Efektör-Kompleksleri kullanarak BMP4 Mansabında Sinyal Algılama In situ PLA, Proximity ligasyon Testi

Burada kemik morfogenetik protein (BMP) sabit hücreler sinyal görselleştirmek için antikor kombinasyonu ile yakınlık ligasyon Assay (PLA), nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu teknik bize BMP4 uyarımı altında efektör-kompleksleri aktif endojen BMP nükleer birikimi takip etmek ve zaman içinde bunların seviyelerini ölçmek için izin verdi.

BMP, gelişimsel ve biyolojik etkileri geniş bir yelpazede sorumludur. BMP reseptörleri (phosphorylate) Smad4 ile karmaşık bir form ve BMP özel mansap etkileri ¹ başlatmak için transkripsiyon faktörleri olarak işlev çekirdeğine yerini değiştirmek Smad1/5/8 etkileyiciler etkinleştirin. Geleneksel fosfor-smad peptidler karşı antikorlar ile immüno-floresans teknikleri, düşük duyarlılık, yüksek arka plan gösterirler ve bu floresan ışığa ise özellikle antikor sinyal yoğunluğu güveniyor brüt kantifikasyon sunuyoruz. Buna ek olarak, fosfor-Smads Smad4 karmaşık ve aktif transkripsiyon yapan.

In situ PLA yüksek özgüllük ve duyarlılık ^2-4 ile protein etkileşimleri tespit edebilen bir teknoloji. Bu yeni teknoloji, proteinin DNA vekil amplifikasyon çiftler antikor tanıma. Bu tanıma olayı tam konumunu açığa noktalar bir form lokalize, ayrık bir sinyal üretir. Sinyallerin sayısı ve bir ölçüm sağlayan mukayese edilebilir. Biz, bu sadece sinyalizasyon ile ortaya çıkan karmaşık bir yakınlık, yani sadece BMP sinyal etkileyiciler phospho-Smad1/5/8 ve Smad4 algılanmasını sağlar antikor bir kombinasyonu ile Duolink kiti kullanılarak, yerinde PLA uygulanan aktivasyonu. Bu ilk kez BMP4 uyarımı altında bir süre ders deneyde yüksek özgüllük ve duyarlılık ile sinyalizasyon endojen BMP görüntüleme ve ölçüm izin verdi.

1. Hücre Kaplama ve BMP ile tedavi

1. GMEM Kültür Neuro2a hücrelerin% 10 FBS ile desteklenmiş, 1x Sigara Esansiyel amino asitler (NEAM), 1x sodyum piruvat ve L-glutamin 1x. 16-kuyu oda slayt tripsin (% 0.05-EDTA) ve de her plaka 15,000-20,000 hücreleri kullanarak hücrelerin Böl.
   
   DMEM Kültür HEK293T veya Cos7 hücrelerin% 10 FBS, 1x L-glutamin ve 1x Penisilin / Streptomisin ile desteklenmiştir. % 70 etanol onları çeker ve 1 cm ² kuyu çizmek Immedge kalem kullanarak polysine slaytlar sterilize edin. 50 inoküle tripsin (% 0.05-EDTA) ve de her plaka 20,000-25,000 hücreleri kullanarak hücrelerin Böl.
2. 37 ° hücreleri inkübe ° C _{nemlendirilmiş,%} 5 CO2 inkübatör.
3. 24 saat sonra saat Neuro2a serum serbest GMEM (albümin% 0.1, 1x NEAM, 1x sodyum piruvat ve L-glutamin 1x ile desteklenmiş) ile veya HEK293T serum serbest DMEM (L-Glutamine ve 1x Penisilin / Streptomisin ile desteklenmiş) ile orta yerine / Cos7 ve hücreleri 2-3 saat süreyle inkübe Hücreleri kontrol grubu olarak kullanmak için, normal culturing koşullar altında (yani% 10 FBS) ile üç kuyu tutun.
4. Istenilen zaman için dorsomorphin (BMP yolun, 2 mcM inhibitörü) veya BMP4 (25 ng / ml) hücreleri (örneğin 10 dakika-1 saat) ⁵ davranın.

2. Fiksasyon ve Permeabilization

1. Sabitleştirici,% 4 PFA hazırlayın. 100 ml PBS içinde% 4 çözelti hazırlamak için 4 g PFA tartılır. Çözüm Sıcak 50 ° C 'ye kadar açıktır. Kullanana kadar 4 0.22 mikron filtre ve mağaza ° C ile çözüm Filtresi. Taze fiksatif (en fazla 2 gün boyunca saklanan) kullanın.
2. Aspire kuyulardan orta ve 1xPBS bol suyla yıkayın. Bu hücrelerin ayrılması sonucu olarak hücreler üzerine doğrudan çözümler pipetle etmeyin. Odasının slaytlar kullanılması halinde, bir sonraki adıma geçmeden önce, odaları kaldırmak, ancak kuyuları etrafında silikon bırakın.
3. Ajitasyon olmadan, RT, 10 dakika süreyle 50 ul% 4 PFA ve inkübe ekle.
4. RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 3 x 5 dakika hücreler PBS ile yıkayın.
5. PBS içinde% 0,5 'lik Triton X-100 RT ajitasyon olmadan 10 dakika ile hücreleri davranın.
6. TBS içinde% 0.05 Tween 20 (TBS-T) ile hücrelerin RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 3 x 5 dakika yıkayınız.

3. Engelleme

1. TBS-T dokunun. De ortalama Duolink II Engelleme Çözüm (1x) bir damla ekleyin.
2. 37 1 saat önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe

4. Primer Antikorlar

1. Mix ve 1:100 aP-Smad1/5/8 (tavşan poliklonal) sulandırmak ve Duolink II Antikor Dilüent (1x) 1:100 bir Smad4 (fare monoklonal). Kontrolleri için kullanılmak üzere aynı konsantrasyonlarda da aP-Smad1/5/8 hazırlayın ve bir Smad4 yalnız.
2. Slaytları Engelleme Çözüm dokunun. Mümkün olduğunca engelleme çözüm çıkarın, ancak hücrelerin antikor eklemeden önce kuruması için ekstra özen. Kuyular için antikor çözümleri 40 ul ekleyin. Birinde sadece ek bir negatif kontrol olarak Antikor Diluent ekleyin.

5. PLA probları

1. Antikor Seyreltici iki PLA sondalar (Duolink II anti-Mouse EKSİ ve Duolink II anti-Tavşan PLUS) 01:05 sulandırınız.
2. Slaytlar birincil antikor çözüm dokunun. 1x Duolink II Yıkama Tamponu her slaytları 2 kez 5 dakika yıkayın RT ajitasyon ile Coplin kavanoza.
3. A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve PLA prob çözümü eklemek (40 ul / iyi).
   37 1 saat önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe

6. Ligasyonu

1. Vortex Duolink II ligasyon stoku (5x) ve yüksek saflıkta su eklenir ve karıştırılır 01:05 sulandırmak. Su hacmi hesaplarken sadece kuyulardan karışımı ilave önce 01:40 son bir seyreltme eklenecektir ligaz hacmi dikkate alır.
2. Slaytlar PLA prob çözüm dokunun. 1x Yıkama Tamponu slaytlar RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoz 2 kez için her biri 5 dakika yıkayınız.
3. Ligaz donma blok kullanarak derin dondurucuda (-20 ° C) dışarı atın. Ligaz 1:40 seyreltme ve vorteks ligasyon solüsyonu (6.1 hazırlanan) ekleyin.
4. A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve ligasyon ligaz çözüm ekleyin her iyi (40 ul / iyi). 37 az 30 dakika önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe

7. Amplifikasyon

Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun.

1. Yüksek saflıkta su eklenir ve karıştırılır Duolink II Amplifikasyon stok (5x) 01:05 sulandırınız. Su hacmi dikkate 1:80 inci karışımı yanı sıra daha önce nihai bir seyreltme eklenecektir Polimeraz hacmi hesaplanırkene kuyular.
2. Slaytları ligasyon ligaz çözüm dokunun. 1x Yıkama Tamponu slaytlar RT ajitasyon ile bir Coplin kavanoza 2 kez her biri 2 dakika yıkayın.
3. Bir dondurma blok kullanarak derin dondurucuda (-20 ° C) Polimeraz çıkarın. Polimeraz 1:80 seyreltme ve vorteks Amplifikasyon solüsyonu (7.1 'de hazırlanan) ekleyin.
4. A slaytlar Yıkama Tamponu dokunun ve Amplifikasyon Polimeraz çözüm ekleyin her iyi (40 ul / iyi). 37 100 dk önceden ısıtılmış nem kabini ° C slaytlar inkübe

8. Görüntüleme için hazırlanması

Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun.

1. Slaytları Amplifikasyon Polimeraz çözüm dokunun ve RT ajitasyon 1x Duolink II Yıkama Tamponu B ile bir Coplin kavanoza her 2 kez 10dk yıkayın.
2. 0,1 x Yıkama Tamponu B. slaytlar Dip
3. 16-iyi slayt tamamen silikon çıkarın. Lamel DAPI ile Orta Montaj Duolink II ~ 40μl ekleyin ve hafifçe bastırarak biraz bu yüzden kapak kayma altında hiç hava kabarcığı kalmamasına dikkat örnekleri üzerine yerleştirin. Düzeltme ve tırnak cilası kullanarak slayt lamel mühür. Görüntülemeye devam etmeden önce en az 15 dakika bekleyin.
4. Konfokal veya floresan mikroskobu ile numunelerin analiz edin. Dijital görüntü elde edin.

9 - Niceleme

Not: Açık duyarlı reaktifler. Işıktan koruyarak slaytları tutun.

1. Duolink ImageTool sinyal seviyesi ölçümü, görüntü sinyalleri saymak için kullanın.
2. Ölçümlerini karşılaştırın ve bir grafik yapmak.

10 Temsilcisi Sonuçlar

Bir yerinde PLA deney sonucu olarak ayrık floresan noktalar gösterir. Sinyal konumu çalışılan spesifik proteinlerin bağlıdır.

Şekil 1 in situ PLA BMP4 stimülasyon sonrasında Neuro2a hücreleri üzerinde. Hücreler 2 mcM dorsomorphin (BMP yolun inhibitörü) (A) veya 25 ng / ml BMP4 ile tedavi edilen (B) için tedavi edilmeyen 60 dakika veya sol (CE). P-Smad1/5/8 ve Smad4 karşı antikorlar, A ve B tek başına aP-Smad1/5/8 (C) primer antikor ve Smad4 tek başına (D) veya primer ihmal aktif kompleksleri tespit etmek için kullanılan antikorlar (E), kontrol grubu olarak kullanılmıştır. Mavi: DAPI Kırmızı: PLA sinyal. Resimler Leica SP5 konfokal mikroskop ile elde edildi.

(F) PLA sinyalleri Duolink ImageTool yazılımı ile sayıldı ve hücre başına çekirdeğinde noktalar ortalama sayısı grafikte sunulmuştur. (G) Neuro2a hücrelerinin tedavi edilmezse veya Dorsomorphin (2 mcM) ya da 60 dakika için BMP4 (25 ng / ml) ile tedavi edildi. Hücreler parçalanmış ve proteinleri SDS-PAGE ve yükleme gibi kontrolü aP-Smad1/5/8 ve a-PCNA immün analiz edildi. (*) Non-spesifik bir grup. AP-Smad1/5/8 antikor 3 farklı proteinler arasındaki farkı ayırt edemezsiniz Not Smad4 karmaşık mevcut.

In situ protein kompleksleri görselleştirme özellikle protein etkileşimleri ve protein modifikasyonu hücrelerin kendi yüzeyinden çekirdeğine bir sinyal göndermek için kullandıkları araçlardır sinyalizasyon çalışmaları için büyük bir talep. Önce immünofloresan in situ iki endojen proteinler arasındaki kompleksleri görselleştirmek ve ölçmek için mümkün olmamıştır. Co-antikor lokalizasyonu düşük çözünürlükte sergileyen ve gerçek etkileşim görselleştirmek için kullanılamaz. PLA araştırmacılar büyük bir başarı ^{6, 7} farklı sistemler kullanarak başladı yeni bir tekniktir. Burada, zamanla alt-BMP stimülasyon aktif smad etkileyiciler arasında endojen kompleksleri görselleştirmek için değil, aynı zamanda ölçmek için yalnızca PLA nasıl kullanılacağını göstermektedir. Biz Neuro2a ve (Şekil 1) elde etmek için farklı türler (fare bir Smad4 ve tavşan aP-Smad1/5/8) yükseltilmiş ticari antikorlar dayanıyordu de dahil olmak üzere farklı doku kültürü hücreleri kullanıldı. Bu yöntem tüm Smad4 ile aktif kompleksleri yapan olmayabilir fosforile Smad1/5/8 sadece varlığı değil, zaman içinde BMP efektör komplekslerinin aktivasyon ve ilk kez, bize izin verdi. Biz sinyalleri (Şekil 1F) sayılır ve aynı hücreler ⁸ (şekil 1G), immunoblotting elde miktarının ölçüm karşılaştırıldı. Biz noktaların sayısı zamanla seviyesini sinyal doğru bir karşılaştırmalı ölçme sağladığı sonucuna vardı. Tekniği de benzer sonuçlar veren diğer hücre hatları (HEK293T ve Cos7) (veriler gösterilmemiştir) uygulandı.

Teknoloji ilkesi Duolink kiti ile sağlanan iki eşsiz probları dayanmaktadır. Her PLA prob, bir muhabir gibi davranan eşsiz bir sentetik oligonükleotid, bağlı ikincil bir antikor oluşur. Probların yakınlık tam yerde bu problar yakınlık bağlı olan DNA ligasyonu sağlar. DNA hibridizasyon ve ligasyon küçük (<40 nm) ve bu nedenle sağlar oligonükleotidler, mesafe, etkileşim, yalnızca proteinlerin ligasyonu izin verebilirsiniz. Bağlandı DNA amplifiye ve güçlendirilmiş dizisi etiketli oligonükleotidler hibridizasyon ile tespit edilebilir. Amplifikasyonu DNA-DNA hibridizasyon prensipleri bağlı olarak özel ve bağlandı DNA ilk ligasyonu olay geliştirme birkaç kat amplifiye olarak da yüksek hassasiyet sağlar. Çoğaltılan DNA etiketli oligonükleotidler hibridizasyon tarafından algılanır ve görünür ve oldukça geniş bir nokta üretir. Gibi noktalar sayılabilir, PLA tam uzamsal bilgiyi (etkileşim olayların yerini) ^2-4 bu olayların nicel değil, aynı zamanda objektif bir şekilde sadece sinyal sağlar.

Protein etkileşimlerinin tespiti için istihdam edilen diğer teknikler co-immunoprecipitation, immunofluoresence ve Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) sayılabilir. Protein komplekslerinin izolasyon sağlayan Co-immunoprecipitation testlerin yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem proteinleri tespit etmek için nispeten yüksek düzeyde ifade edilmesi gerektiği anlamına gelir immün eşlik ediyor. Yüksek arka plan veya boncuk bazı proteinlerin non-spesifik bağlanma Sorunları ortak immunoprecipitation aşmak için bazen zor. Buna ek olarak, ortak-immunoprecipitation deneyleri proteinlerin bir protein kompleksinin bir parçası olabilir algılama izin verir ancak birbirleri ile fiziksel olarak etkileşim çok yakın olduğunu ayırt edemez. Ayrıca, tek bir hücre, hücre içinde protein kompleksleri lokalizasyonu çözünürlük veya bilgi co-immunoprecipitations kantitatif sağlamak değildir. Immunofluoresence bir hücre veya bir hücre bölmesi protein kompleksleri, eş-varlık tespiti, bu nedenle üst üste yayılmış sinyalleri dayalı ve düşük uzaysal çözünürlüğe sahiptir ve protein etkileşimleri hakkında doğru bilgi sağlayamaz. Birkaç kat fark olduğunu ve sadece doğru veya PLA lekeler olarak ölçülebilir olamaz immunofluoresence sinyali sayısal görsel tahmini yapılabilir. FRET canlı hücrelerde protein kompleksleri görselleştirme sağlar ve antikorları için, epitopunun ihtiyaç ve pozlama üstesinden gelir. Ancak, genellikle FRET PLA gibi endojen protein kompleksleri yansıtmıyor olabilir yapay erimiş proteinler, aşırı ekspresyonu bağlıdır.

PLA protokolü Engelleme koşulları antikor agregasyonu oluşur ve arka plan artırabilir kritik öneme sahiptir. Alternatif engelleme koşulları antikor ürün sayfaları bulunabilir. Primer ve sekonder antikor ihmal Uygun kontroller yanlış gitmiş olabilir bilgi vermek ve her zaman dahil edilmesi gerekir. Bunların bir arada olduğu zaman, bunlar tek başına kullanıldığında en az arka plan ve en iyi sinyal verecek farklı antikorları ekrana önemlidir. Cel, fiksasyonuprosedürün adımları sırasında yetersiz fiksasyon protein kompleksleri kaybına yol açabilir ise aşırı sabitleme, protein kompleksleri tam doğasını ve düşmeye neden olabilir ls kritik öneme sahiptir. Bu% 3 fiksatif konsantrasyonunu düşürerek veya fiksasyonun süresinin kısaltılması, kontrol edilebilir. Ancak, fiksasyon olmadığını primer antikorlar denatüre proteinler ya da farkındayız de bağlıdır. PLA tekniği çok hassas olduğu için, özel bakım kuluçka süreleri ve mikro koşulları farklı örnekleri arasında eşit tutmak için gereklidir.

Örnekleri son adım önce herhangi bir durumda kuru bırakılmamalıdır. Numunelerin kurutulması artan arka yol açabilir. Engelleme çözümünün tümüyle kaldırılmasını da arka plan önlemek için kritik öneme sahiptir. , Düşük sıcaklıkta enzimatik reaksiyonları yavaşlatır yıkama tamponlar her zaman kullanmadan önce oda sıcaklığına getirilmiş olmalıdır. Daha fazla sorun giderme için Kit kılavuzuna başvurun.

PLA sinyali (örneğin DAPI, aktin vb) alt hücresel yerleşimi tespit etmek için boyaların kullanımı için faydalıdır. Burada çekirdeklerin leke DAPI (montaj orta) kullandık. PLA, hücre tipi veya cep bölmesi (burada gösterilmemiştir) belirlemek için antikorlar ile immünofloresan kullanımı ile uyumludur. Doğru kantifikasyon sinyalleri ve özel bir yazılım kullanımı (Duolink Görüntü Aracı, Olink Biosience) sayım yapılabilir.

Son derece hassas, kullanımı kolay, arka plan ve aktif BMP yerinde sinyal ölçmek için eşsiz bir yetenek: Sonuç olarak, BMP sabit hücrelerinde sinyalizasyon ve avantajları sundu algılamak için Duolink kiti kullanılarak, yerinde PLA nasıl kullanılacağını göstermiştir.

Farklı protein etkileşimleri çalışmak için bu tekniği uygulayarak sınırlama soruşturma altında proteinleri tanıyan birincil antikor erişilebilirliği ve kalitesi bağlıdır.

Bu araştırma, MRC ve BBSRC hibe tarafından finanse edilmektedir. Biz teknik ve faydalı öneri kurma yardımcı olmak için, Uppsala Üniversitesi Agata Ulf Landegren Lab Zieba ve Katerina Pardalis teşekkür ederiz. Teknik yardım ve sunum için Olink Biosience.