Cremaster עכבר הכנה שריר עבור הדמיה של Intravital microcirculation

הכנת רקמות מתואר עבור להדמיה של מניפולציה ניסויית בזרימת הדם החי. בעכברים מורדמים זכר, רזה, שרירי מאוד vascularized cremaster מוכן מיקרוסקופיה intravital ללמוד רשתות כלי הדם כולל arterioles, נימים venules. הכנה זו היא מותאמת בקלות לחולדות ואוגרים.

בכל הגוף, שמירה על הומאוסטזיס מחייב אספקה ​​קבועה של חמצן וחומרים מזינים במקביל עם ההסרה של תוצרי חילוף החומרים. איזון זו מושגת על ידי תנועת הדם דרך microcirculation, אשר כוללת את הענפים הקטנים ביותר של אספקת הדם בכל רקמות ואיברים. סניף Arterioles מן העורקים כדי ליצור רשתות לשלוט בהפצה ובהיקף של דם מחומצן זורם לתוך ריבוי נימים קשר אינטימי עם תאים parenchymal. הנימים מספקים שטח פנים גדול לחילופי diffusional בין רקמות ותאי את אספקת הדם. Venules לאיסוף שפכים נימי להתכנס כפי שהם לחזור deoxygenated הדם לכיוון הלב. כדי לבחון את התהליכים האלה בזמן אמת דורש גישה ניסויית המאפשר הדמיה מניפולציה של microcirculation חיים.

השרירים של חולדות cremaster שימש לראשונה כמודל לחקר דלקת באמצעות היסטולוגיה ^1,2 ו במיקרוסקופ אלקטרונים פוסט מורטם. הראשון בדו"ח vivo של השריר חשוף עכברוש שלם cremaster נחקר כלי הדם התגובות לתרופות vasoactive לידי ביטוי באמצעות האור ^3. עם זאת העקמומיות של השריר וחוסר תאורה ממוקדת מוגבל את השימושיות של הכנה זו. פריצת דרך הכרוכות בפתיחת שרירים, לנתק אותו מן האשך ומפיצים אותו רדיאלית כמו סדין שטוח שקוף תחת מיקרוסקופ מתחם ^4. בעוד העולם להיות הכנה חשוב ללמוד את הפיזיולוגיה של בזרימת הדם אצל חולדות ⁵ ו - ⁶ אוגרים, השריר cremaster בעכברים ⁷ הוכיחה שימושית במיוחד בניתוח מסלולי הסלולר המעורבים בוויסות תפקוד כלי הדם ^8-11 בזמן אמת הדמיה של אינטר איתות ^12.

השריר cremaster נגזר השרירים הפנימיים abdominus עקיפה רוחבי כמו האשכים יורדים דרך התעלה מפשעתי ^13. הוא משמש לתמיכה (ביוונית: cremaster ביריות =) ולשמור על טמפרטורת האשכים. כפי שתואר כאן, שריר cremaster מוכן כמו סדין דק שטוח עבור רזולוציה אופטית יוצאת מן הכלל. עם העכבר נשמר בטמפרטורת גוף יציב מטוס של הרדמה, הכנת הניתוח כרוך לשחרר את השריר מן הרקמה שמסביב ועל האשכים, להפיץ אותו על בסיס שקוף של גומי silastic ואבטחת הקצוות עם סיכות חרקים תוך להשקיית זה ללא הרף עם תמיסת מלח פיזיולוגית . הפרוטוקול הנוכחי מנצל העכברים הטרנסגניים GCaMP2 לבטא בתאי האנדותל arteriolar. GCaMP2 סידן הוא מקודד גנטית פלורסנט אינדיקטור ¹² המולקולה. Widefield הדמיה התעצמה תשלום מצמידים את המצלמה במכשיר לאפשר במחקר vivo של איתות סידן האנדותל arteriolar.

1. עכבר הלוח, הדום שרירים, טריז הגוף פתרון superfusion

1. עכבר הלוח: לוח פרספקס שקוף מלבני (6 "רחב X 8" X ארוך 3 / 16 "עבה) עשוי להתאים בשלב של המיקרוסקופ." הלוח העכבר "הוא שם את העכבר הרדים מאובטח במהלך הכנת כירורגית של השריר cremaster.
2. הדום שרירים: הדום שקוף גומי silastic מוכן מ 184 Sylgard, אשר מעורבת בהתאם להוראות ° S היצרן. עובש נוח הוא 15 x 50 מ"מ עובי מ"מ קוטר קוטר צלחת פטרי הפנויה. הבלוק Sylgard נחתך לצורה הרצויה בסכין גילוח (ראה תרשים 1C).. שכבה דקה של דבק סיליקון אטום ברור משמש כדי לאבטח את גוש Sylgard לעלות על העכבר. עצות שימושיות: לאחר מזיגת Sylgard לתוך צלחת פטרי, degassing בתא ואקום שעה מסיר בועות אוויר ומשפר את בהירות. בעקבות degassing, ריפוי הזמן Sylgard מקוצר על ידי הנחת צלחת בתנור מעבדה ב 50 ° C למשך מספר שעות.
3. טריז גוף חימום פלטפורמה: טריז (2 "x 4" x 15 °) ממוקם מתחת העכבר נגד הכן מטה את גופו קדימה המאפשרת הארכת שרירים cremaster על הכן ממקור שלה. שילוב פלטפורמת אלומיניום על משטח מספק מוליך חום. הפלטפורמה מחומם על ידי נגדים מחוברים לספק מתח DC (איור 1A). כיול הטמפרטורה פלטפורמה ~ 40 ° C שומר על טמפרטורת הושט ב ~ 37 ° C. אחרת, חום קורן מן המנורה משמש.
4. סיכות. כדי להבטיח את השריר cremaster על הכן, סיכות מוכנים מ 0.15 מ"מ סיכות חרקים שהיו כפופות לתוך צורה "L".
5. פתרון מלח פיזיולוגיים (PSS). ההכנות superfused (שלחין) ברציפות עם ביקרבונט שנאגרו PSS שהוכנו ultrapure (18.2 MΩ) H ₂ O. פתרונות במלאי מוכנים בריכוז 20X עבודה סופית לעקר דרך פילטר 0.2 מיקרומטר. פתרונות במלאי נותרו טוב במשך כמה שבועות, כאשר מאוחסנים 4 ° C. הכנת מלחים בנפרד ביקרבונט ו לערבב אותם עם דילול ביום הניסוי מונעת משקעים של סידן ביקרבונט. הפתרון מלח המניות מורכב (ב mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 _4, 23.4 CaCl _2. ביקרבונט המניות הוא 360 NaHCO _3. ביום של ניסוי, פתרונות בהתאמה מובאים נפח סופי (בדרך כלל 2 L לניסוי נתון) בבקבוק volumetric והניח באמבט מים ~ 37 ° C. Equilibrating PSS עם 5% CO ₂ / 95% N ₂ עבור ~ 15 דקות באמצעות disperser גז מתאים את ה-pH ל ~ 7.4 ומונעת משקעים. PSS הוא מבעבע ברציפות עם 5% CO ₂ / 95% N ₂ במהלך הניסויים. ההרכב הסופי פתרון עבודה (ב mmol / L) הוא: 132 NaCl, KCl 4.7, 1.2 MgS0 _4, 2 CaCl _2, 18 NaHCO _3.

2. הרדמה לקראת ניתוח

1. בעקבות אישור טיפוח בעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש, עכברים זכרים לפחות 12 שבועות משמשים. העכבר הוא הרדים עם נתרן pentobarbital (60 מ"ג / ק"ג) באמצעות הזרקה (IP) intraperitoneal. צינור הרחקה מוכיח שימושי להבטחת עכבר במהלך הזריקה הראשונית. במהלך ניתוחים ופרוטוקולים ניסיוני, הרדמה מתוחזק על ידי תוספי מזון (10-20% של הזרקת הראשוני, ip) לפי הצורך (כל 30-60 דקות, שמסומן על ידי תגובת נסיגה הבוהן או קמצוץ הזנב). טיפ: דילול pentobarbital 10 מ"ג / מ"ל ​​סליין סטרילי לפני ההזרקה מקטין את האפשרות של מנת יתר.
2. הרדמה פשרות לוויסות טמפרטורת כך את העכבר חייב להישמר חם מיד לאחר הזריקה הראשונה. הצבת העכבר במנשא מתכת (סל אלומיניום מאוורר) על גבי צלחת חימום (מכויל ~ 37 ° C) עובד היטב. לחלופין, מנורה חום ניתן להשתמש בטיפול כדי למקם אותו במרחק מתאים מן העכבר. העכבר צריך להיות במעקב כל 5-10 דקות, עד רמה מתאימה של הרדמה מושגת (חוסר נסיגה הבוהן או קמצוץ הזנב). המנה הנוספת עשויה להידרש לאחר 15-20 דקות. עדיף להיות סבלניים להתקדם בזהירות, כדי למנוע מינון יתר, במיוחד עם בעלי חיים או מהשמנת יתר בגיל.
3. השיער יוסר הבטן התחתונה, הגב התחתון, שק האשכים ואת הרגליים בקפידה על ידי גילוח לאזורים בהתאמה. תשומת לב מיוחדת יש לנקוט כדי למנוע טראומה שק האשכים ואת האשכים, אשר אחרת לפגוע בשרירים cremaster. הסרת שיער פזור עם ספוגית אלכוהול טריים.
4. אם השלפוחית ​​מלאה זה ירגיש כמו ענבים קטן דרך דופן הבטן. לרוקן את שלפוחית ​​השתן באמצעות לחץ עדין על מנת למנוע את העכבר של משתין על הכנת cremaster במהלך הניסויים. Kimwipe הוא ספוג האפקט הקולקטיביתt השתן.
5. מקם את העכבר על גבו, שוכב על טריז עם הרגליים בפישוק על הדום. תפר משי (4-0 או 5-0) קשור כל רגל מספקת לקשור להבטחת עכבר עם המפשעה שלה נגד הכן. חתיכת סרט להציב ברפיון על החזה מאובטח טריז שומר על תנוחת הגוף הכולל. הניתוחים מבוצעים תוך צפייה דרך stereomicroscope באמצעות מספריים microdissection ו מלקחיים זווית.

3. הכנה כירורגי של השריר cremaster פתוח

1. פינים ממוקם דרך הקודקוד של שק האשכים (או את הצד השמאלי או מימין) מאובטחת הכן למקום מתח על העור. Superfusion עם PSS (34-35 ° C) הוא יזם מעל השדה כירורגית ומתוחזק לאורך לנתיחה כדי לשמור על רקמת חשוף חמה ולחה. הפתיל (עשוי Kimwipe) ממוצבת עם קצה אחד ליד שק האשכים לבין הבא אחרים לקו ואקום מסיר את PSS בשפכים. טיפת דבק איטום סיליקון ללוח הפרספקס לחלוטין המקיפה את טריז ו הדום משמש "החפיר" לאסוף כל PSS שאינו aspirated, משמש אמצעי זהירות יעיל כדי למנוע דליפה PSS על המיקרוסקופ.
2. מבצעים חתך לאורך המשטח הגחון של שק האשכים. אם האשך כבר חזר בו על ידי השריר cremaster לתוך חלל הבטן, לחץ עדין על הבטן התחתונה מכוון את האשך לתוך שק. פני השטח של שריר cremaster שמעל האשך יש לזהות בשלב זה. רקמת החיבור בין העור לבין השריר האשכים cremaster מוסרת בזהירות כדי לשחרר את השרירים cremaster מן הרקמה הסובבת.
3. עור האשכים הוא חזר בו בעדינות מאחורי קצה פרוקסימלי של הכן ומאובטח בכל צד עם סיכה. פני השטח החיצוני של המשטח שריר cremaster מנוקה אז של רקמת חיבור. Superfusion רציף במהלך הידרט לנתיחה רקמת החיבור, בהנחיית ניראות ההסרה.
4. סיכה דרך הקודקוד של השריר cremaster משמש מקום אותו תחת מתח האורך. חתך אורכי נעשית באמצעות משטח הגחון של שריר בזהירות רבה לקחת כדי למזער הפרעה באספקת הדם. זרימת הדם דינמיקה ליד בפריפריה של הכנת משתנים על ידי זה ¹⁴ נזק לרקמות. לכן, כדי למזער את אלה משפיע על איסוף הנתונים, כלי דם בסמוך למרכז הכנת משמשים הדמיה מחקרים פיזיולוגיים.
5. השריר cremaster מחובר באמצעות רצועה דקה כדי יותרת האשך מתחת האשך. המשקף את האשך לצד אחד חושפת רצועה זו, אשר מופרדים בקפידה יותרת האשך. קרוב לשיא של השריר cremaster הוא עורק וריד קטן שבו לחבר אותו יותרת האשך. Occluding אלה כלי בין מלקחיים ופושק אותם ממזער הדימום. האשכים, יותרת האשך, האשכים עורק וריד הם ligated proximally (4-0 או 5-0 תפר משי), ניתק וזנוח (orchiectomy) יחד עם כרית השומן הקשורים מפשעתי. לחלופין, האשך יכול להיות דחף בעדינות בחזרה לתוך חלל הבטן ולהחזיק עם פיסת צמר גפן או Kimwipe. Orchiectomy משמש כדי למנוע טראומה ניתן הרקמה כאשר דוחפים את האשכים חזרה לתוך חלל הבטן. לא מצאנו הבדלים בולטים באיכות הכנת microcirculation cremaster (ראה סעיף 3.8) או באמצעות הליך ^7,15.
6. המשטח החיצוני של השריר cremaster מנוקה של רקמת חיבור הנותרים ולאחר מכן להפיץ רדיאלית על פני השטח של הכן. הקצוות מובטחות עם סיכות (ראה סעיף 1.4) ב 5-6 מקומות כדי ליצור גיליון שטוח של שריר מפוספס microcirculation ללא פגע.
7. הכנה השלימה מועבר בשלב של מיקרוסקופ intravital, superfused ברציפות (3-5 מ"ל / דקה, 34 ° C) equilibrated במשך 30 דקות.
8. Integrity של הכנת cremaster מוערך על פי מספר קריטריונים. הטון ספונטנית וזומוטורים עם טראומה כירורגית מינימלית מסומן על ידי זרימה מהירה של arterioles וחוסר leukocytes חסיד ב venules. המדד הרגיש ביותר של הכנה תגובה היא התכווצות של arterioles להעלאת פתרון superfusion תוכן חמצן למשך 5-10 דקות. הדבר נעשה על ידי equilibrating אותו עם 21% O ₂ (לעומת 5% O _2, ראה סעיף 1.5; כל עם 5% CO _2, איזון N _2). נוכחות של לויקוציטים ב arterioles, העדר של כדוריות דם אדומות זורם דרך הנימים, ו / או leukocytes צבירת venules ו לרקמות סימנים של נזק לרקמות ודלקת.

4. הדמיה של Intravital microcirculation השריר cremaster

1. Intravital הדמיה מבוצע על מיקרוסקופ מותאם אישית המבוסס על פלטפורמה MVX10 אולימפוס זום סטריאו. MVX10 מיקרוסקופ הגוףהוא רכוב על היברידית MVX10 עמדה מצויד שקוף (מנורת הלוגן) הדמיה (קוהלר) brightfield עם עלית תאורה (מנורת כספית) עבור דימות פלואורסצנטי. שימוש עלית תאורה, GCaMP2 הוא מתרגש בכל ננומטר 472/30 עם פליטת שנאספו ננומטר 520/35. תמונות נרכשים באמצעות PLAPO MV 2XC העדשה (הצמצם המספרי = 0.50; אולימפוס) באמצעות XR/Mega-10 התעצמה מצלמה דיגיטלית (סטנפורד Photonics, Inc, SPI) דרך פייפר בקרת תוכנה (SPI) במחשב האישי. עם מערכת זו, בתחום הנצפה של תצוגה (FOV) יכולים להיות מגוונים מ 553 מיקרומטר X 442 מיקרומטר עד 22 מ"מ X 18 מ"מ.
2. עם השלמת הניסויים הדמיה intravital, העכבר הוא הרדים מורדמים עם מנת יתר של pentobarbital ואחריו נקע בצוואר הרחם.

5. נציג תוצאות

1. איור עכבר הלוח הדמיה intravital הכנה העכבר cremaster. א) טריז גוף עם פלטפורמת אלומיניום (מבודד עם פלסטיק צהוב) צפו מלמטה. נגדים חימום מאובטח התחתון של הפלטפורמה לספק חום שנערך. ב) חימום נשענת על פלטפורמת טריז מפלסטיק. ג) טריז הגוף מונח על לוח פרספקס לניתוח ולהעביר לאחר השלב של המיקרוסקופ intravital. הדום Sylgard מסומן בחץ אדום. טיפת סיליקון אטום המקיפה את כל ההכנות כדי להכיל כל פתרון עלול לדלוף במהלך ההליך intravital, ומונע ממנו מטפטף על המיקרוסקופ.

2. איור MacroZoom אישית מיקרוסקופ עבור widefield הדמיה. א) MVX10 הגוף מיקרוסקופ (אולימפוס) עם מצלמה ICCD XR/Mega-10 (סטנפורד Photonics) רכוב על יציאת trinocular. ב) תקריב נוף של הגוף מיקרוסקופ. (א) זום הביקורת (0.63 ל 6.3X), (ב) גלגל מסנן: (ג) תמונה מכפיל (NA = 0.50 עם הגדלה אופטי 25X). ג) Substage הקבל עבור תאורה (קוהלר) brightfield (Condenser NA = 0.55, מרחק עבודה = 27 מ"מ).

איור 3. הושלם הכנה עכבר cremaster. עכבר הרדים בעמדה פרקדן על משטח פלסטיק מצופה אלומיניום חמים (צהוב). תנוחת הגוף מאובטח באמצעות קלטת. השריר cremaster מתפשטת רדיאלית על כן גומי שקוף silastic והצמיד בקצוות. פתרון Superfusion הוא הציג בסוף הפרוקסימלי דרך dripper פלסטיק (חץ לבן). קו ריק (לבן ראש חץ) מסיר את הפתרון באמצעות פתילה Kimwipe. שני micropipettes מוצגים ממוצבת עם טיפים שלהם ברקמות. אלקטרודה הפניה (חוט הכסף) מאובטח בקצה התחתון של השריר cremaster.

איור 4. הממחישות את טווח הגדלה המאפשר הדמיה רשתות arteriolar להביע GCaMP2 ב האנדותל. א) פלורסנט ו-B) התמונה נלקחה ב brightfield הגדלה אופטי של 3.2X עבור ההגדלה בסך הכל = 42X על צג וידאו. [שדה הראייה (FOV) = 4,375 x 3,470 מיקרומטר]. בר סולם = 500 מיקרומטר. עבודה בהגדלה זה מאפשר השמה של micropipettes במקומות הרצויים. ג) פלורסנט ו-D) התמונה נלקחה ב brightfield הגדלה אופטי של 6.4X עבור ההגדלה הכולל = 83X (FOV = 2200 x 1759 מיקרומטר). בר סולם = 200 מיקרומטר. E) פלורסנט ו-F) התמונה נלקחה ב brightfield הגדלה אופטי של 12.6X עבור ההגדלה הכולל = 165X (FOV = 1100 x 885 מיקרומטר). בר סולם = 100 מיקרומטר. G) עם מכפיל תמונה, הגדלה אופטי = 25.2X. בר סולם = 50 מיקרומטר.

כאן אנו מתארים את הכנת שריר לפתוח cremaster בעכבר על התבוננות microcirculation in vivo. הליך זה הוא המודל לאחר הכנת "פתוח" cremaster שתוארה לראשונה בשנת החולדה ^4. בעזרת תרגול ההליך הכירורגי כולו יכול להסתיים בתוך פחות משעה 1. הרבגוניות של הכנה זו מאפשרת מגוון רחב של מניפולציות ניסיוניים מותאם בקלות אוגרים כמו גם חולדות, המאפשר מגוון רחב של דגמים ניסיוניים להיחקר באופן דומה. הכנה מוגבל חיות זכר מדידות צריך להיעשות לכיוון מרכז הרקמה, הימנעות האזורים שנפגעו ליד הקצוות של שריר ^14. ראוי גם הכיר בכך, בעוד הפצות הלחץ ואת זרימת משתנים כאשר כלי מקשרות של שריר cremaster נחתכים ^16, microvessels להישאר קשוב מתאים איסוף הנתונים לשחזור. המגבלה העיקרית לדמיין את בזרימת הדם בשריר cremaster היא הצטברות של רקמת חיבור כחיות בוגרת להגדיל את שטחו, בעיקר חולדות, אלא גם אוגרים. יתר על כן, כמו בעלי חיים להשמין, הוא הופך להיות קשה יותר לשלוט הרדמה כי pentobarbital הוא lipophilic והוא יכול להיקלט ורקמת השומן. הדרך הטובה ביותר להתקדם היא על ידי כך המטופל תוך הקפדה כי טמפרטורת הגוף ° S חיה נשמר ~ 37 ° C תוך הרקמה הנחשפת הינו מושקים ברציפות עם PSS.

נהלים ופרוטוקולים מעורבים כל בעלי החיים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש מאוניברסיטת מיזורי והופיעה בקנה אחד עם מדריך National Institutes of Health לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
הפקה של המאמר וידאו זה כבר ממומנים על ידי סטנפורד Photonics.

מחקר במעבדה של המחברים הוא נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקים R37-HL041026, R01-R01 HL086483 ו-HL056786 (SSS) ועל ידי F32-HL097463 ו-T32 AR048523 (PB) משירות ארצות הברית לבריאות הציבור.