Method Article
Burada kantitatif immünofloresan, görüntü analizi, ve heterojenlik istatistiksel bir ölçü kullanarak, tümör malzeme histolojik bölümlerde moleküler heterojenite ölçmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, klinik biyomarker geliştirme ve analiz kullanım için tasarlanmıştır.
Morfolojik heterojenlik içinde bireysel bir tümör cerrahi pratikte histopathologists tarafından iyi bilinmektedir. Bu genellikle tanınan histolojik alt tiplere belirgin farklılaşma alanları şeklinde, ya da farklı patolojik notu alırken, çoğu zaman doğru sınıflandırma (Şekil 1) meydan fenotip daha ince farklar vardır. Sonuç olarak, altta yatan moleküler fenotip morfolojisini tarafından dikte olduğundan, gözle görünür farklılıklar olduğu bölgelerde hücre fonksiyonu ve davranışı orkestra proteinlerin ifade farklılıkları, ve bu nedenle, görünüm eşlik etmesi muhtemeldir. Prognoz için görünen ve görünmeyen (moleküler) heterojenliğin önemi bilinmemektedir, ancak en azından genetik düzeyde, heterojenlik primer tümörün 1,2 var ve bu alt-klonlar bazı metastatik doğuran, son kanıtlar göstermektedir ( ve bu nedenle öldürücü) hastalığı.
Ayrıca, bazı proteinlertedavi hedefleri (örneğin tamoksifen ve trastuzumab (Herceptin) ER ve HER2 sırasıyla) çünkü biyobelirteçleri olarak ölçülür. Bu proteinlerin bir tümör içinde değişken ifade Eğer tedavi yanıtları da değişken olabilir. Immünohistokimya için yaygın olarak kullanılan histopatolojik skorlama düzenleri ya göz ardı veya protein ekspresyonu miktarının sayısal olarak homojenize. Benzer şekilde, tümör örnekleri homojenize edilir (örneğin, gen ekspresyonu gibi) yıkıcı teknikleri, nicel bilgi açıklanamamıştır, ancak mekansal bilgi kaybı olmaz. Pankreas kanseri genetik heterojenite haritalama yaklaşımları tek bir hücre süspansiyonu 3 nesil ya güvendi, veya macrodissection 4 vardır. Son zamanlarda yapılan bir çalışmada, prostat kanseri dokusunun 5 morfolojik ve moleküler heterojenite harita için morfolojisi ve moleküler haritalama mümkün olduğunu ispat ilke, kuantum noktaları, ama düşüyorheterojenite nicel hort. Immünohistokimya olduğundan, en azından, sadece yarı-kantitatif ve intra-ve inter-gözlemci önyargı, daha duyarlı ve kantitatif metodolojileri tabi doğru in situ doku heterojenite harita ve ölçmek için gereklidir.
Biz sistematik Otomatik Kantitatif Analiz (AQUA) sistemi 6 dayalı tüm tümör dokusu bölümlerde protein ekspresyonu, heterojenite ölçmek amacıyla geliştirilen ve uygulanan deneysel ve istatistiksel metodoloji var. Doku bölümler fluorofor etiketli sekonder antikor cytokeratins ve ilgi hedeflere karşı spesifik antikorlar ile etiketlenmiş. Slaytlar bütün bir slayt floresans tarayıcı kullanarak görüntülü. Görüntüler yüzlerce binlerce çini bölünmüştür ve her bir çini sonra epitel doku (tümör) bileşeni içinde protein konsantrasyonunun bir ölçüsüdür AQUA puan atanır. Heatmaps Simpson biyolojik çeşitlilik indeksi 7 dayalı orijinal ekoloji heterojenite kullanılan istatistiki bir ölçüttür, kullanarak, proteinlerin ve atanmış bir heterojenite puan doku ifadesini temsil etmek için üretilir.
Histolojik preparatlar, bugüne kadar sistematik bir protein ekspresyonu ile birlikte bu değişkenliği harita ve ölçmek için hiçbir girişim olmamıştır. Burada, ER ve yumurtalık kanseri HER2 biyomarker ifade için uygulanan yöntemin ilk kullanımı göstermektedir. Bu yöntemi kullanarak, prognoz ve tedaviye yanıtları tahmin heterojenite önemini kurmak için heterojenite translasyonel çalışmalarda biyomarker ifade çalışmalarında bağımsız bir değişken olarak analiz etmek için yolu açıyor.
1. Doku hazırlanması
2. Doku kesitlerinde immünofloresan
3. Tüm bölümü tarama kullanarak görüntü yakalama
4. AQUA otomatik görüntü analizi
5. İstatistiksel Analiz: Tüm istatistiksel analizler SPSS (IBM)
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Hedefe yönelik tedavi, tamoksifen ve trastuzumab gibi nispeten düşük toksisite ajanlar, yumurtalık kanseri hastaları için bakım standart değildir. Platin taksan ilk basamak kemoterapi, yumurtalık kanseri 9-13 diğer kemoterapi rejimlerinin daha üstün olduğunu ve başlangıçta hastaların% 70-80 cevap en nüks edecektir ve onların hastalık nedeniyle ölmektedir ise iyi bir kanıt yoktur . Alternatif tedavilere yanıt tahmin olabilir biyobelirteçleri ölçümü, her hasta için bireyselleştirilmiş tedavi seçiminde faydalı olacağını ve hayatta kalan tümör hücrelerinin bir tümörün kemoterapi uygular seçim baskısı bu yana, farklı özelliklere sahip ve tedavi öncesi tümörün ICSI'nin temsil, bu niceleme değişim bu nedenle yararlı olabilir. Biz orde, kemoterapi öncesi ve sonrası yumurtalık kanseri örneklerinde ER ve HER2 ifade heterojenite haritalama yaklaşımı uygulamıştırr nicel ifade değişiklikleri ölçmek ve tedavi öncesi ve sonrası biyomarker ifade arasındaki ilişkiyi nasıl değerlendiriyorsunuz. ER ve HER2 Her ikisi de bireysel tümörler içinde işaretlenmiş heterojenite gösteren ve bazı tümörlerde, tedavi sonrası düşük heterojenite nispeten yüksek heterojenite Simpson indeksi değişiklikleri, azalan Simpson endeks puanları (bkz. Şekil 2 ve 3) tarafından temsil edilen. Bu klonal seçim sitotoksik kemoterapi yanıt oluşur fikrini destekler; daha da önemlisi, bu kanser hastaları için daha iyi tedavi kişiselleştirmek için, kalan nüfusa karşı hedeflenen tedavi kullanılarak istismar olabilir.
Şekil 1 farklı alanlarında aynı yumurtalık kanseri değişken morfolojisi gösteren Hematoksilen ve eozin lekeli fotomikrografı. (A) x40 yüzey elde morfolojisi değişen tümör iki bitişik olan alanlarda gösterir. Yüksek güç manzarası (x20Doku (C) alt kısmında daha homojen eozinofilik sitoplazma ve papiller büyüme deseni 0) iken, hücreleri sitoplazmik takas ve tümör (B) üst kısmında sağlam bir büyüme modeli ile ortaya koymaktadır. Ancak, bu tümör, daha fazla yönetim amaçlı seröz papiller histolojik alt tip olarak sınıflandırılır.
Şekil 2 ER protein ifadesi, sitokeratin pozitif yumurtalık kanseri dokusu heterojenite heatmaps önce (üst panel) ve tedavi sonrası (alt panel).
Şekil 3 HER2 proteini sitokeratin pozitif yumurtalık kanseri dokusu ifade, önce (üst panel) ve sonrası (alt panel) tedavisi heterojenite heatmaps.
Bu yöntem, tümörün malzemenin standart formalin ile fikse, parafine gömülü histolojik kesitler moleküler heterojenite izin kantifikasyon burada nitelendirdi. Yöntemi, bu biyomarker geliştirme ve analiz bir değişken olarak dikkate alınması olabilir, böylece bir doku bölümünde heterojenlik derecesi atanacak bir değer izin verir. Genel olarak doku biyobelirteçleri tahlil örnekleme hatası veya yanlılık daha az duyarlıdır, böylece ifade bakımından homojen olması tercih edilir olsa da, bazı koşullar altında, bir parametre olarak heterojenite ölçmek için yararlı olabilir. Örneğin, ER ve HER2 için örnek gösterildiği gibi, ortak biyobelirteçleri ifade hatırı sayılır bir heterojenlik göstermek ve bunun klinik sonuç veya tedaviye yanıt açısından, bağımsız bir prognostik veya akıllı faktör sırasıyla temsil edip etmediği henüz bilinmiyor. Aynı şekilde, gösterildiği gibi, tedavinin kendisi dinamik olarak değiştirebilirhedef zenginleşme oluşturan hücre popülasyonları ve bu nedenle ölçüm tedavi kararları rehberlik yararlı olabilir.
Ancak, bu teknik, geleneksel histopatolojik veya biyomarker (immünohistokimyasal olarak) analizleri sınırı aynı faktörler ile sınırlıdır. Sonuç türü, boyutu, ve analiz edilen doku kalitesi ve bu nedenle tek bir doku bölümünde bağlıdır tümörün tamamını yansıtmıyor olabilir. Gerçekten de, Simpson indeksi aşırı derecede doku boyutu (AQUA puanları ölçülen ve yakalanan kare sayısı) önyargılı olabilir. Ölçülen epitoplar immünojenite artifactually doku bölümü (soğuk iskemi zamanı, fiksasyon uzunluğu ve kenar artifakı gibi) arasında kendi ifadesini değiştirmek kontrol edilemeyen pre-analitik faktörler tabi olabilir. Bu, özellikle herkesin bildiği gibi labil 14, 15 fosfor epitopu bir sorundur . Bu nedenle bu tekniğin daha uygun olabilirrezeksiyon örneklerinde ziyade küçük biyopsiler, ve sadece bir yerine birden çok bölüm yapılan. Sonuç olarak, 3D görüntüleme teknikleri Bu parametre daha iyi ölçmek için bir fırsat sunabilir.
Olarak sunulan teknik sitokeratin maskeleme epitop ifade değişkenlik gibi biyolojik faktörler, aynı zamanda sınırlı olabilir. Bu, yumurtalık ve meme kanseri, epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) geçmesi veya non-epitelyal bileşenleri veya kök hücreler 16 zenginleştirilmiş dahil olmak üzere, bu kanserlerin özellikle endişe gibi son zamanlarda meydana geldiği görülmüştür olabilir kemoterapi- in vitro 17, yumurtalık kanseri ve tedavisi 18 yanıt meme kanserli hastalarda tedavi edildi. Bu sınırlama, sitokeratin artı vimentin, EMT 16 upregüle gibi alternatif maskeleme antikorları (antikorlar kokteyller) kullanarak üstesinden olabilir . Buna ek olarak, doku diğer bileşenleri (mikrofon bu yanaroenvironment), fibroblastlar ve vasküler endotelyal hücreler gibi, biyolojik tedaviler de giderek tarafından hedef alınıyor, teknik vasküler endotelyal hücreler için leke gibi PECAM / CD31 gibi ilgi bölmeleri, özel maskeler kullanarak, bu bileşenleri puan için genişletilmiş olabilir .
Simpson indeksi adaptasyon sadeliği nedeniyle mevcut protokol heterojenlik bir ölçüsü olarak kullanılıyor olmasına rağmen, diğer önlemler heterojenlik (ortalama, varyans, medyan, vb) gibi merkezi eğilim basit ölçümler, kullanılan olabilir. Ayrıca, Simpson endeksi hesaplamalarında, belirli bir test nüfusun daha iyi uyacak şekilde değiştirilmiş olabilir. Z-skoru dönüşümleri heterojenite bir veri kümesi için ortalama etrafında sapma dayalı olduğu puanlama birden fazla belirteçler için daha geçerli olmak üzere izin verir. Ancak, genel olarak çeşitli puanlama dönüşüm bu tip sınırlı olabilir. Bazı tasarımlar daha uygun olabilirsadece belirli bir marker kümesinin tüm örnekler için gerçek AQUA puanları bin. Kutuları ve kesilecek sayısının seçimi de neden olabilir değerler aralığında bir sınırlama ve alternatif deneysel tasarımlar için optimize edilmiş olabilir.
Biz zaten klinikte kullanılan bu yana, ER ve HER2 aday biyobelirteçleri olarak bu çalışmada kullanılan hedeflenmiş tedavilerin etkinliği saygı ile ilgili klinik soruları yanıtlamaya yardımcı ve hatırı sayılır bir heterojenlik ve değişim göstermez bilinen birincil ve uzak 19 hastalıktır. Ancak, heterojenlik optimal marker tespit edilmesi kalır. Diğer olasılıklar klonalite sitogenetik belirteçler, interfaz FISH çalışmaları 20, daha önce kullanılan bu gibi içerebilir. Bu yaklaşım, daha fazla kanser biyolojisi bu parametre alaka kurmak için büyük, iyi açıklamalı klinik kohortlarında veya klinik araştırmalardan daha fazla doğrulama gerektirir.
JC, MG, CJ, ve CS HistoRx, Inc. 'Çalışanları
Bu çalışma, İskoç Finansman Konseyi (Hibe Numarası HR07005 tarafından kısmen desteklenen http://www.sfc.ac.uk/, Tıbbi Araştırma İskoçya ( ) http://www.medicalresearchscotland.org.uk/), Kanser Research UK Deneysel Tıp Kanser Merkezi ( http://www.cancerresearchuk.org/ ) ve Atılım Meme Kanseri ( http://breakthrough.org.uk/ ).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktifi Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
ScanScope FL | Aperio | ScanScope FL | Eskisi gibi satıcıdan donatılmıştır |
Spektrum | Aperio | Spektrum | Yapılandırma ve katalog numaraları yerel kurumların kendi veritabanı ve IT yapısının nasıl ayarladığınıza değişecektir. |
AQUAjustment ile birlikte AQUAnalysis, | HistoRx | V2.3 | AQUAjustment paketi AQUAnalysis Spectrum saklanan görüntüleri kullanmanıza olanak sağlar. |
HER2 | Dako | A0485 | 400 seyreltme 1 |
fare anti-pan sitokeratin | Dako | M3515 | 50 dilüsyon 1 |
Antikor seyreltici | Dako | S0809 | |
Keçi-tavşan HRP imgeleyin | Dako | K4003 | |
Protein blok | Dako | X0909 | |
Keçi anti-fare Alexa555 | Invitrogen | A21422 | |
DAPI montaj orta | Invitrogen | P36931 | |
Cy5 Tyramide | HistoRx | AQ-EMR1-00001 | |
Sequenza immün Merkezi | Thermo Scientific Shandon | 73300001 | Burada kullanılan tezgah üstü immünofloresan boyama |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır