştır.

Spesifik bakteri hayvan dokusu ^1-5 ile birlikte bulunur. Böyle ana-bakteriyel dernekler (symbioses) (patojen) zararlı olabilir, hiçbir spor sonucu (ortakçı), ya da (mutualist) faydalı olabilir. Çok dikkat patojen etkileşimleri verilmiş olsa da, biraz ortamdan ortakçı / yararlı bakterilerin tekrarlanabilir satın dikte süreçleri hakkında bilinmektedir. Deniz Gram-negatif bakteri arasında ışık organı karşılıkçılık V. fischeri ve Hawai Bobteyli kalamar, E. scolopes, bir ana (E. scolopes) ömrü ^6,7 boyunca yalnızca bir bakteri türü (V. fischeri) ile simbiyotik bir ilişki kurar ki bir çok spesifik bir etkileşim gösterir. V. tarafından üretilen Biyolüminesens Bu etkileşim sırasında fischeri E. bir anti-yırtıcı yarar sağlar nokturnal faaliyetleri sırasında scolopes ^8,9 ikenbesin açısından zengin konak doku sağlar V. Korumalı bir niş ¹⁰ fischeri. Her ana üretimi sırasında, bu ilişki dolayısıyla simbiyotik gelişiminin çeşitli aşamalarında ayrıntılı bir biçimde tespit edilebilir, öngörülebilir bir süreci temsil değinmeyecek edilir. İlk 30-60 dakika içinde toplanan ve symbiont-serbest su transfer edilirse laboratuarda, yavru kalamar ambar aposymbiotically (uncolonized), ve, deneysel inokulum ⁶ dışında kolonize olamaz. Bu etkileşim, böylece çevreye ^11,12 bir simbiyotik mikrop spesifik kazanım yol tek tek adımların değerlendirmek için yararlı olan bir model sistemi sağlar.

Burada yeni aposymbiotic E. yumurtadan oluşur kolonizasyon derecesini değerlendirmek için bir yöntem tarif scolopes (yapay) deniz suyu içeren maruz V. fischeri. Bu basit test aşılama, doğal enfeksiyon ve kurtarma açıklarE. doğmakta olan ışık organ bakteriyel symbiont arasında scolopes. Bakım özellikle su kalitesi ve ışık işaretleri ile ilgili, simbiyotik gelişim sırasında hayvanlar için tutarlı bir ortam sağlamak için alınır. Açıklanan simbiyotik nüfus karakterize etmek Yöntemleri bakteriyel kaynaklı biyolüminesensin (1) ölçümü ve geri symbionts sayımı (2) doğrudan koloni bulunmaktadır.

1. Bakteriyel inokulum hazırlanması

1. Gün 0
   Kalamar aşılama, plaka LBS konusunda ilgili bakteri suşlarının ¹³ agar öncesinde iki gün.
2. 25-28 ° C'da bakteri inkübe edin.
3. 1. Gün
   Her biri V. koloni olan bir cam tüp içinde kültür ortamı 3 ml LBS inoküle Enfeksiyon için fischeri suşu. Yedek olarak tüpleri yinelenen hazırlayın.
4. 2. Gün
   (Kalamar adımları 3,7-3,10 bakteriyel adımları 1,4-1,6 Koordinat)
   Önce aşılama için 1 saat, altkültür bakteri cam bir kültür tüpünün 3 ml LBS içine 1:80 (37.5 ul) ve havalandırma ile 1 saat boyunca büyür.
5. Aşılama öncesi örnek OD ₆₀₀ ölçün. Tipik ölçümler 0.3-0.6 zorlamaya bağlı edilir.
6. İnokulum hacmi (ul) = 1.25 / OD _60: 3-5 x hedef inokulum için 10 ³ CFU / ml şöyle inokulum hacim hesaplamak0 (örn., OD ₆₀₀ için = 0.5, hesaplanan inokulum hacim = 1.25/0.5 = 2.5 ul). Bu miktar, Basamak 4.1 'de squid içeren deniz suyu direkt olarak eklenir. Bu hesaplama V. farklı suşları için ayarlanması gerekebilir fischeri veya burada belirtilenden daha düşük veya daha yüksek seviyelerde aşılama için.

2. Inokulum sayımı için Agar Plakalarının Hazırlanması

1. Her tedavi için, Adım 4.1 inokulum plaka örnekleri etiketi LBS plakalar (tedavi başına 2).
2. Plaka başına 5 steril kaplama boncuk ekleyin.

3. Squid Juveniles Koleksiyonu

1. Refraktometre kullanılarak Anında Okyanusu'nun tuzluluk ölçün ve 35 ‰ ayarlamak.
2. Filtre ile sterilize Instant Ocean (FSIO) oluşturmak için, filtrasyon ünitesi ve bağlı bir vakum hattı veya vakum pompası kullanılarak Instant Ocean 1 L filtre. Her dağıtım için şiddetle öncesinde dönen tarafından oksijen su. The filtre ünitesi 2 gün boyunca yeniden kullanılabilir.
3. Iki (2) tek kullanımlık numune kapları her birine kısım FSIO 40-50 ml. Etiket En erken gibi bir ve timelies olarak bir.
4. Pipet düşük sırtlar yukarıda ucundan yaklaşık 1 cm, (bkz. Şekil 3) keserek juvenil kalamar elde etmek için plastik transferi pipetler fazlalığı hazırlayın. Bu kalamar koleksiyon üzerine geçebileceği daha geniş bir alanda kolaylaştırır. Kaba bir yüzeyidir var olduğu herhangi bir transfer pipetler atın.
5. Hazırlanan transferi pipetler kullanarak, E. toplamak gece hilesine karşı FSIO En erken kase aktardığınız scolopes. Erken yavruların 1 üzerinde saat yumurta sisteminde olmuştur ve kontamine kolonizasyon yatkındır var V. Yumurta sisteminde fischeri. Hassas kolonizasyon deneyler için En erken kullanmayın.
6. Yumurta tankları yeni yavru için her 30-45 dakika kontrol edin. Tüm yavruların her c sırasında temizlenmiş olduğundan emin olunhalt. FSIO ve timelies kaseye bir transfer pipet, ve mevduat ile yavru çıkarın. Zamanında toplanan Hayvan kolonizasyon deneyler için kullanılabilir.
7. Koleksiyon tamamlandığında (~ 45 dk gün battıktan sonra), ana laboratuvara kalamar aktarın. Ampirik olarak o 3 saat aşılar için kesintisiz laboratuvar ışık koşulları altında hayvanların kolonize avantajlıdır.
8. Her tedavi için, 40 ml FSIO bir kabın hazırlamak. (Maksimum n = 40 kase başına) deneyi için kaselere kalamar ekleyin.
9. Bir aposymbiotic (negatif) kontrol olarak ek bir kapta hazırlayın.
10. Her tedavi için özel bir aktarım pipet hazırlayın.
11. % 2 etanol ilave kalamar Euthanize.

4. Squid Kolonizasyon

1. Gün 2 - P10 Pipetman kullanarak, her bir tedavi için her kalamar kase (Adım 3.8) bakterilerin hesaplanan kısım (Adım 1.5) akıtın. Hemen sonra 3 saat Sayacı başlatİlk inokulasyon.
2. Her tedavi için, kabın kenarına yakın pipet yerleştirmek ve yaklaşık 10 saniye boyunca su ve kalamar karıştırmak için sürekli yukarı ve aşağı pipetleme tarafından atanmış transferi pipetle kabın içinde bir "vorteks" oluşturmak. Tam karıştırma önemlidir.
3. Adım 2.2 bir LBS agar üzerine her kase Tabak 50 ul (teknik, tedavi başına plaka iki 50 ul plaka çoğaltır). 25-28 ° C de bir gece inkübe edin.
4. Her tedavi için yıkama kase (100 ml FSIO / adet) hazırlayın.
5. Her kalamar için Drosophila flakon (4 ml FSIO / adet) hazırlayın.
6. Tam 3 saat sonra, kendi yıkama kase (tüm tedavi için komple) için kalamar aktarın. Bu aşılama durur.
7. FSIO kendi Drosophila flakonuna her kalamar aktarmak için devam edin. Her tedavi için belirtilen transferi pipet kullanın.
8. Gün / n dönmek için kalamar tesisine Drosophila şişeleri tepsiler Taşıight ışık döngüsü hayvanlar embriyogenez sırasında yaşadı.
9. Gün 3 - Her bir kalamar için Prepare Drosophila flakon (4 ml FSIO / adet).
10. 22-24 saat sonrası aşılama at dusk önce, yeni bir Drosophila şişeye her kalamar aktarın. Her tedavi için belirtilen transferi pipet kullanın.
11. Gün 4 - 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri (1/squid) etiketli hazırlayın.
12. Önce 46-48 saat sonrası aşılama, önlem olarak alacakaranlıkta ve Drosophila flakon (6 bütünleşmesi ve kapak kapatma otomatik okumak için luminometre seti) her kalamar lüminesans kaydedin.
13. Arka plan lüminesans için bir negatif kontrol olarak, herhangi bir squid içermez FSIO ile bir şişeye ölçülür.
14. Adım 4,12 bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü yaklaşık 700 ul'lik bir hacimde her squid transfer edin. Bir karton dondurucu kutusuna gitme. Kapak kutusu bir kere girdikten sonra, wel olmayan bakteriler kovulma ışık ipuçları olarak çıkarmayınl-anlaşılmaktadır.
15. -80 ° C'da gece boyunca mikrosantrifüj tüpler dondurmak.

5.. Kolonizasyon Düzeylerinin Belirlenmesi

1. Her kalamar için, 475 ul FSIO (veya% 70 Instant Ocean otoklava) ile iki (2) mikrosantrifüj tüpleri, her hazırlamak.
2. İlk havaneli temizlemek ve brüt enkaz ve / veya doku kaldırmak için bir Kimwipe kullanarak havan hazırlayın.
3. Yeri% 95 etanol içeren 50 ml'lik bir behere ucu aşağı havan. Etanol yaklaşık 3 cm yükseklikte ilave edilmelidir.
4. Her havaneli için, kaptan çıkarın ve Kimwipe ile ucu silin.
5. Etanol banyoya geri havaneli batırıp çıkarın ve takın (en uç) bir mikrosantrifüj tüpü rafa ve yaklaşık 15 dakika için tamamen kurumaya bırakın.
6. Bir mikrosantrifüj tüp rafa Çözülme kalamar (maksimum n = 8).
7. Gerekirse, 700 ul için ses seviyesini ayarlayın.
8. Basamak 5.5 'ten havaneli kullanılarak, mürekkep kesesi RUP kadar hayvan doku bozabilirtures (suyun bulanık gri renk dönecek).
9. Havaneli çıkarın ve tüm doku tüp içinde kalmasını sağlar.
10. Tam olarak 10 saniye (bir zamanlayıcı kullanın) vorteksleyin doku kısaca.
11. Doku 10 dakika dinlenmeye bırakın. Doku yerleşir ve bakteri ve mürekkep çözelti içinde kalır. Izleyin hesaplamalar için, bakteri / mürekkep çözümü [A] seyreltme (yani 700 ul yılında E. scolopes ışık organı Homojenat) 'dir. Seri 01:20 dilüsyonları ([B], [C]) aşağıda tarif edilmektedir.
12. [B] seyreltme için, Basamak 5.1 'de hazırlanan mikrosantrifüj tüpler için 25 ul [A] ekleyebilir. Vortex.
13. [C] seyreltme için, 25 ul ilave [B] Basamak 5.1 'de hazırlanan mikrosantrifüj tüpler birine. Vortex.
14. LBS agara her seyreltme Plaka 50 ul, 2 tedavi başına çoğaltır.
15. 25-28 ° C'da gece boyunca inkübe.

6. Veri Analizi

1. CFU / ışık organ (LO), ülke hesaplamak içinHer tedavi için plaka üzerinde t koloniler içinde 10-400 kolonileri bulunur ve uygun formülü kullanın:
   CFU / LO = ([A] plakasında koloniler) x 14 veya
   CFU / LO = ([B] plakasında koloniler) x 280 veya
   CFU / LO = ([C] plakasında koloniler) x 5600.
2. Logaritmik bir ölçekte bireysel veri noktaları ve medyan çizilir.
3. Veri genellikle normalde farklı değişkenlerle olan, dağıtılmış değildir ve aykırı anlamlı biyolojik bilgileri içerebilir. Bu nedenle, parametrik olmayan testler tedaviler anlamlı farklılık olup olmadığını belirlemek için faydalı bir yöntem sağlar.
4. İstatistiksel analizler için GraphPad Prism yazılımını kullanın. Iki tedavi için, Wilcoxon Rank Sum testi kullanın. Daha büyük iki tedavi arasındaki karşılaştırmalar için uygun post-testleri ile Kruskal-Wallis testi kullanın.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Örnek kolonizasyonu deneyi sonuçları, Şekil 4 'de gösterilmiştir. İki suşları V. lüminesans farklı göreli seviyeleri gösterirler fischeri aposymbiotic (uncolonized) kontrol grubu olarak altı kalamar ile birlikte, altı kalamar inoküle her idi. E. scolopes symbiont, ES114 ¹⁴ ve parlak Sepiola robusta symbiont, SR5 ^15,16. Benzer inokulum seviyeleri (Şekil 4A) 3 saat içinde% 100 kolonizasyonu yol açar. 48 saat sonra, lüminesans seviyeleri (Şekil 4B) ve CFU sayımları (Şekil 4C) suşu kolonizasyonu yeterliliği değerlendirmek için tespit edildi. Belirli lüminesans (Şekil 4D; başına bakteri) tespiti sembiyoz sırasında her bakteri suşunun parlaklık belirlenmesi için olanak sağlar.

Kolonizasyon prosedürü Şekil 1. Akış çizelgesi. Bakteri ve kalamar belirtilen inokulum karıştırılır, sonra ayrı ayrı hasat edilir. Squid yıkanır, daha sonra 3 saat, 24 saat, ve 4 de yeni su aktarılır 8 saat sonrası aşılama. 48 saat sonra ölçülür ve lüminesans hayvanlar dondurulur, bu hayvanlarda yüzeyi sterilize hizmet eder. Işık-organ bakteri -80 az sürdürebilmesi kolonize ° C de bir çözülme (ek donma-çözülme çevrimleri) aracılığıyla.

Homojenizasyon ve bakterilerin seyreltme kaplama gösteren Şekil 2. Akış çizelgesi. Seri 20 kat dilüsyonlarının kolonize bakteri sayımı için uygun dinamik aralığı sağlamak.

Şekil 3. Yavru kalamar zedeleyecek dar bir delik (A) uygun bir şekilde dar konik mil ile pipetler aktarın. Makas veya jilet ile en dar bölümü keserek tedavi öncesi (B) yavru kalamar aktarmak için uygun bir araç verir.

s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg "/>
Şekil 4. Bir kolonizasyon tahlil için örnek veriler. Inokulum kâseler içinde bakteri (A) Düzeyleri. Bireysel kalamar (B) Lüminesans. (C) bireysel kalamar Colony sayar. Bireysel kalamar (D) Özel lüminesans. Apo, Aposymbiotic (negatif kontrol uncolonized).

Tarif kolonizasyonu tahlil, bir laboratuvar ortamında, doğal bir proses simbiyotik analizi için olanak sağlar. Bunun gibi, farklı doğal izole tarafından mutant soylar, ve farklı kimyasal rejimlerinde kolonizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir. Açıklanan varyasyonlar ile ilgili deneyler yaygın sembiyoz farklı yönleriyle değerlendirmek için kullanılmıştır. Kolonizasyonu kinetikleri tesadüf detektörü çıkartılmış olduğu bir sintilasyon sayacı otomatik olarak tespit edilebilir ilk 24 saat, içinde lüminesans incelenmesi ile ölçülebilir. Bundan başka, bir başka göre bir suş nispi kolonizasyonu yeteneği hayvanlar grubu içerisinde iki suşunun çıkış oranı giriş oranı (ayrı antibiyotik direnci ile ayırıcı algılama, floresans normalize edildiği, rekabetçi bir kolonizasyonu deneyi ile ölçülebilir veya kromojenik [lacZ / Xgal] belirteçleri). Son olarak, kolonizasyon konfokal MICR doğrudan yansıması olabiliroscopy.

Bu deneyler için sağlıklı yavru kalamar kullanmak önemlidir. Yoksul kalamar sağlık Davranış göstergeleri (hayvan euthanize) daireler yüzme, ya da beyaz kalır ve (özenle kullanmak) karanlık bir yüzey üzerinde kahverengi açmak için kendi Kromatofor değiştirmez hayvanlar bulunmaktadır. Ev sahibi toplumlarda varyasyonlar bulunmaktadır olarak, hayvanların daha küçük sayılarla kopyalayan deneyleri daha fazla sayıda sık sık büyük çaplı kopyalayan deneyler daha küçük bir sayı daha değerlidir.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yazarlar kalamar tesisleri destek için ve bu elyazması hakkında yorum Michael Hadfield ve saha toplama sırasında yardım için Kewalo Deniz Laboratuarı, bu protokol için katkıları Ruby ve McFall-Ngai Laboratuvar üyeleri için Gyllborg Mattias teşekkür ederim. Mandel Laboratuvarında Çalışma NSF IOS-0843633 tarafından desteklenmektedir.