O Mouse Preparação Muscle Cremaster for Imaging intravital da Microcirculação

A preparação do tecido é descrito para visualização e manipulação experimental da microcirculação vida. Anestesiados em camundongos machos, o fino, altamente vascularizado do músculo cremaster está preparado para microscopia intravital para estudar redes microvasculares incluindo arteríolas, vênulas e capilares. Esta preparação é facilmente adaptada para ratos e hamsters.

Todo o corpo, a manutenção da homeostase requer o fornecimento constante de oxigênio e nutrientes concomitante com a remoção de subprodutos metabólicos. Este equilíbrio é conseguido pelo movimento do sangue através da microcirculação, que engloba o menor ramos do suprimento vascular em todos os tecidos e órgãos. Arteríolas ramo das artérias, formando redes que controlam a distribuição e magnitude de sangue oxigenado flui para o grande número de capilares intimamente associados às células do parênquima. Capilares fornecem uma grande superfície para a troca de difusão entre as células do tecido e o fornecimento de sangue. Vênulas coletar efluentes capilar e convergem como o retorno do sangue oxigenado para o coração. Para observar esses processos em tempo real requer uma abordagem experimental para visualizar e manipular a microcirculação vida.

O músculo cremaster de ratos foi usado primeiramente como um modelo para estudar a inflamação com histologia e microscopia eletrônica de ^1,2 post mortem. O primeiro relatório vivo do músculo cremaster de ratos expostos intactos investigado microvascular respostas a drogas vasoativas usando luz refletida ^3. No entanto curvatura do músculo e da falta de iluminação focada para limitar a utilidade desta preparação. O grande avanço implicou a abertura do músculo, destacando-o do testículo e espalhando-radialmente como uma folha de apartamento em transiluminador sob um microscópio composto ^4. Enquanto demonstrado ser uma preparação valiosa para estudar a fisiologia da microcirculação em ratos ⁵ e ⁶ hamsters, o músculo cremaster em camundongos ⁷ tem-se revelado particularmente úteis em dissecar as vias celulares envolvidos na regulação da função microvascular ^8-11 e imagens em tempo real da intercelular sinalização ^12.

O músculo cremaster é derivada da musculatura abdominal oblíquo interno e transverso como os testículos descem pelo canal inguinal ^13. Ela serve para dar suporte (em grego: cremaster suspender =) e manter a temperatura dos testículos. Como descrito aqui, o músculo cremaster é preparado como uma folha fina apartamento em excelente resolução óptica. Com o mouse mantido a uma temperatura do corpo estável e plano de anestesia, preparo cirúrgico envolve a desinserção do músculo do tecido circundante e os testículos, espalhando-a sobre pedestal transparente de borracha silastic e assegurar as bordas com alfinetes de insetos, enquanto irrigando-lo continuamente com solução salina fisiológica . O presente protocolo utiliza camundongos transgênicos expressando GCaMP2 arteriolar em células endoteliais. GCaMP2 é geneticamente codificado fluorescente de cálcio ¹² molécula de indicador. Widefield de imagem e uma câmera do dispositivo de carga acoplado intensificou-enable estudo in vivo de sinalização de cálcio no endotélio arteriolar.

1. Rato bordo, pedestal muscular, corpo e cunha solução superfusão

1. Rato bordo: A bordo retangular transparente Plexiglas (6 "de largura X 8" X longo 3 / 16 "de espessura) é feito para caber no palco do microscópio A". Bordo mouse "é o lugar onde o rato anestesiado é garantido durante a preparação cirúrgica do o músculo cremaster.
2. Pedestal músculo: Um pedestal de borracha transparente silastic é preparado a partir Sylgard 184, que é misturado de acordo com as instruções do s · Fabricante. Um molde conveniente é a 15 mm de espessura x 50 mm de diâmetro diâmetro placa de Petri descartável. O bloco Sylgard é cortada no formato desejado com uma lâmina de barbear (ver Figura 1C).. Uma fina camada de adesivo de silicone à prova d'água clara é usado para proteger o bloco Sylgard à placa de mouse. Dicas úteis: Após o vazamento do Sylgard em placa de Petri, desgaseificação em uma câmara de vácuo por uma hora remove as bolhas de ar e melhora a clareza. Seguintes desgaseificação, tempo de cura para Sylgard é encurtado, colocando o prato num forno de laboratório a 50 ° C por várias horas.
3. Cunha corpo e plataforma de aquecimento: Uma cunha (2 "X 4" X 15 °) posicionada embaixo do mouse e contra o pedestal inclina o corpo para a frente o que facilita a extensão do músculo cremaster sobre o pedestal de sua origem. Incorporação de uma plataforma de alumínio sobre a superfície fornece calor condutivo. A plataforma é aquecido por resistências conectado a uma fonte de alimentação DC (Figura 1A). Calibrar a temperatura plataforma para ~ 40 ° C mantém a temperatura do esôfago em ~ 37 ° C. Caso contrário, o calor radiante a partir de uma lâmpada é utilizada.
4. Pinos. Para proteger o músculo cremaster no pedestal, os pinos são preparados a partir de 0,15 milímetros pinos de insetos que foram dobrados em um "L".
5. Solução salina fisiológica (PSS). Os preparativos estão superfused (irrigado) continuamente com bicarbonato-buffered PSS preparado em ultrapura (18,2 mohms) H ₂ O. As soluções de reserva são preparadas na concentração final 20X de trabalho e esterilizadas através de um filtro M 0,2. As soluções de reserva permanecem boas por várias semanas quando armazenado a 4 ° C. Preparar sais separadamente do bicarbonato e mistura-los com a diluição no dia do experimento impede a precipitação de bicarbonato de cálcio. A solução de sal de ações é composto de (em mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 _4, 23,4 CaCl _2. O bicarbonato de ações é de 360 NaHCO _3. No dia de um experimento, soluções respectivas são levados a um volume final (normalmente 2 L para um dado experimento) em um balão volumétrico e colocado em banho-maria a ~ 37 ° C. Equilibrar o PSS com 5% de CO ₂ / N ₂ 95% para ~ 15 minutos usando um dispersor de gás ajusta o pH para ~ 7,4 e evita a precipitação. O PSS é borbulhado continuamente com 5% CO ₂ / N ₂ 95% ao longo experimentos. A composição solução final de trabalho (em mmol / L) é: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgS0 _4, 2 CaCl _2, 18 NaHCO _3.

2. Anestesia e preparação para a cirurgia

1. Após a aprovação do Animal Care Institucional e Comitê de Uso, camundongos machos, pelo menos, 12 semanas de idade são usados. O rato é anestesiados com pentobarbital sódico (60 mg / kg) via injeção intraperitoneal (ip). Um tubo de restrição se mostrou útil para proteger o mouse durante a injeção inicial. Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, a anestesia é mantida por suplementos (10-20% da injeção inicial, ip), conforme necessário (a cada 30-60 minutos, indicado pela retirada de resposta aos pés ou beliscar a cauda). Dica: Diluir o pentobarbital 10 mg / ml em solução salina estéril antes da injeção reduz a possibilidade de overdose.
2. Anestesia compromete regulação da temperatura para que o mouse deve ser mantido quente imediatamente após a primeira injeção. Colocar o mouse em um portador de metal (alumínio cesta ventilado) em cima de uma placa de aquecimento (calibrado para ~ 37 ° C) funciona bem. Alternativamente, uma lâmpada de calor pode ser usado tendo o cuidado de posicioná-lo a uma distância adequada do mouse. O mouse deve ser monitorada a cada 5-10 minutos até que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de retirada aos pés ou beliscar a cauda). A dose suplementar pode ser necessária após 15-20 minutos. É melhor ser paciente e proceder com cautela para evitar overdose, especialmente com animais obesos ou idosos.
3. O cabelo é removido da parte inferior do abdome, costas, pernas e escroto com cuidado barbear respectivas regiões. Atenção especial deve ser tomado para evitar o trauma do escroto e dos testículos, que de outra forma prejudicar o músculo cremaster. Remover cabelo solto com um algodão embebido em álcool fresco.
4. Se a bexiga está cheia ele vai se sentir como uma uva pequena através da parede abdominal. Esvaziar a bexiga com uma leve pressão para evitar que o rato de urinar na preparação cremaster durante as experiências. A Kimwipe é uma esponja efeito a coletat urina.
5. Posicione o mouse em suas costas, deitado sobre a cunha com as pernas straddling o pedestal. Um fio de seda (4-0 ou 5-0) ligada a cada pé fornece uma corda para segurar o mouse com a sua virilha contra o pedestal. Um pedaço de fita colocada frouxamente no peito e preso à cunha mantém a posição do corpo em geral. Procedimentos cirúrgicos são realizados durante a visualização através de um estereomicroscópio com uma tesoura de microdissecção e pinças anguladas.

3. Preparação cirúrgica do músculo cremaster aberto

1. Um pino é colocado através do ápice do saco escrotal (ou o lado esquerdo ou direito) e fixado no pedestal para colocar a tensão na pele. Superfusão com ESP (34-35 ° C) é iniciado sobre o campo cirúrgico e mantida durante toda a dissecção para manter o tecido exposto quente e úmido. Um pavio (feito de Kimwipe) posicionados com uma ponta ao lado do saco escrotal e no próximo demais para uma linha de vácuo remove o PSS efluentes. Um cordão de selante de silicone adere à placa de Plexiglas e completamente circundando a cunha e pedestal serve como "fosso" para coletar qualquer PSS que não é aspirado, servindo como uma precaução eficaz para evitar vazamento de PSS para o microscópio.
2. É feita uma incisão ao longo da superfície ventral do saco escrotal. Se o testículo foi recolhido pelo músculo cremaster na cavidade abdominal, pressão suave sobre o abdome inferior direciona o testículo no saco. A superfície do músculo cremaster cobre o testículo deve ser identificado no momento. Tecido conjuntivo entre a pele escrotal eo músculo cremaster é cuidadosamente removida para liberar o músculo cremaster do tecido circundante.
3. A pele escrotal é suavemente recolhido por trás da borda proximal do pedestal e protegido em cada lado com um alfinete. A superfície exterior da superfície do músculo cremaster é, então, limpa de tecido conjuntivo. Superfusão contínua durante hidratos dissecção do tecido conjuntivo, facilitando a visibilidade e remoção.
4. Um pino através do ápice do músculo cremaster é usado para colocá-la sob tensão longitudinal. Uma incisão longitudinal é feita através da superfície ventral do músculo com grande cuidado para minimizar a interrupção do suprimento vascular. Dinâmica do fluxo de sangue perto da periferia da preparação são alteradas pelo presente ¹⁴ dano tecidual. Portanto, para minimizar esses efeitos sobre a coleta de dados, os vasos sanguíneos perto do centro da preparação são usados ​​para geração de imagens e estudos fisiológicos.
5. O músculo cremaster está ligado por um ligamento fino para o epidídimo debaixo do testículo. Refletindo o testículo de um lado expõe esse ligamento, que é cuidadosamente separado do epidídimo. Próximo ao ápice do músculo cremaster é pequena artéria e veia que conectá-lo ao epidídimo. Oclusão desses vasos entre fórceps e separá-las minimiza o sangramento. O testículo, epidídimo, artéria e veia testicular são ligadas proximalmente (4-0 ou 5-0 fio de seda), cortada e descartada (orquiectomia), juntamente com a almofada de gordura associado inguinal. Alternativamente, o testículo pode ser empurrou de volta para a cavidade abdominal e retidos com um pedaço de algodão ou Kimwipe. A orquiectomia serve para evitar possíveis trauma para o tecido ao empurrar os testículos de volta para a cavidade abdominal. Não encontramos diferenças notáveis ​​na qualidade da preparação microcirculação cremaster (ver secção 3.8) usando o procedimento ^7,15.
6. A superfície externa do músculo cremaster é inocentado de remanescentes do tecido conjuntivo e depois se espalhou radialmente sobre a superfície do pedestal. As bordas são fixados com pinos (ver secção 1.4) em 5-6 lugares para criar uma folha plana de músculo estriado com microcirculação intacta.
7. A preparação pronta é transferida para o estágio de um microscópio intravital, superfused continuamente (3-5 ml / min, 34 ° C) e equilibrado por 30 minutos.
8. Integridade da preparação cremaster é avaliada de acordo com vários critérios. Espontânea tônus ​​vasomotor com trauma cirúrgico mínimo é indicado pelo fluxo rápido nas arteríolas e falta de leucócitos aderentes em vênulas. O índice mais sensível de uma preparação adequada é a constrição das arteríolas para elevar o teor de oxigênio superfusão solução por 5-10 minutos. Isto é feito através de equilíbrio com 21% O ₂ (vs. 5% O _2; ver Seção 1.5, todos com 5% de CO _2, o balanço N _2). A presença de leucócitos nas arteríolas, a ausência de células vermelhas do sangue que flui através de vasos capilares, e / ou leucócitos acumulando em vênulas e tecido circundante são sinais de dano tecidual e inflamação.

4. Imagem intravital da microcirculação do músculo cremaster

1. Intravital imagem é realizada em um microscópio personalizado com base em uma plataforma Zoom Olympus MVX10 Stereo. O corpo do microscópio MVX10é montado em um híbrido MVX10 estar equipado com transiluminação (lâmpada halógena) para campo claro de imagem (Köhler) e com epi-iluminação (lâmpada de mercúrio) para imagens de fluorescência. Usando epi-iluminação, GCaMP2 está animado com nm 472/30 com emissão coletadas em nm 520/35. Imagens são adquiridas através de um PLAPO MV 2XC lente (abertura numérica = 0,50; Olympus) usando um XR/Mega-10 intensificou câmera digital (Stanford Photonics, Inc.; SPI), através de Piper Controle Software (SPI) em um computador pessoal. Com este sistema, o campo observado de visão (FOV) pode variar de 553 mM mM X 442 a 22 mm X 18 mm.
2. Após a conclusão de experimentos com imagens intravital, o mouse é anestesiado sacrificados com overdose de pentobarbital seguido por deslocamento cervical.

5. Resultados representante

Figura bordo do rato 1. Intravital para geração de imagens da preparação cremaster mouse. A) Corpo cunha com plataforma de alumínio (isolados com plástico amarelo) visto de baixo. Resistências de aquecimento garantido ao lado de baixo da plataforma de fornecer calor conduzida. B) A plataforma de aquecimento repousa sobre uma cunha de plástico. C) A cunha corpo é colocado em uma placa de Plexiglas para cirurgia e posterior transferência para o palco do microscópio intravital. Pedestal Sylgard é indicado com a seta vermelha. Um cordão de silicone à prova d'água envolve toda a preparação para conter qualquer solução que podem vazar durante o procedimento intravital, impedindo que gotejava sobre o microscópio.

Figura 2. Microscópio MacroZoom personalizado para campo amplo de imagem. A) MVX10 corpo do microscópio (Olympus) com câmera XR/Mega-10 ICCD (Stanford Photonics) montado na porta trinocular. B) ver Close-up do corpo do microscópio. (A) ampliar o controle (0,63 a 6,3 vezes); (b) roda de filtros, (c) Imagem do dobrador (NA = 0,50 com ampliação de 25X óptico). C) condensador Substage para brightfield iluminação (Köhler) (Condensador NA = 0,55 Distância, Trabalho = 27 mm).

Figura 3. Completed do mouse preparação cremaster. Rato anestesiado em decúbito dorsal na plataforma de alumínio revestido de plástico quentes (amarelo). Posição do corpo é presa com fita adesiva. O músculo cremaster se espalha radialmente sobre o pedestal de borracha transparente silastic e preso nas bordas. Superfusão solução é introduzida na extremidade proximal por meio de um gotejador de plástico (seta branca). A linha de vácuo (seta branca) remove a solução através de um pavio Kimwipe. Duas micropipetas são mostrados posicionados com as pontas do tecido. Um eletrodo de referência (fio de prata) é fixado na borda inferior do músculo cremaster.

Figura 4. Ilustrando a gama de ampliação para a visualização de redes arteriolar expressar GCaMP2 no endotélio. A) fluorescentes e B) imagem de campo claro tomada em uma ampliação ótica de 3,2 x para uma ampliação total = 42X no monitor de vídeo. [Campo de visão (FOV) = 4.375 x 3.470 M]. Barra de escala = 500 mm. Trabalhando com este aumento, facilita a colocação de micropipetas nos locais desejados. C) fluorescentes e D) imagem de campo claro tomadas na ampliação ótica de 6.4X para ampliação total = 83X (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Barra de escala = 200 mM. E) fluorescentes e F) imagem de campo claro tomadas na ampliação ótica de 12,6 vezes para ampliação total = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Barra de escala = 100 mm. G) Com doubler imagem ampliação, óptico = 25.2X. Barra de escala = 50 mm.

Aqui, descrevemos a preparação do músculo cremaster em aberto o mouse para observar a microcirculação in vivo. Este procedimento é modelado após o preparo cremaster "aberto" descrita pela primeira vez no rato ^4. Com a prática todo o procedimento cirúrgico pode ser concluída em menos de uma hora. A versatilidade desta preparação permite uma variedade de manipulações experimentais e é facilmente adaptada para hamsters, bem como ratos, permitindo uma variedade de modelos experimentais para ser estudado de maneira similar. A preparação é limitada a animais machos e as medições devem ser feitas para o centro do tecido, evitando regiões danificadas perto das bordas do músculo ^14. Também deve-se reconhecer que, enquanto as distribuições de pressão e fluxo são alteradas quando os vasos comunicantes do músculo cremaster são cortadas ^16, microvasos permanecer ágil e adequado para a coleta de dados reproduzíveis. A principal limitação para visualizar a microcirculação do músculo cremaster é o acúmulo de tecido conjuntivo como animais maduros e aumentam de tamanho, principalmente em ratos, mas também em hamsters. Além disso, como os animais engordam, torna-se mais difícil de controlar porque a anestesia pentobarbital é lipofílica e pode ser absorvido no tecido adiposo. A melhor maneira de proceder é de ser paciente, garantindo que a temperatura o ° s animais corporal é mantido em ~ 37 ° C, enquanto tecido exposto é irrigado continuamente com PSS.

Todos os procedimentos e protocolos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use da Universidade de Missouri e realizada de acordo com o Guia de Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
Produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela Stanford Photonics.

Pesquisa no laboratório dos autores é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede R37-HL041026, R01-R01-HL086483 e HL056786 (SSS) e F32-HL097463 e T32-AR048523 (PB) do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos.