El ratón Cremaster preparación muscular for Imaging intravital de la microcirculación

A la preparación del tejido se describe para la visualización y la manipulación experimental de la microcirculación de vida. En los ratones macho anestesiado, el delgado y muy vascularizado músculo cremáster se prepararon para microscopía intravital para estudiar las redes microvasculares como las arteriolas, capilares y vénulas. Esta preparación se adapta fácilmente a las ratas y hámsters.

En todo el cuerpo, el mantenimiento de la homeostasis requiere el suministro constante de oxígeno y nutrientes concomitante con la eliminación de los subproductos metabólicos. Este equilibrio se consigue por el movimiento de la sangre a través de la microcirculación, que abarca las ramas más pequeñas de la vascularización en todos los tejidos y órganos. Las arteriolas de las arterias para formar redes que controlan la distribución y magnitud de la sangre oxigenada que fluye en la multitud de capilares íntimamente asociado con las células del parénquima. Capilares proporcionan una gran superficie para el intercambio de difusión entre las células del tejido y el suministro de sangre. Vénulas capilares recogen los efluentes y convergen a medida que regresan la sangre desoxigenada hacia el corazón. Para observar estos procesos en tiempo real requiere un enfoque experimental para la visualización y la manipulación de la microcirculación de vida.

El músculo cremáster de ratas fue utilizado por primera vez como un modelo para el estudio de la inflamación mediante histología y microscopía electrónica de ^1,2 post mortem. La primera en el informe in vivo de la exposición del músculo cremáster de ratas intactas investigado las respuestas a los fármacos vasoactivos microvascular con la luz reflejada ^3. Sin embargo, la curvatura del músculo y la falta de iluminación enfocada limita la utilidad de esta preparación. El gran avance supuso la apertura de los músculos, separándolo del testículo y la difusión radial que como una hoja plana de la transiluminación con un microscopio compuesto ^4. Mientras demostrado ser una valiosa preparación para estudiar la fisiología de la microcirculación en ratas y hámsters, ^{5 6,} el músculo cremáster en ratones ⁷ ha demostrado ser particularmente útil en la disección de los mecanismos celulares implicados en la regulación de la función microvascular ^8-11 y en tiempo real imágenes de intercelular señalización ^12.

El músculo cremáster se deriva de los músculos abdominales oblicuo interno y transverso ya que los testículos descienden a través del canal inguinal ^13. Que sirve de apoyo (en griego: cremáster suspender =) y mantener la temperatura de los testículos. Como se describe aquí, el músculo cremáster se prepara como una fina hoja plana para la resolución óptica excepcional. Con el ratón mantiene a una temperatura corporal estable y el plano de la anestesia, preparación quirúrgica consiste en liberar el músculo del tejido circundante y los testículos, extendiéndola en pedestal transparente de goma de silastic y asegurar los bordes con alfileres de insectos, mientras que el riego continuo con solución salina fisiológica . El presente protocolo utiliza ratones transgénicos que expresan GCaMP2 en arteriolar las células endoteliales. GCaMP2 es genéticamente codificados indicador fluorescente de calcio ¹² molécula. Campo amplio de imágenes y una intensificación de carga acoplada cámara del dispositivo permite el estudio in vivo de la señalización del calcio en el endotelio arteriolar.

1. Ratón bordo, pedestal del músculo, la cuña del cuerpo y la solución de superfusión

1. Ratón bordo: A bordo de plexiglás transparente rectangular (6 "de ancho x 8" de largo x 3.16 "de espesor) se hace para caber en el escenario del microscopio." Tablero del ratón "es donde el ratón anestesiado se asegura durante la preparación quirúrgica de el músculo cremáster.
2. Pedestal del músculo: Un pedestal transparente de goma silastic se prepara a partir Sylgard 184, que se mezcla de acuerdo a las instrucciones del s · Fabricante. Un molde es una práctica de 15 mm de espesor x 50 mm de diámetro de plato de Petri desechables de diámetro. El bloque Sylgard se corta a la forma deseada con una cuchilla de afeitar (ver Figura 1C).. Una fina capa de silicona adhesiva transparente a prueba de agua se utiliza para fijar el bloque Sylgard a la junta del ratón. Consejos útiles: Después de verter el Sylgard en la placa de Petri, de desgasificación en una cámara de vacío durante una hora, elimina las burbujas de aire y mejora la claridad. Después de la desgasificación, el tiempo de curado de Sylgard se acorta mediante la colocación de la cápsula en un horno de laboratorio a 50 ° C durante varias horas.
3. Cuña del cuerpo y la plataforma de calefacción: una cuña (2 "x 4" x 15 °) situado debajo del ratón y contra el pedestal se inclina el cuerpo hacia adelante que facilita la ampliación del músculo cremáster sobre el pedestal de su origen. La incorporación de una plataforma de aluminio sobre la superficie proporciona calor por conducción. La plataforma es calentado por resistencias conectadas a una fuente de alimentación DC (Figura 1). Calibración de la temperatura de la plataforma a 40 ° C mantiene la temperatura del esófago a ~ 37 ° C. De lo contrario, el calor radiante de una lámpara se utiliza.
4. Pins. Para asegurar el músculo cremáster en el pedestal, pines están preparados a partir de 0,15 mm alfileres de insectos que se han doblado en forma de "L" forma.
5. Solución salina fisiológica (PSS). Los preparativos están superfused (riego) de forma continua con bicarbonato de búfer PSS preparado en agua ultrapura (18,2 MW) H ₂ O. Las soluciones madre se preparan en 20 veces la concentración final de trabajo y se esteriliza a través de un filtro de 0,2 micras. Disponibilidad de soluciones siguen siendo buenas durante varias semanas cuando se almacenan a 4 ° C. La preparación de sales por separado el bicarbonato y mezclar con la dilución en el día del experimento evita la precipitación de bicarbonato de calcio. La solución de sal para el ganado se compone de (en mmol / L): 2638 NaCl, KCl 94, 40 MgS0 _4, el 23,4 _CaCl2. El bicarbonato de valores es de 360 _NaHCO3. En el día de un experimento, las soluciones respectivas son llevados a un volumen final (normalmente 2 L para un experimento dado) en un matraz aforado y se coloca en un baño de agua a ~ 37 ° C. Equilibrar la PSS con un 5% de CO ₂ / 95% N ₂ de ~ 15 minutos con un dispersor de gas se ajusta el pH a 7.4 ~ y evita la precipitación. El PSS se burbujea continuamente con CO2 al _5% / 95% de N _{2 a} través de experimentos. La composición final de solución de trabajo (en mmol / L) es: 132 NaCl, 4,7 KCl, 1,2 MgS0 _4, 2 _CaCl2, 18 _de NaHCO3.

2. Anestesia y preparación para la cirugía

1. Tras la aprobación del Cuidado de Animales institucional y el empleo, los ratones machos de al menos 12 semanas de edad se utilizan. El ratón es anestesiados con pentobarbital sódico (60 mg / kg) vía intraperitoneal (ip). Un tubo de restricción sea de utilidad para asegurar el ratón durante la inyección inicial. A lo largo de los procedimientos quirúrgicos y protocolos experimentales, la anestesia se mantiene con los suplementos (10-20% de la inyección inicial, ip), según sea necesario (cada 30-60 minutos, se indica por la respuesta de la retirada a los pies o pellizcar la cola). Consejo: La dilución de la pentobarbital 10 mg / ml en solución salina estéril antes de la inyección reduce la posibilidad de sobredosis.
2. Anestesia compromisos regulación de la temperatura por lo que el ratón debe ser mantenido caliente inmediatamente después de la primera inyección. Situar el ratón en una jaula de metal (cesta ventilada de aluminio) en la parte superior de una placa calefactora (calibrado a ~ 37 ° C) funciona bien. Por otra parte, una lámpara de calor se puede utilizar con cuidado de que la posición a una distancia apropiada del ratón. El ratón debe ser tomada cada 5-10 minutos hasta que el nivel adecuado de anestesia se consigue (la falta de retiro a los pies o pellizcar la cola). Una dosis suplementaria puede ser necesaria después de 15-20 minutos. Lo mejor es ser paciente y proceder con cautela para evitar una sobredosis, especialmente en los animales obesos o de edad avanzada.
3. El pelo se elimina de la parte inferior del abdomen, la espalda baja, el escroto y las piernas cuidadosamente afeitado respectivas regiones. Se debe prestar especial cuidado para evitar un traumatismo en el escroto y los testículos, que de otra forma dañar el músculo cremáster. Quitar el pelo suelto con un hisopo con alcohol.
4. Si la vejiga está llena, se siente como una uva pequeña a través de la pared abdominal. Vaciar la vejiga con una presión suave para evitar que el ratón de orinar en la preparación cremáster durante los experimentos. A Kimwipe es una esponja de la validez de colecciónt la orina.
5. Coloque el ratón sobre la espalda, acostado en la cuña con sus piernas a horcajadas del pedestal. Una sutura de seda (4-0 o 5-0) empató a cada pie tiene una correa de sujeción para asegurar el ratón con su entrepierna contra el pedestal. Un pedazo de cinta adhesiva colocada libremente en el pecho y aseguró que la cuña mantiene la posición del cuerpo en general. Los procedimientos quirúrgicos se realizan mientras se visualiza a través de un microscopio estereoscópico con tijeras y pinzas en ángulo microdisección.

3. Preparación quirúrgica del músculo cremáster abierto

1. Un pin se coloca a través del ápice de la bolsa escrotal (ya sea la izquierda o la derecha) y se asegura en el pedestal para colocar la tensión en la piel. Superfusión con PSS (34-35 ° C) se inicia en el campo quirúrgico y se mantiene durante la disección de mantener el tejido expuesto cálido y húmedo. Una mecha (a partir de Kimwipe) colocados con un extremo junto a la bolsa escrotal y el otro junto a una línea de vacío elimina el PSS de efluentes. Una capa de sellador de silicona adherida a la placa de plexiglás y completa que rodea la cuña y el pedestal sirve como "foso" para recoger el PSS que no se aspira, que actúa como una eficaz medida de precaución para evitar fugas de PSS en el microscopio.
2. Se hace una incisión a lo largo de la superficie ventral del saco escrotal. Si el testículo se ha retraído por el músculo cremáster en la cavidad abdominal, una ligera presión en el abdomen inferior dirige el testículo en el saco. La superficie del músculo cremáster que recubre los testículos se deben identificar en este momento. Tejido conjuntivo entre la piel del escroto y el músculo cremáster se retira cuidadosamente para liberar el músculo cremáster del tejido circundante.
3. La piel del escroto está ligeramente retraído por detrás del borde proximal del pedestal y se asegura a cada lado con un alfiler. La superficie exterior de la superficie del músculo cremáster se borra del tejido conectivo. Superfusión continua durante los hidratos de disección del tejido conectivo, lo que facilita la visibilidad y la eliminación.
4. Un alfiler en el vértice del músculo cremáster se utiliza para ponerlo bajo tensión longitudinal. Se hace una incisión longitudinal a través de la superficie ventral del músculo con gran cuidado para reducir al mínimo la interrupción del suministro vascular. La dinámica del flujo de sangre cerca de la periferia de la preparación se ven alterados por este daño en los tejidos ^14. Por lo tanto, para minimizar estos efectos en la recopilación de datos, los vasos sanguíneos cerca del centro de la preparación se utilizan para la imagen y los estudios fisiológicos.
5. El músculo cremáster está conectado por un ligamento delgada en el epidídimo por debajo de los testículos. Como reflejo de los testículos a un lado expone este ligamento, que se separa cuidadosamente del epidídimo. Cerca de la punta del músculo cremáster es pequeña arteria y la vena que se conecta al epidídimo. Oclusión de los vasos entre las pinzas y tirando de ellos, aparte minimiza el sangrado. El testículo, el epidídimo, la arteria y la vena testicular se ligan proximal (4-0 o 5-0 sutura de seda), cortado y desechado (orquiectomía), junto con la almohadilla de grasa inguinal asociada. Por otra parte, el testículo puede volver a colocarse suavemente en la cavidad abdominal y retenido con un trozo de algodón o Kimwipe. La orquiectomía sirve para evitar el posible trauma a los tejidos cuando se empuja los testículos en la cavidad abdominal. No hemos encontrado diferencias notables en la calidad de la preparación de la microcirculación cremáster (ver sección 3.8) mediante el procedimiento ^7,15.
6. La superficie externa del músculo cremáster, se elimina el tejido conectivo restantes y luego se extendió radialmente sobre la superficie del pedestal. Los bordes están aseguradas con clavijas (ver sección 1.4) en 5-6 lugares para crear una hoja plana de músculo estriado con microcirculación intacta.
7. La preparación completa se transfiere a la etapa de un microscopio intravital, superfused continua (3-5 ml / min, 34 ° C) y se equilibra durante 30 minutos.
8. La integridad de la preparación cremáster se evalúa de acuerdo a varios criterios. Espontánea tono vasomotor con un mínimo trauma quirúrgico está indicado por el flujo rápido en las arteriolas y la falta de leucocitos adheridos en las vénulas. El índice más sensible de una preparación de respuesta es la constricción de las arteriolas a elevar la solución de superfusión contenido de oxígeno durante 5-10 minutos. Esto se hace equilibrar con un 21% de O ₂ (frente al 5% O _2, véase la sección 1.5, todos con 5% de CO _2, el balance de N _2). La presencia de leucocitos en las arteriolas, la ausencia de las células rojas de la sangre que fluye a través de los capilares, y / o leucocitos se acumulan en las vénulas y los tejidos circundantes son signos de daño en los tejidos y la inflamación.

4. Intravital imagen de la microcirculación del músculo cremáster

1. Intravital de imágenes se realiza en un microscopio personalizado basado en una plataforma de Olympus MVX10 Zoom Estéreo. El microscopio MVX10 cuerpose monta en un híbrido MVX10 stand equipado con transiluminación (lámpara halógena) para campo claro (Köhler) de imágenes y con epi-iluminación (lámparas de mercurio) para imágenes de fluorescencia. Epi-iluminación, GCaMP2 se complace en nm 472/30 con la emisión recogidos en nm 520/35. Las imágenes se adquieren a través de una MV PLAPO 2xc objetivo (apertura numérica = 0,50; Olympus) con una intensificación de XR/Mega-10 cámara digital (Stanford Photonics, Inc., SPI) a través de Piper Control de Software (SPI) en un ordenador personal. Con este sistema, el campo observado de visión (FOV) puede variar de 553 m X 442 micras a 22 mm X 18 mm.
2. Al término de los experimentos de imagen intravital, el ratón anestesiado es la eutanasia con sobredosis de pentobarbital seguido por dislocación cervical.

5. Resultados representante

Figura 1. Ratón bordo de imagen intravital de la preparación del ratón cremáster. A) Cuerpo de cuña con plataforma de aluminio (aislados con plástico de color amarillo) se ve desde la parte inferior. Resistencias calentadoras asegurado a la parte inferior de la plataforma de proporcionar calor a cabo. B) La plataforma de calefacción se basa en una cuña de plástico. C) La cuña cuerpo es colocado en un tablero de acrílico para la cirugía y posterior traslado a la platina del microscopio intravital. Pedestal Sylgard se indica con la flecha roja. Un cordón de silicona resistente al agua rodea toda la preparación que contenga cualquier solución que pueden tener fugas durante el procedimiento intravital, evitando que caigan gotas en el microscopio.

Figura 2. Personalizado microscopio de campo amplio MacroZoom imágenes. A) MVX10 cuerpo del microscopio (Olympus) con XR/Mega-10 cámara ICCD (Stanford Photonics) montado en el puerto trinocular. B) Vista cercana del cuerpo del microscopio. (A) control de zoom (0,63 a 6.3x), (b) la rueda de filtros, (c) la imagen doblador (NA = 0,50 con un aumento óptico de 25X). C) Subetapa condensador de campo claro (Köhler) iluminación (Condensador NA = 0,55, distancia de trabajo = 27 mm).

Figura 3. Completado ratón preparación cremáster. Ratón anestesiado en posición supina en la plataforma de calentamiento de aluminio recubierto de plástico (amarillo). La posición del cuerpo está asegurada con cinta adhesiva. El músculo cremáster se propaga radialmente en el pedestal de goma silastic transparente y articulada en los bordes. Solución de superfusión se introduce en el extremo proximal a través de un gotero de plástico (flecha blanca). Una línea de vacío (blanco punta de flecha) elimina la solución a través de una mecha Kimwipe. Dos micropipetas se muestran posicionado con sus consejos en el tejido. Un electrodo de referencia (hilo de plata) se fija en el borde inferior del músculo cremáster.

Figura 4. Ilustrar el rango de aumentos para la visualización de redes arteriolar expresar GCaMP2 en el endotelio. A) Imagen campo claro fluorescentes y B) tomadas en un aumento óptico de 3.2x para una ampliación total = 42X en el monitor de vídeo. [Campo de visión (FOV) = 4,375 x 3,470 m]. Barra de escala = 500 micras. Trabajar en este aumento facilita la colocación de micropipetas a los lugares deseados. C) fluorescentes y D) la imagen tomada en campo claro aumento óptico de 6.4X de magnificación total = 83x (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Barra de escala = 200 micras. E) fluorescentes y F) de imágenes tomadas en campo claro aumento óptico de 12.6X para un aumento total = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Barra de escala = 100 micras. G) Con doblador de la imagen, magnificación óptica = 25.2X. Barra de escala = 50 micras.

A continuación se describe la preparación abierta cremáster muscular en el ratón para observar la microcirculación in vivo. Este procedimiento sigue el modelo de la preparación "abierto" cremáster describió por primera vez en la rata ^4. Con la práctica del procedimiento quirúrgico se puede completar en menos de una hora. La versatilidad de esta preparación permite una variedad de manipulaciones experimentales y se adapta fácilmente a los hámsters y ratas, lo que permite una gran variedad de modelos experimentales para estudiar de manera similar. La preparación se limita a los machos y las mediciones deben realizarse hacia el centro del tejido, evitando las regiones dañadas cerca de los bordes del músculo ^14. También hay que reconocer que, mientras que las distribuciones de presión y el flujo se altera cuando los vasos de interconexión del músculo cremáster se cortan ^{16 de} microvasos mostrándose receptiva y adecuada para la recogida de datos reproducibles. La principal limitación a la visualización de la microcirculación en el músculo cremáster es la acumulación de tejido conectivo como animales maduros y aumentan de tamaño, especialmente en las ratas, sino también en los hámsteres. Además, como animales de engorda, se vuelve más difícil de controlar debido a la anestesia con pentobarbital es lipofílico y puede ser absorbido en el tejido adiposo. La mejor manera de proceder es ser paciente al tiempo que garantiza que la temperatura del · s de los animales del cuerpo se mantiene a ~ 37 ° C mientras que el tejido expuesto se riega continuamente con PSS.

Todos los procedimientos y protocolos con animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Missouri y realizado de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
La producción de este video-artículo ha sido patrocinado por Stanford Fotónica.

Investigación en el laboratorio de los autores con el apoyo de los Institutos Nacionales de Salud subvenciones R37-HL041026, R01 y R01-HL086483 HL056786 (SSS) y F32-HL097463 y T32 AR048523 (PB) del Servicio de Salud Pública de Estados Unidos.