定量的免疫蛍光法を用いて腫瘍におけるタンパク質発現の不均一性のマッピング

ここでは定量的免疫蛍光法、画像解析、および不均質性の統計的尺度を用いて腫瘍材料の組織切片の分子多様性を定量化する方法を説明します。方法は、臨床バイオマーカーの開発と分析に使用することを目的としています。

個々の腫瘍内の形態学的不均一性は外科診療におけるhistopathologistsでよく認識されています。これはしばしば認識組織学的サブタイプへの明確な差別化の領域の形態、または別の病理学的悪性度をとる一方で、多くの場合、正確な分類（図1）逆らう表現型でより多くの微妙な違いがあります。最終的に、形態が根底にある分子表現型によって規定されているので、目に見える違いはある地域では、外観の細胞機能と動作を調整し、従って、タンパク質の発現の違いを添付する可能性があります。予後のための可視と不可視の（分子）不均一性の意義は不明であるが、最近の証拠は、少なくとも遺伝子レベルで、異質性が、原発腫瘍の^1,2に存在する、そしてこれらのサブクローンの一部が転移を生じさせる、ことを示唆している（したがって、致命的な）疾患。

また、いくつかのタンパク質は彼らは治療の目標（タモキシフェンとトラスツズマブ（ハーセプチン）のインスタンスのERとHER2、それぞれのための）であるため、バイオマーカーとして測定。これらのタンパク質は、腫瘍内の変数式を表示する場合は、治療反応も変数があります。免疫組織化学用に広く使用されている病理組織学的スコアリングのスキームは、どちらか無視するか、数値的にタンパク質発現の定量化をホモジナイズする。同様に、腫瘍サンプルをホモジナイズしている破壊的な技術、（そのような遺伝子発現プロファイリングなど）で、定量的な情報を明らかにすることができますが、空間情報は失われます。膵臓癌の遺伝的異質性のマッピングのアプローチは、単一の細胞懸濁液³の世代上で、またはmacrodissection ⁴に頼ってきた。最近の研究では、形態と分子のマッピングが実現可能であることを原理の証明を提供し、前立腺癌組織⁵の形態学的および分子多様性をマッピングするために量子ドットを使用するが、sを落下している異質性を定量化するのホルト。免疫組織化学では唯一、最高の状態で、半定量的および内および間の観察者バイアスの対象となるので、より高感度かつ定量的手法は、正確にその場で組織の不均一性をマッピングし、定量化するために必要です。

我々は（AQUA）自動定量分析に基づいて、体系的に腫瘍の全体の組織切片でのタンパク質発現の不均一性を定量化するためにシステム^6を実験的および統計的方法論を開発し、適用しています。組織切片を蛍光標識二次抗体に結合サイトケラチンと興味の対象に対して向けられた特異的な抗体で標識されています。スライドは全体のスライド蛍光スキャナーを用いて画像化している。画像は、タイルの数百〜数千に細分化され、各タイルは、組織の上皮（腫瘍）コンポーネント内のタンパク質濃度の尺度であるAQUAのスコアが割り当てられます。 HEAtmapsはSimpsonの多様性のインデックス⁷に基づいて、もともとは生態学で使用される不均一性の統計的尺度を用いて、タンパク質の組織発現と割り当てられている不均一性のスコアを表すために生成されます。

現在までに組織学的製剤で、体系的に蛋白質の発現と並行してこの変動をマッピングし、定量化する試みがなされていない。ここで、我々は、ERおよび卵巣癌におけるHER2バイオマーカーの発現に適用されるメソッドの最初の使用例を示します。このメソッドを使用すると、予後と治療への応答の予測の不均一性の重要性を確立するために、トランスレーショナル研究におけるバイオマーカーの発現の研究​​の独立変数としての異質性を分析するための道を開く。

1。組織の準備

1. ミクロトーム法
   1. セクションホルマリン固定パラフィン包は、回転式ミクロトームを用いて4μmの厚さの腫瘍ブロックを埋め込む。
   2. 正に荷電した顕微鏡スライド上にセクションを配置。
   3. 一晩37℃のオーブンでスライドをインキュベートする。
2. ストレージ
   1. -18店舗のセクション° C〜-25℃のフリーザー、抗原性の損失を防ぐために。

2。組織切片の免疫蛍光

1. 脱ろうと再水和
   1. 〜からろうを除去する、5分間2回キシレンにスライドします。
   2. 99％、99％、80％、エタノールの50％と、それぞれのための2分間水道水を流してのスライドを再水和。
2. 抗原回復
   1. マイルで5分間圧力鍋で0.15 mMクエン酸ナトリウム、pH6.0の緩衝液を用いて、熱誘導抗原の検索を実行するcrowave。
   2. 20分間のスライドを冷やす。
   3. ロッカーで5分間0.05％PBSTでスライドを洗浄します。
3. 手順をブロック
   1. 10分間、3％過酸化水素でセクションを扱います。
   2. ロッカーで5分間0.05％PBSTでスライドを洗浄します。
   3. Sequenzaの免疫染色のラックにセクションを追加。
   4. 10分間の無血清蛋白質のブロック内のセクションを扱います。
4. 一次抗体のインキュベーション
   1. 室温で1時間ダコの抗体希釈液で最適希釈に希釈した一次抗体をインキュベートする。
   2. 0.05％PBSTで5分ごとに三回すすいでください。
5. 上皮マスク（サイトケラチン）インキュベーション
   1. 一晩4ダコの抗体希釈液で1:50に希釈したインキュベートマウス抗パンサイトケラチン、℃、
6. 上皮マスクの可視化
   1. ヤギ抗マウスAlexa555 sの1：25希釈を準備あらかじめ希釈でecondary抗体はヤギ抗ウサギHRPの抗体溶液を想定しています。室温で1.5時間のために暗闇の中でスライドをインキュベートする。
   2. 0.05％PBSTで5分ごとに三回すすいでください。
7. ターゲットの可視化
   1. Sequenzaから湿度のチャンバースライドを移す。
   2. ターゲット信号の増幅の希釈剤（HistoRx浴槽E）と午前1時50濃度におけるCy5のチラミド（HistoRxチューブF）を組み合わせる。完全に混合する渦。室温で10分間、暗所でスライドをインキュベートする。
   3. 0.05％PBSTで5分ごとに三回すすいでください。
   4. 1分間80％エタノールでスライドを脱水する。
   5. 暗闇の中で空気乾燥したスライド。
8. 対比染色と封入
   1. カバースリップ上でDAPI封入剤を適用し、組織切片上のカバースリップを配置。
   2. 暗闇の中で一晩乾燥したスライド。
   3. スライドは専用バスにマニキュア液で、安全な乾燥した後、長期保存を確認し、4℃の冷蔵庫で保管。

3。セクション全体のスキャンを使用して画像キャプチャー

1. アペリオScanScope FLのスライドスキャナのスライドカセット内の5つのスライドにロードしてください。
2. 各スライドの場合は、ScanScopeコンソールのインタフェースを使用してイメージする一般的な地域を選択してください。関係なく、パターンやサンプルの他の観察可能な側面を染色の、スライド上のすべての組織を網羅する地域を選択してください。
3. ScanScopeコンソールを使用して、各チャネルごとに（DAPI、Cy3およびCy5）次のように、最適な露出を決定します。
   1. 調べるために組織のある領域の選択 - この領域は、理想的には、最適な表現を提供する組織の腫瘍の領域にする必要があります。
   2. ScanScopeコンソールの自動露出機能を使用して、画像のフォーカスと一緒に、各チャネルごとに提案された露光時間を評価する。
   3. 共存するために各サンプルの3〜5の領域にまで何度も何度も繰り返す値の安定性をnfirm。
4. フラットフィールド補正のイメージはフィルタごとに取得される背景領域を定義するために、スライドの封入領域内ではまだ、まだ離れて組織からの追加の領域を（ScanScopeコンソールの画像上の青いひし形で示される）、を選択します。
5. 前の画像取得にこれらのイメージを確認してください。画像は、高いバックグラウンドや他の画像アーチファクトを持っているように見える場合は、画像領域を移動し、新しい画像が取得しておく必要があります。
6. 取得したデジタルスライド画像はアペリオのスペクトルデータベースに自動的にアップロードされます。

4。 AQUA自動画像解析

1. スペクトルデータベースにデジタルスライド全体の画像を表示し、全体の組織と染色パターン（s）のコンテキスト内で関心の腫瘍の領域に注釈を付ける。
2. ダブル親指をクリックして、スペクトルのデータベース内のデジタルスライドリストからAQUAnalysisを使用して分析するスライドを選択するネイル画像（代わりに、画像の隣にあるチェックボックスを選択し、選択リストの上部にあるメニューから"画像を表示する'）。これは自動的にImageScopeソフトウェアおよび組織サンプルの色マージされた画像を開きます。
3. 提供されるツールを使用して画像を移動するには、このソフトウェアを使用してください。
4. 付属のH＆E（物理的なスライドまたは注釈付きの画像のどちらか）を使用して、蛍光画像上に関心領域に注釈を付ける。興味の複数の領域には、個々には、エリアを丸で囲んだ単一のサンプルを選択することができます。選択した領域（すなわち、損傷した組織、悪い組織、非腫瘍分野、残骸、等の分野）内の特定エリアを除外するために使用される"負"ツールもあります。
5. 画像上の注釈レイヤー（複数可）を保存します。
6. スペクトラムメインメニューに戻り、ちょうどアノテーションが付けられた画像の横にあるチェックボックスを選択します。リストの上部にメニューストリップから"分析"を選択します。
7. 出てくる[Analysis]ウィンドウ、セレのプルダウンメニューからCT"HistoRx AQUAの分析"。
8. 注釈の複数の層がある場合は、分析のための適切な層（複数可）を選択するには、チェックボックスを使用してください。
9. "分析"ボタンをクリックするときに開始する準備を押してください。
10. この時点で、最小化されたコンソールウィンドウは、Windowsのタスクバーに表示されます。これにより、スペクトラムのデータベースからローカルPC（"プル"操作）への画像の転送の進行状況が表示されます。
11. データが転送されると、AQUAnalysisが起動します。その後、ユーザーは、表示、移動および画像解析を行うためのソフトウェアの内部のすべての機能を使用することができます。
12. 個々に採点されるそれぞれの - スペクトルデータベースから画像の注釈領域は、512x512ピクセルの画像タイルに分割されます。
13. この研究では、データのクラスタリングに基づく教師なしAQUAスコアリングアルゴリズムは^、8を使用していた。このアルゴリズムでは、AQUAのスコアは次のように生成されます。
    1. 汎サイトケラチンの画像SIgnalは、背景の上に閾値処理され、それらのピクセルは、その後の計算に使用される腫瘍"マスク"を定義するために使用されます。高発現汎サイトケラチンのピクセルは、腫瘍細胞の細胞質/核関連以外の領域を定義する。
    2. 腫瘍マスク内にあるDAPIのチャネ​​ルで高信号を持つピクセルは、自然の中で核として識別されます。
    3. クラスタリングアルゴリズムは、DAPI染色やサイトケラチンの発現と部分的に核や細胞質コンパートメント、または背景のいずれかにそれらを属性にしようとどちらかのために低強度を持つピクセルを調べます。
    4. すべてのピクセルが腫瘍コンパートメントまたは背景のいずれかに割り当てられていると、標的タンパク質からの信号の強度（ERやHER2は）その後、こうしてAQUAスコアを生産、コンパートメントとコンパートメントの大きさに正規化のそれぞれの内に計算されます。
    5. 十分な腫瘍の表現を持っていなかったイメージが採点されていない（LEとのそれらによって定義されるようにSS腫瘍を表すピクセルの5％未満）。これらの地域はまた、"不合格"と呼ばれる"最終結果"の値を生成するため、その後の統計分析では削除することができます。
    6. さらに、調査の際、オペレータがサンプルまたは画像アーチファクト（例えば折り畳まれた組織、破片）によるスコアリングに適していなかったのフィールドを識別場合、これらのフィールドは、スコアリングから編集さと"最終結果""失敗"と呼ばれる生産された。
14. AQUAスコアリングの結果は、全体の組織切片のサンプル内の関心領域内の各512 × 512ピクセルのタイルに関連付けられている得点のテーブルです。これらのファイルは、。CSV形式で、その後の統計分析に使用することができます。

5。統計分析：すべての統計分析はSPSSで実行される（IBM）

1. 可能であればは、大規模な操作のために、データの操作と分析の手順を実行するためにSPSSのシンタックスのコードファイル（。SPS）を生成します。例の構文のコードは、補足ファイルとして提供されています。
2. SPSSへのデータファイルを読みます。生データ（例えば、楽器固有のパラメータ、非利用コンパートメントからAQUAスコア）で使用されていない変数を削除します。
3. 地域は"失敗"の"最終結果を"（上記参照）がある場合には、数値解析からそれらを削除SYSMIS、としてこれらの値をマーク。
4. 各マーカーのためのすべてのスライドのすべてのデータ（ERやHER2）がSPSS形式で設定された単一のマスターデータに集約。後続のすべての計算には、このマスターファイルを使用してください。
5. ERやHER2（補足構文ファイルを参照）、データをさらに検証し、多様性のシンプソンの指数は以下のように計算された：：SPSSシンタックスファイルを（それぞれのマーカーのいずれかを使用して
   1. マスタデータ、以前に生成された設定の変更を防ぐために、マスターの分析ファイルを生成します。
   2. 生成された生データおよび画像に対して設定されたマスタデータを検証する。
   3. 各サンプルのAQUAスコア（フィールドの数、のサマリー統計を生成するには、スコア、中央値スコア、minimuを意味するmのスコア、最大のスコア、およびサンプルのスコアの標準偏差）。
   4. 元の生データの出力ファイルに対してと得点生の画像データに対する結果のランダムなサンプルを確認してください。
6. ヒートマップの画像を（図2及び図3に示すように）生成するには：
   1. つの個別のレベルに"ビン"AQUAのスコアデータ（SPSSの"ビジュアルビニング'関数を使用して）。 ERのために、原子力スコアはHER2のために、使用された、細胞質のスコアが使用されました。
   2. 各ビンは、データセット全体から利用可能な例等しい割合を表すようにビンを導き出す。
   3. すべての後続の出力はレベル"スライド/サンプルあたり"になるようにSPSSの機能"分割ファイル"を使用してください。
   4. それが割り当てられたにビンに対応する値とそのx、y座標と色（図2および図3を参照）により、各地域（512 × 512タイル​​に相当）をプロ​​ットする。
7. 異質性スコアを生成するには、コードはシンプソンのを生成するために書かれたAQUAのスコアを用いて多様性の指数。
   1. としてここで使用される多様性のシンプソンの指数は、、のように定義されます。
      
      ここで、Nは、所定のサンプルで使用されるスコア/フィールドの合計数であり、nは標準化されたスコア（後述するように生成される）の指定されたグループの得点/フィールドの数です。
8. データソースのために、上記のマスターの分析ファイルを使用してください。に示した例では、すべてのERの計算は、核AQUAスコアを使用するとHER2の計算は、細胞質AQUAのスコアを使用。各サンプル/スライドについては、以下の計算を実行します。
9. 蛍光データは、分散の不安定性の対象となるので、そのようなそのエラーの大きさが強度で伝搬し、すべてのAQUAスコアに対数（基数2）の正規化を適用します。
10. さらに正規化された（ログが変換された）データは、z -（標準）スコアに変換する。
    1. Z -スコアの変換が計算されます。sは、次の：Z =（AQUAスコア - サンプルのすべての得点の平均値）/サンプルのスコアの標準偏差。これは偏差ゼロの中央値の周りの偏差の分布に得点の分布に変換します。
11. ビンこれらのZ -スコアの値が6つのグループ（<-2、-2 - -1、-1 - 0、0 - 1、1 - 2、> 2）へ。
12. 各ビンの各ビンとの和に割り当てられた値の数を計算する。インデックスに使用する6つのビンのそれぞれの値を計算するために、フィールドの合計数と一緒に、この値を使用してください。
13. これらの値を合計し、多様性のインデックスを生成するからその分を差し引く。
14. 多様性指数は、特定のサンプルの平均値周りのスコアの広がりの指標を提供します。従って、高い指数は、得点のより広範な広がりを示している、または式の不均一性を増加させた。逆に、より低いインデックス、発現の測定と試料の均質発現の少ない変化を示している。これは、Figurに示されていますES 2と3。

6。代表的な結果：

このようなタモキシフェンとトラスツズマブのような比較的低毒性の薬剤と標的治療は、卵巣癌患者の標準治療ではありません。プラチナ-タキサンファーストライン化学療法は卵巣癌^9月13日のための他の化学療法のレジメンよりも優れている、と患者の70-80％が最初に、対応するほとんどの再発意志と自分の病気で死亡しながらという良い証拠がある。代替療法への応答を予測する可能性バイオマーカーの測定は、各患者に対して個別化治療を選択する上で有用であろう、と腫瘍に対する化学療法発揮する選択圧以来、生存腫瘍細胞は、異なる特性を有し、治療前に腫瘍の亜集団を表すことができる、これを定量化変更は、そのために有用かもしれない。我々はordeで、化学療法の前と後の卵巣癌標本でERとHER2発現するために私達の不均一性のマッピングのアプローチを適用rは、式の量的変化を測定し、治療前後のバイオマーカーの発現との関係を評価する。 ERとHER2の両方は、個々の腫瘍内にマークさ不均一性を示し、そしていくつかの腫瘍で、低い不均一性に相対的に高い不均一性から治療後にシンプソンのインデックスの変更は、シンプソンのインデックスのスコアを（図2と図3を参照）減少させることによって表される。これは、クローン選択は細胞毒性化学療法に反応して発生するという考えを支持する、より重要なのは、これはより良いがんの患者の治療をパーソナライズするために、残留人口に対する標的療法を使用して悪用される可能性があります。

可変形態を示す同じ卵巣癌のさまざまな領域の図1。ヘマトキシリン及びエオシン染色顕微鏡写真。 （A）X40顕微鏡写真は、形態を変えて腫瘍の隣接する二つの領域を示しています。ハイパワービュー（X200）、細胞質清算と腫瘍の上部（B）の成長のベタパターンで細胞を明らかにするには、組織の下部ながら、（C）より均質な好酸性の細胞質および乳頭状の増殖パターンを持っています。この腫瘍は、しかし、さらなる経営の目的のために漿液性乳頭状組織学的サブタイプとして分類されるであろう。

サイトケラチン陽性の卵巣癌組織中のERタンパク質の発現2。異質性のヒートマップ図 、前（上）と後（下のパネル）療法。

図3：不均一性サイトケラチン陽性卵巣癌組織におけるHER2蛋白の発現のヒートマップを、前（上段パネル）および治療 ​​（下のパネル）の後。

方法はここに腫瘍材料の標準的なホルマリン固定、パラフィン包埋組織学セクションの分子多様性の定量化を可能にする説明。方法は、これはその後、バイオマーカーの開発と分析の変数として考慮することができるように、組織切片の不均質性の度合いに割り当てられる値を許可します。一般的には、組織のバイオマーカーのアッセイは、サンプリングエラーやバイアスの影響を受けにくくなるように、表現に関して均質であることが好ましいが、それはいくつかの状況下でのパラメータとして不均一性を定量化するために有用かもしれません。 ERとHER2のための例示の例に示すように、例えば、一般的なバイオマーカーは発現のかなりの異質性を示すが、このことを、それぞれ臨床転帰や治療への応答に関して、独立した予後または予測因子を、表しているかどうか現時点では不明です。同様に、図に示すように、治療自体が動的に変更するかもしれない構成する細胞の集団、そしてターゲット濃縮の測定は、治療上の意思決定を導くのに有用かもしれません。

しかし、技術は従来の病理組織学的またはバイオマーカー（など免疫組織化学など）の分析を制限する同じ要因によって制限されます。その結果、タイプ、サイズ、および分析される組織の品質に依存し、したがって、単一の組織切片では、腫瘍全体を代表できない場合があります。実際、シンプソンの指数は、不当に組織の大きさ（キャプチャとAQUAのスコアが測定されたフレームの数）によってバイアスされることがあります。測定されるエピトープの免疫原性は、人為的に組織切片（例えば冷阻血時間、または固定の長さ、およびエッジのアーティファクトなど）を介してそれらの発現を変化させる制御できない分析前の要因が適用される場合があります。これは特に悪名高い不安定な^14、15であるリン酸化エピトープ、のための問題です。そのための手法は適しているかもしれません。切除標本ではなく、小さな生検に、というだけのものよりも、複数のセクションで実行されます。最終的に、3Dイメージング技術は、より良い、このパラメータを定量化する機会を提供する場合があります。

提示された技術はまた、ケラチンマスキングのエピトープの発現の変動性などの生物学的要因によって制限される場合があります。これは、卵巣と上皮間葉移行（EMT）を受けるか、非上皮成分または幹細胞¹⁶に濃縮されている乳がん、を含む、これらのがんに特に懸念されるなど、最近で発生することが示されているかもしれない化学療法- 試験管^17、および治療^​​18〜応答における乳癌患者の卵巣癌を治療。この制限は、EMT ¹⁶にアップレギュレートされるサイトケラチンプラスビメンチン、などの代替マスキング抗体（または抗体のカクテル）、使用して克服することができる。加えて、組織の他のコンポーネント（マイクからroenvironment）、線維芽細胞や血管内皮細胞はまた、ますます生物学的治療の標的とされているような、技術はまた、血管内皮細胞に対して染色するなどPECAM / CD31のような関心の区画のための特定のマスクを、使用して、これらのコンポーネントを獲得するために拡張される。

シンプソンの指数の適応は、その単純さのため、現在のプロトコルの不均一性の尺度として使用されているが、異質のその他の措置は、中心傾向の単純な測定値（平均、分散、中央値など）として、使用することができる。また、シンプソンの指数の計算は、より良い特定のテストの人口に合わせて変更することができます。 Z -スコアの変換の使用は、異質性がデータセットの平均値周りの偏差に​​基づいているので、得点が複数のマーカーのためのより適切にすることができます。しかし、得点の全体の範囲は、変換のこのタイプに制限することができます。設計によっては、方が適切な場合があります。単に特定のマーカーセットのすべてのサンプルのため実際のAQUAスコアをbinに。ビンとカットオフの数の選択もつながると代替実験的な設計に最適化される値の範囲の制限です。

我々は、彼らがすでに診療所で使用されているので、標的療法の有効性に関して、関連する臨床上の疑問に答えるため、バイオマーカー候補として現在の研究でERとHER2を使用している、と主と遠くにかなりの異質性と変化を示すことが知られている病気^19。しかしながら、異質性の最適なマーカーは決定されていない。他の可能性は、以前に間期FISHの研究²⁰で使用されるようなクローンの細胞遺伝学的マーカーが含まれる場合があります。アプローチは、さらにがんの生物学では、このパラメータの妥当性を確立するために大規模な、よく注釈付きの臨床コホートまたは臨床試験のさらなる検証が必要です。

JC、MG、CJ、そしてCSはHistoRx、（株）の従業員です

、この作品は、スコットランドの財政審議会（承認番号HR07005によって部分的にサポートされていましたhttp://www.sfc.ac.uk/医学研究スコットランド（、） http://www.medicalresearchscotland.org.uk/ ）、がん研究英国の実験がん医学センター（ http://www.cancerresearchuk.org/~~V ）、および画期的な乳がん（ http://breakthrough.org.uk/ ）。