Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster'ın kas Hazırlık

Bir doku hazırlanması, görselleştirme ve yaşam mikrosirkülasyon deneysel manipülasyon için tarif edilir. Anestezi erkek farelerde, ince, yüksek vaskülarize Cremaster'ın kas arteriol, kapiller ve venüllerde mikrovasküler ağları da dahil olmak üzere çalışma intravital mikroskopi için hazırlanmıştır. Bu preparat, sıçan ve hamster için kolayca adapte.

Homeostazının korunması, vücutta metabolik yan ürünleri ile kaldırılması ile oksijen ve besin eşlik eden sabit bir kaynağı gerektirir. Bu denge kan, tüm doku ve organları boyunca vasküler kaynağı en küçük dalları kapsayan mikrosirkülasyon aracılığıyla hareketi ile elde edilir. Arterlerden arteriol şube parankimal hücreleri ile yakından ilişkili çok sayıda kılcal damarların akan oksijenli kan dağılımı ve büyüklüğü kontrol ağları oluşturur. Kılcal damarların doku hücreleri ve kan akımı arasındaki difüzyonal değişimi için büyük bir yüzey alanı sağlar. Venüllerde kılcal atık toplamak ve kalbe doğru deoxygenated kan dönüş olarak yakınsama. Görselleştirilmesi ve yaşam mikrosirkülasyon manipüle için gerçek zamanlı olarak bu süreçleri gözlemek için deneysel bir yaklaşım gerektirir.

Sıçan Cremaster'ın kas ilk histoloji ve elektron mikroskobu post mortem ^1,2 kullanılarak inflamasyon çalışmaları için bir model olarak kullanılmıştır. Maruz sağlam sıçan Cremaster'ın kas in vivo raporda ilk ışığı ³ yansıyan vazoaktif ilaçlar mikrovasküler tepkiler araştırdık. Ancak bu hazırlık odaklı aydınlatma eksikliği kas ve eğrilik yararlılığı sınırlı. Büyük bir atılım, kas açılış testis ayrılmakta ve bileşik mikroskop altında ⁴ transillüminasyon için düz bir levha olarak radyal yayılmasını gerektirmişti. Sıçanlarda ⁵ ve hamster ⁶ mikrosirkülasyon fizyolojisi incelemek için değerli bir hazırlık olduğu gösterilmiş olsa da, farelerde ⁷ Cremaster'ın kas mikrovasküler fonksiyon ^8-11 ve hücrelerarası gerçek zamanlı görüntüleme düzenleyen hücresel yollar diseksiyon özellikle yararlı olduğunu kanıtlamıştır ¹² sinyalizasyon.

Testisler inguinal kanal ¹³ üzerinden iner gibi Cremaster'ın kas iç oblik ve transvers abdominus kas türetilmiştir. Ve testislerin sıcaklığını korumak: destek (Cremaster'ın = askı Yunanca) hizmet vermektedir. Burada açıklandığı gibi, Cremaster'ın kas üstün optik çözünürlük için ince düz bir levha olarak hazırlanmıştır. Fare istikrarlı bir vücut ısısı ve anestezi düzlemde devam cerrahi hazırlık, çevredeki doku ve testislerin fizyolojik tuz çözeltisi ile sürekli sulama ise kas kurtararak, silastik kauçuk şeffaf kaide üzerine yayılan ve böcek iğneli kenarları güvence . İşbu Protokol arterioler endotel hücreleri GCaMP2 transgenik farelerin ifade kullanır. GCaMP2 genetik olarak kodlanmış bir floresan kalsiyum göstergesi ^molekülü 12 . Widefield görüntüleme ve yoğun bir şarj çiftli aygıt kamera arterioler endotel kalsiyum sinyal in vivo çalışmada sağlar.

1. Fare kurulu, kas kaide, vücut kama ve superfusion çözümü

1. Fare kurulu: şeffaf bir dikdörtgen Pleksiglas kartı (6 "geniş X 8" uzun X 3 / 16 "kalın) mikroskop sahne sığacak şekilde yapılır." Anestezi fare cerrahi hazırlanması sırasında güvenli olduğu fare board " Cremaster'ın kas.
2. Kas kaide: şeffaf silastik kauçuk kaide, üreticinin ° talimatlarına göre karışık Sylgard 184, hazırlanır. Uygun bir kalıp, 15 mm kalınlığında x 50 mm çap çap tek Petri kabı. Sylgard blok bir jilet (Şekil 1C bakın.) Istenilen şekilde kesilir. Berrak su geçirmez silikon yapıştırıcı ince bir tabaka fare kuruluna Sylgard blok güvence altına almak için kullanılır. Faydalı ipuçları: Petri kabı içine Sylgard dökme, bir saat için bir vakum odasında gaz alma, sonra hava kabarcıkları ortadan kaldırır ve netliğini artırır. Sylgard için süre 50 ° C'de birkaç saat için bir laboratuvar fırın, bulaşık koyarak kısalır kür, gaz alma sonra.
3. Vücut kama ve ısıtma platformu: fare altında ve kaide karşı konumlandırılmış bir kama (2 "X 4" X 15 °) kökeni kaide üzerinde Cremaster'ın kas uzanan kolaylaştırır, vücudun ileri yatırır. Yüzeyine alüminyum bir platformda birleştiren iletken ısı sağlar. Bu platform, bir DC güç kaynağı (Şekil 1A) bağlı dirençler tarafından ısıtılır. Kalibre platform sıcaklığı ~ 40 ° C ~ 37 özofagus sıcaklığı korur ° C Aksi takdirde, bir lamba radyant ısı kullanılır.
4. Pins. Cremaster'ın kas kaide üzerinde güvenli hale getirmek için bir "L" şeklini içine bükülmüş 0.15 mm böcek pimleri, iğne hazırlanır.
5. Fizyolojik tuz solüsyonu (PSS). Hazırlıklar ultra saf (M 18.2) H ₂ O. hazırlanan bikarbonat-tamponlu PSS sürekli superfused (sulanan) Stok çözümleri 20X son çalışma konsantrasyonda hazırlanan ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edilir. 4 saklandığında Stok çözümleri birkaç hafta için iyi kalır ° C Bikarbonat tuzları ayrı ayrı hazırlanması ve deney günü seyreltme ile karıştırılarak kalsiyum bikarbonat yağış önler. Stok tuz solüsyonu (mmol / L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgS0 _4, 23.4 CaCl ₂ oluşur. Stok bikarbonat 360 NaHCO _3. Bir denemenin yapıldığı gün, ilgili çözümler ölçülü balona son hacmi (genellikle belirli bir deney için 2 L) getirilir ve bir su banyosuna yerleştirilir ~ 37 ° C'de PSS değişikti% 5 CO ₂ / ~ 15 dakika bir gaz dağıtıcı kullanarak% 95 N ₂ ~ 7.4 pH ayarlar ve yağış önler. PSS% 5 CO ₂ /% 95 N ₂ deneyler boyunca sürekli kabarmış. Son çalışma çözeltisi bileşimi (mmol / L): 132 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgS0 _4, 2 CaCl _2, 18 NaHCO _3.

2. Anestezi ve ameliyat için hazırlık

1. Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra, en az 12 hafta eski erkek fareler kullanılır. Fare pentobarbital sodyum (60 mg / kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi. Frenleyici tüp ilk enjeksiyon sırasında fare güvenliğini sağlamak için yararlı kanıtlıyor. Cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi gibi gerekli takviyeleri (% 10-20, ilk enjeksiyon ip) (parmak veya kuyruk tutam çekilme yanıt belirtilen her 30-60 dakika) tarafından korunur. İpucu: Sulandırma pentobarbital 10 mg / ml steril serum fizyolojik enjeksiyonu, doz aşımı olasılığını azaltır.
2. Anestezi fare ilk enjeksiyondan hemen sonra sıcak tutulmalıdır böylece ısı düzenleme uzlaşır. (Havalandırılan alüminyum sepet) ısıtma plakasının üstüne metal bir taşıyıcı fare yerleştirilmesi (~ 37 kalibre ° C) iyi çalışır. Alternatif olarak, bir ısı lambası özen fare uygun bir mesafe konumlandırmak için kullanılabilir. Uygun anestezi düzeyi (parmak veya kuyruk tutam çekilmesi eksikliği) elde edilene kadar fare her 5-10 dakika takip edilmelidir. 15-20 dakika sonra ek doz gerekebilir. Sabırlı olun ve özellikle obez veya yaşlı hayvanların aşırı dozda önlemek için dikkatli devam etmek en iyisidir.
3. Saç dikkatle ilgili bölgelerde tıraş alt karın, bel, skrotum ve bacakları kaldırılır. Aksi Cremaster'ın kas zarar skrotum ve testisler, travmayı önlemek için özellikle dikkat alınmalıdır. Taze bir alkollü bez ile gevşek saç çıkarın.
4. Mesane dolu ise karın duvarı üzerinden küçük bir üzüm gibi hissedeceksiniz. Cremaster'ın hazırlık deneyler sırasında idrar fare önlemek için hafif basınç mesane boşaltın. Kimwipe toplama bir etkisi süngert idrar.
5. Bacaklarını kaide straddling kama yatarken, sırtında fare yerleştirin. Her ayağın bağlı bir ipek sütür (4-0 veya 5-0), kaide karşı kasık fare güvenliğini sağlamak için bir ip sağlar. Göğsünde gevşek yerleştirilir ve kama için güvenli bir parça bant genel vücut konumunu sürdürmektedir. Mikrodiseksiyon makas ve açılı forseps kullanarak stereomikroskopta üzerinden izlerken Cerrahi işlemler yapılmaktadır.

3. Açık Cremaster'ın kas Cerrahi hazırlık

1. Pin skrotal kese apeks (ya sağ ya da sol tarafı) ile cilde gerginlik yere kaide yerleştirilir ve sabitlenir. PSS (34-35 ° C) ile Superfusion cerrahi alanın üzerine başlatılan ve maruz kalan doku sıcak ve nemli tutmak için diseksiyon boyunca korunur. Skrotal kese ve diğer sonraki bir vakum hattına yanında bir ucundan bir fitil yerleştirilmiş (Kimwipe yapılan), atık su PSS kaldırır. Pleksiglas kurulu yapıştırılır ve kama tamamen çevreleyen ve kaide aspire olmayan herhangi bir PSS toplamak için "hendek" olarak hizmet vermektedir mikroskop üzerine PSS kaçağını önlemek için etkili bir önlem olarak hizmet silikon bir boncuk.
2. Skrotal kese ventral yüzeyi boyunca bir kesi yapılır. Testis karın boşluğuna Cremaster'ın kas retrakte olması durumunda, alt karın kese içine hafif bir basınç testisin yönlendirir. Testis üzerinde Cremaster'ın kas yüzeyi, şu anda tespit edilmelidir. Bağ dokusu, skrotal cilt ve Cremaster'ın kas arasındaki Cremaster'ın doku çevresindeki kas serbest dikkatle kaldırılır.
3. Skrotal cilt hafifçe kaide proksimal kenarı arkasında retrakte ve her iki tarafında bir iğne ile güvence altına alınmıştır. Cremaster'ın kas yüzeyi dış yüzeyi daha sonra bağ dokusu temizlenir. Diseksiyonu nemlendirir bağ dokusu sırasında sürekli superfusion, görünürlük ve kaldırma kolaylaştırılması.
4. Cremaster'ın kas apeks ile pin boyuna gerilim altında yerleştirmek için kullanılır. Vasküler arz kesintileri en aza indirmek için alınan büyük bir özen ile kas ventral uzunlamasına bir kesi ile yapılır. Bu doku hasarı ¹⁴ hazırlık çevresine yakın kan akışını dinamikleri değişmiş. Bu nedenle, en aza indirmek için bu görüntüleme ve fizyolojik çalışmalar için kullanılan veri toplama, hazırlama merkezine yakın kan damarlarını etkiler.
5. Cremaster'ın kas epididim testisin altında ince bir bağ ile bağlıdır. Bir tarafa testis yansıtan epididim dikkatli bir şekilde ayrılmış olan bu bağ, ortaya çıkarır. Cremaster'ın kas apeks civarında küçük arter ve ven epididim bağlamak. Forseps arasında bu gemiler kapatılmasıy ve bunları birbirinden çekerek kanama en aza indirir. Testis, epididim, testis arter ve ven, (4-0 veya 5-0 ipek sütür) proksimale bağlandı ilgili kasık yağ yastığı ile birlikte kopmuş ve (orşiektomi) atılır. Alternatif olarak, testis karın boşluğuna hafifçe geri itti ve bir parça pamuk veya Kimwipe ile muhafaza edilebilir. Orşiektomi testisler karın boşluğuna geri iterek, doku mümkün travması önlemek için hizmet vermektedir. Biz işlemi ^7,15 birini kullanarak Cremaster'ın mikrosirkülasyon hazırlık kalitesinde gözle görülür farklılıklar (bkz. Bölüm 3.8) bulamadı.
6. Cremaster'ın kas dış yüzeyinde kalan bağ dokusu temizlenir ve daha sonra kaide yüzeyinde radyal yayıldı. Kenarları bozulmamış mikrosirkülasyon çizgili kas düz bir sayfa oluşturmak için 5-6 yerlerde pimleri (bkz. Bölüm 1.4) ile teminat altına alınmıştır.
7. Tamamlanan hazırlık aşamasında, intravital bir mikroskop, (3-5 ml / dk, 34 ° C) sürekli superfused ve 30 dakika için dengelenmiş.
8. Cremaster'ın hazırlık Dürüstlük, çeşitli kriterlere göre değerlendirilecektir. Minimal cerrahi travma ile Spontan vazomotor sesi arteriol ve venüller yapışık lökosit eksikliği tempolu akışı ile gösterilir. En hassas, duyarlı bir hazırlık indeks 5-10 dakika superfusion çözüm oksijen içeriği yükselterek arteriyollerin daralma. Bu% 21 O ₂ ile değişikti tarafından yapılır (vs% 5 O _2; bkz. Bölüm 1.5,% 5 CO _2, denge N _2). Arteriollerde lökosit varlığı, yokluğu, kılcal damarların akan kırmızı kan hücreleri ve / veya venüller biriken ve çevre dokulara lökosit, doku hasarı ve inflamasyon belirtileri.

4. Cremaster'ın kas mikrosirkülasyon intravital görüntüleme

1. Olympus MVX10 Stereo Zoom platformu dayalı özel bir mikroskop intravital görüntüleme yapılır. MVX10 mikroskop vücutMVX10 melez standı aydınlık (Köhler) görüntüleme için transillüminasyon (halojen lamba) ve floresan görüntüleme için epi-aydınlatma (cıva lambası) ile donatılmış bir monte edilir. Epi-aydınlatma kullanarak, GCaMP2 520/35 nm'de emisyon toplanan ile 472/30 nm heyecanlı. Piper Kontrol Yazılımı (SPI) ile bir kişisel bilgisayar; XR/Mega-10 yoğun bir dijital fotoğraf makinesi (SPI Stanford Fotonik, Inc.) Kullanarak; Görüntüler MV PLAPO 2XC lens (Olympus sayısal diyafram = 0.50) ile elde edilir. Bu sistem sayesinde, view (FOV) gözlenen alan 553 mm X 442 mm, 22 mm X 18 mm çeşitli olabilir.
2. Intravital görüntüleme deneylerin tamamlanmasından sonra, anestezi fare servikal dislokasyon pentobarbital doz aşımı ile ötenazi.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1 fare Cremaster'ın hazırlık intravital görüntüleme için Fare kurulu. A) alüminyum platformu ile Vücut kama (sarı plastik izolasyonlu) alttan izlendi. Platformun alt güvenli Isıtma dirençleri yapılan ısı sağlar. B) ısıtma platformu, bir plastik takoz aittir. C) vücut kama cerrahi ve intravital mikroskop sahne sonraki transfer için bir Pleksiglas tahta üzerine yerleştirilir. Sylgard kaide kırmızı ok ile gösterilir. Su geçirmez silikon boncuk mikroskop damlamasını engelleyen intravital prosedürü sırasında sızıntı olabilir herhangi bir çözüm içeren tüm hazırlık çevreler.

Şekil 2: widefield görüntüleme Özel MacroZoom mikroskop . A) MVX10 mikroskop XR/Mega-10 ICCD kamera ile vücut (Olympus) (Stanford Fotonik) trinoküler port üzerine monte edilmiş. B) mikroskop vücut Close-up. (A) Zoom kontrolü (0.63 6.3x), (b) filtre tekerleği, (c) görüntü doubler'i (25X optik büyütme ile NA = 0.50). C) Askat aydınlık (Köhler) aydınlatma (Kondenser NA = 0.55, Çalışma Mesafesi = 27 mm) için kondansatör.

Şekil 3 fare Cremaster'ın hazırlık tamamlandı. Sıcak plastik kaplamalı alüminyum platform (sarı) yatar pozisyonda anestezi altında fare. Vücut pozisyonu bant ile sabitlenir. Cremaster'ın kas şeffaf silastik lastik kaide üzerinde radyal yayıldı ve kenarlarında tutturulmuş. Superfusion çözüm plastik damlatıcı (beyaz ok) ile proksimal sonunda tanıtıldı. Bir vakum hattı (beyaz ok ucu) Kimwipe fitil yoluyla çözüm kaldırır. İki mikropipetler doku ve ipuçları ile yer gösterilir. Cremaster'ın kasının alt kenarında bir referans elektrot (gümüş tel) güvence altına alınmıştır.

Şekil 4 endotelde GCaMP2 arterioler ağları ifade görselleştirmek için büyütme aralığı anlama. A)) Floresan ve B aydınlık görüntü, video monitör toplam = 42x büyütme için 3.2x optik büyütme alınır. [Görüş alanı (FOV) = 4375 x 3470 mm. Ölçeği bar = 500 mm. Bu büyütme Çalışmak istenilen noktada mikropipetler yerleştirme kolaylaştırır. Toplam büyütme 6.4X optik büyütme alınan C) Floresan ve D) aydınlık görüntü = 83x (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Ölçeği bar = 200 mm. E) Floresan ve F) aydınlık görüntü toplam büyütme 12.6X optik büyütme = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Ölçeği bar = 100 mikron. G) görüntü katlayıcı, optik büyütme = 25.2X. Ölçek çubuğu = 50 mm.

Burada, in vivo olarak mikrosirkülasyon gözlemlemek için fare açık Cremaster'ın kas hazırlık açıklar . Bu prosedür, ilk ^olarak rat 4 açıklanan "açık" Cremaster'ın hazırlık sonra modellenmiştir. Uygulama ile tüm cerrahi işlem en az 1 saat içinde tamamlanabiliyor. Bu preparatın çeşitli deneysel manipülasyon için çok yönlülük sağlar ve benzer bir biçimde incelenmesi gereken çeşitli deneysel modellerin kolayca sağlayan, hamsterlar olarak sıçanlara uyarlanmıştır. Hazırlık erkek hayvanların sınırlı ve ^{ölçümleri,} 14 kas kenarlarına yakın hasarlı bölgeler kaçınarak, dokusunun merkeze doğru yapılmalıdır . Ayrıca, basınç ve debi dağılımları Cremaster'ın kas damarları ^birbirine 16 kesilir değişmiş iken, mikrodamarlar duyarlı ve tekrarlanabilir veri toplama için uygun kalır, kabul edilmelidir . Cremaster'ın kas mikrosirkülasyon görselleştirmek için birincil kısıtı özellikle sıçanlarda hem de hamster, olgun hayvanlar ve boyutu artış gibi bağ dokusu oluşumunu. Ayrıca, hayvanların yağ olsun, pentobarbital lipofilik ve adipoz dokuda absorbe edilebilir, çünkü anestezi kontrol etmek daha da zorlaşıyor. Ilerlemek için en iyi yolu olduğunu, hayvanın ° vücut sıcaklığını 37 ~ muhafaza sağlarken hasta tarafından ° C maruz kalan doku PSS ile sürekli sulanmaktadır.

Missouri Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmış ve hayvanları da içeren tüm prosedürleri ve protokolleri için National Institutes Sağlık Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu ile uyum içinde gerçekleştirildi.
Bu video-makale Üretim Stanford Fotonik tarafından sponsor oldu.

Yazarların laboratuar araştırmalar, Ulusal Sağlık hibe R37-HL041026, R01-HL086483 ve R01-HL056786 (SSS) ve Amerika Birleşik Devletleri Halk Sağlığı Servisi F32-HL097463 ve T32-AR048523 (PB) Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.