使用BMP4のエフェクター-錯体のダウンストリームシグナリングの検出その場で PLA、近接ライゲーションアッセイ

ここでは、骨形成タンパク質（BMP）固定された細胞のシグナル伝達を可視化する抗体の組み合わせで近接ライゲーションアッセイ（PLA）を、使用する方法を示します。このテクニックは、私たちは、内因性BMP活性化エフェクター複合体の核内蓄積を追跡し、BMP4刺激下で時間をかけて自分のレベルを定量することができました。

BMPは、発達と生物学的影響の広範な責任があります。 BMPの受容体が活性化（リン酸化）Smad1/5/8エフェクター、その次に、であるSmad4と複合体を形成し、彼らはBMP特定の下流効果^1を開始する転写因子として機能する核内に移行。リン酸化のSmadペプチドに対する抗体を持つ伝統的な免疫蛍光技術は、低感度、高いバックグラウンドを示し、これは蛍光感光性である場合は、特に抗体のシグナルの強度に依存しているとして、総定量化を提供します。さらに、リン酸化されたSmadはすべてであるSmad4との複合体ではない可能性があり、アクティブな転写に従事。

その場で PLAは、高い特異性と感度が^2から4と ​​タンパク質の相互作用を検出することができる技術です。タンパク質のDNAサロゲートの増幅と、この新しい技術のカップルの抗体の認識。それは認識イベントの正確な位置を明らかに斑点の形でローカライズされた、離散信号を生成する。信号の数をカウントし、測定を提供することと比較することができます。我々は、これらのシグナリングでのみ発生する、複雑で近接すなわち、内にあるときのみBMPシグナル伝達のエフェクターphospho-Smad1/5/8とSmad4の検出を可能にする抗体の組み合わせで、Duolinkキットを使用して、 その場 PLA の適用活性化。これは、BMP4刺激下のタイムコース実験で高い特異性と感度を持つ内因性BMPシグナル伝達の可視化と計測、初めて許可。

1。細胞のプレーティングとBMPによる治療

1. GMEMの文化Neuro2a細胞は10％FBSを添加した、1 ×非必須アミノ酸（NEAM）、1Xピルビン酸ナトリウムとL -グルタミン1X。トリプシン（0.05％- EDTA）とプレート16ウェルチャンバースライドにウェル当たり15.000から20.000までの細胞を用いて細胞を分割する。
   
   文化HEK293Tまたは10％FBS、1X L -グルタミンおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMでCOS7細胞。 70％エタノールでそれらを浸漬し、1cm ^2の井戸を描くImmedgeのペンを使用してpolysineスライドを滅菌する。 50μlの培地でトリプシン（0.05％- EDTA）とプレートウェルあたり20.000から25.000の細胞を用いて細胞を分割する。
2. 37細胞をインキュベートします加湿、5％CO ₂インキュベーターでC。
3. 24時間後には、Neuro2aのための無血清GMEM（アルブミン0.1％、1 × NEAM、1Xピルビン酸ナトリウムおよび1x L -グルタミンを添加した）、またはHEK293Tための無血清DMEM（L -グルタミンおよび1xペニシリン/ストレプトマイシンを補充）で培地を交換してください/ COS7と2〜3時間細胞をインキュベートコントロールとして使用するために、通常の培養条件下で細胞（すなわち、10％FBS）で3つのウエルに保管してください。
4. 希望の時間のためのdorsomorphin（BMP経路の阻害剤、2μM）またはBMP4（25 ng / ml）を持つセル（10分1時間など^）5を扱います。

2。固定と透過処理

1. 固定、4％PFAを準備します。 100ミリリットルPBS中4％溶液を調製するPFAの4gを秤量する。 50で解決策を温める·それがクリアされているCまで。使用するまで4℃で0.22μmフィルターとストア° Cを介してソリューションをフィルタリングします。 （2日以上保管されていない）新鮮な固定剤を使用してください。
2. 井戸から培地を吸引除去し、1xPBSで洗浄する。これは、細胞の剥離に繋がる可能性があるので、細胞に直接ソリューションをピペッティングしないでください。チャンバースライドが使用されている場合、次のステップに進む前に、チャンバーを取り外しますが、井戸の周囲にシリコンを残す。
3. 攪拌することなく、室温で、10分間50μlを4％PFAとインキュベートする。
4. 室温で攪拌しながらコプリンジャーに3 × 5分間PBSで細胞を洗浄する。
5. 0,5％トリトンPBSでX - 100を10分間室温で攪拌することなく細胞を扱う。
6. 室温で攪拌しながらコプリンジャーに3 × 5分間TBSに0.05％のTween 20（TBS - T）で細胞を洗浄する。

3。ブロッキング

1. TBS - Tをオフにタップします。ウェルあたりDuolink IIブロッキング溶液（1X）の一滴を追加。
2. 37℃で1時間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に

4。一次抗体

1. 1:100でaP-Smad1/5/8（ウサギポリクローナル）およびDuolink IIの抗体希釈液で1:100（1 ×）で、であるSmad4を（マウスモノクローナル）混和し希釈する。コントロールに使用される同じ濃度でもaP-Smad1/5/8と単独で、であるSmad4を準備します。
2. スライドからのブロッキング溶液をオフにタップします。できる限り多くのブロッキング溶液を除去しますが、抗体を加える前に細胞が乾燥させないよう細心の注意を払って。ウェルに抗体溶液40μlを添加する。つでも追加のネガティブコントロールとしてのみ抗体希釈液を加える。

5。 PLAプローブ

1. 抗体希釈液で2つのPLAプローブ（Duolink II抗マウスMINUSとDuolink II抗ウサギPLUS）1:5に希釈する。
2. スライドからの一次抗体溶液をオフにタップします。 5分× 1 Duolink IIでそれぞれ室温で攪拌しながらコプリンジャーに洗浄バッファーをスライドを2回洗浄する。
3. スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、PLAプローブ溶液（40μl/ウェル）を追加します。
   37℃で1時間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に

6。ライゲーション

1. 渦Duolink IIのライゲーションの株式（5倍）と高純度の水と混合で1:5に希釈する。水の体積を計算する場合、考慮にちょうど井戸のミックスの添加前1:40の最終希釈で追加されるリガーゼのボリュームを取る。
2. スライドからのPLAのプローブ溶液をオフにタップします。 1 ×洗浄バッファーでスライドを室温で攪拌しながらコプリンジャーに2回、5分ごとに洗浄する。
3. 凍結ブロック（-20℃）を使用してフリーザーからリガーゼを取り出してください。 1時40分希釈と渦におけるライゲーション溶液（6.1で調製）にリガーゼを追加。
4. スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、各ウェルにライゲーション-リガーゼの溶液（40μl/ウェル）を追加します。 37℃で30分間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に

7。増幅

注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。

1. 高純度の水とミックスでDuolink II増幅株式（5x）を1:5に希釈する。水の体積を計算するとき考慮にちょうど目にミックスの添加前1:80の最終希釈で追加されるポリメラーゼの量を取る電子井戸。
2. スライドからライゲーション-リガーゼのソリューションをオフにタップします。室温で攪拌しながらコプリンジャーに2回2分間ずつで1 ×洗浄バッファーでスライドを洗浄します。
3. 凍結ブロック（-20℃）を使用してフリーザーからポリメラーゼを取り出してください。 1:80希釈し、ボルテックスで増幅液（7.1で調製）にポリメラーゼを追加。
4. スライドから洗浄バッファーをオフにタップして、各ウェルに増幅 - ポリメラーゼの溶液（40μl/ウェル）を追加します。 37℃で100分間予備加熱湿度チャンバ内のスライドをインキュベート℃に

8。イメージングのための準備

注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。

1. スライドから増幅 - ポリメラーゼのソリューションをオフ]をタップし、室温で攪拌しながらコプリンジャーに1X Duolink IIウォッシュバッファーBでそれぞれ2回10分間洗浄する。
2. 0.1 × Wash BufferをBにスライドを浸し
3. 完全に16ウェルスライドからシリコーンを削除します。カバースリップ上DAPIでミディアムを取り付けDuolink IIの〜40μlのを加え、穏やかにわずかにカバースリップの下に気泡がないこと、それを押すとサンプルの上に置きます。マニキュアを使用してスライド上にカバースリップを修正し、シールします。イメージングに進む前に、少なくとも15分間待ちます。
4. 共焦点または蛍光顕微鏡でサンプルを分析する。デジタル画像を取得します。

9。定量化

注：ライトセンシティブ試薬。遮光してスライドしてください。

1. 信号レベルの測定値を得るために画像信号をカウントするDuolink imagetoolを使用してください。
2. 測定値を比較し、グラフを作る。

10。代表的な結果

その場 PLAの実験での結果は離散蛍光スポットとして表示されます。信号の場所は調査特定のタンパク質に依存します。

図1 その場 PLA において BMP4刺激後のNeuro2a細胞で。細胞は60分または（CE）放置しておくために2μMdorsomorphin（BMP経路の阻害剤）（）または25 ng / mlのBMP4（B）で処理した。 P-Smad1/5/8とであるSmad4に対する抗体は、AとBの一次抗体単独でaP-Smad1/5/8（C）と - であるSmad4アローン（D）または一次の不作為に積極的に複合体を検出するために使用された抗体（E）をコントロールとして使用した。青：DAPI、赤：PLA信号。写真は、ライカSP5共焦点顕微鏡で得られた。

（F）PLA信号がDuolink imagetoolでソフトウェアを用いて計数し、細胞あたりの核のスポットの平均数をグラフで表示されます。 （G）Neuro2a細胞は未処理のままかDorsomorphin（2μM）または60分間BMP4（25 ng / ml）を処理した。細胞を溶解し、タンパク質をSDS - PAGEに供し、コントロールを読み込むとaP-Smad1/5/8と、PCNAを用いたイムノブロッティングにより分析した。 （*）非特異的バンド。 aP-Smad1/5/8抗体であるSmad4と複合体中に存在3種類のタンパク質を区別できないことに注意してください。

その場でのタンパク質複合体の可視化は、特に蛋白質の相互作用とタンパク質修飾は、細胞がその表面から核へシグナルを送るために使用することを意味している場所シグナリングにおける研究のために、大きな需要があります。それは前に免疫蛍光を用いたin situ の 2つの内在性タンパク質との間の複合体を可視化し定量化することは不可能であった。抗体の共局在は、低解像度を示し、真の相互作用を可視化するために使用することはできません。 PLAは、研究者は大成功^6、7と異なるシステムでの使用を開始した新しい技術です。ここでは、PLAを使用するだけでなく、視覚化するだけでなく、時間をかけてBMPの刺激の下流で活性化Smadであるエフェクターの間に内在性の複合体を定量化する方法を示します。我々は、Neuro2aとこの（図1）を達成するために別の種（マウスA -であるSmad4とウサギaP-Smad1/5/8）で提起された商業抗体に依存していたなどの異なる組織培養細胞を使用していました。このメソッドは、すべてであるSmad4とのアクティブな複合体に従事されていない可能性がありますリン酸化Smad1/5/8の単なる存在ではなく、時間をかけてBMPエフェクター複合体の活性化を参照して、初めての、私達を許可。我々は、信号をカウントし（図1F）と同じセル^8（図1G）の免疫から得られる定量化と測定比較した。私たちは、スポットの数は時間をかけて信号レベルの正確な比較測定を提供すると結論した。技術はまた、同様の結果と他の細胞株（HEK293TとCOS7）（データは示さず）に適用されました。

技術の原理は、Duolinkキットで提供されている2つのユニークなプローブに基づいています。各PLAのプローブは、レポーターとして機能するユニークな合成オリゴヌクレオチド、に接続された二次抗体で構成されています。プローブの近接は、これらのプローブが近接して接続されている正確な位置でDNAライゲーションすることができます。 DNAハイブリダイゼーションおよびライゲーションが小さく（<40nmプロセス）、そのためであることができるオリゴヌクレオチド、の距離、相互作用するタンパク質だけがライゲーションを許可することができます。連結したDNAを増幅し、増幅された配列の標識されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって検出することができる。増幅は、DNA - DNAハイブリダイゼーションの原理に依存するように特有のものであり、連結したDNAは、初期のライゲーションのイベントの強化、その結果いくつかの倍に増幅されるとしても高感度を提供します。増幅されたDNAは、標識されたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって検出し、目に見えるとかなり大きなスポットを生成しています。スポットをカウントできるように、PLAの信号だけでなく、正確な空間情報（相互作用のイベントの位置）だけでなく^、2月4日 、これらのイベントを定量化する客観的な方法を提供します。

タンパク質相互作用の検出のために雇用されている他の技術は共免疫沈降法、immunofluoresenceと蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を含める。共免疫沈降アッセイは、広くタンパク質複合体の分離を可能にするために使用されます。方法は、タンパク質が検出されるために比較的高いレベルで発現されなければならないことを意味する免疫ブロッティングを伴っている。高いバックグラウンドやビーズにいくつかのタンパク質の非特異的結合の問題は時々共免疫沈降法で克服することは困難です。さらに、共免疫沈降アッセイは、タンパク質複合体の一部にすることができますが、互いに物理的に相互作用が非常に近接しているものを区別することができないタンパク質の検出を可能にする。さらに、共同免疫沈降法は、細胞内のタンパク質複合体の局在上の単一のセルの解像度や情報の定量を提供することはできません。 immunofluoresenceでセルまたはセルコンパートメント内のタンパク質複合体の共存の検出は、拡散信号とそのための重複に基づいて、低空間分解能を持ち、タンパク質の相互作用について正確​​な情報を提供することはできません。差は数倍であり、かつ正確またはPLAのスポットとして測定することができない場合にのみ、immunofluoresence信号の定量化は、視覚的に推定することによって行うことができます。 FRETは、生きた細胞内のタンパク質複合体の可視化を可能にし、抗体の必要性とエピトープの露出を克服。しかし、FRETは、通常、PLAのような内因性のタンパク質複合体を反映していない可能性があります人工的な融合タンパク質の過剰発現に依存する。

PLAプロトコルのブロッキング状態は、抗体の凝集が発生するとバックグラウンドを増加させる可能性があるので重要です。代替、ブロッキング条件が抗体の製品シートに記載されています。一次および二次抗体の省略と適切なコントロールが間違っているかもしれないものについての情報を提供し、彼らは常に含める必要があります。彼らは一緒にいるとき、それらを単独で使用され、少なくとも背景と最高のシグナルを与える別の抗体をスクリーニングすることが重要です。セルの固定不十分な固定は、手順のステップ中に、タンパク質複合体の損失につながる可能性があります一方、過固定では、タンパク質複合体が完全に変性し、低下させる可能性があるため、lsは重要です。これを3％に固定液の濃度を低下させることによってまたは固定の時間を制限することによって制御することができます。しかし、固定では一次抗体は変性したタンパク質を認識するかどうかによっても異なります。 PLA法は非常に敏感なので、特別な注意はインキュベーション時間と異なるサンプル間で等しいマイクロ条件を維持するために必要です。

サンプルは、最後のステップの前にどのような場合で乾燥させるままにしないでください。サンプルの乾燥は、増加の背景につながることができます。ブロッキング溶液の完全な除去にも背景を回避するために重要です。低温では酵素反応を遅くするように洗浄バッファーは、常に、使用前に室温に戻してください。さらにトラブルシューティングを行うにはキットのマニュアルを参照してください。

それは、PLAの信号（例えばDAPI、アクチンなど）のサブ細胞内局在を確認するために汚れを使用すると便利です。ここでは、核を染色するためにDAPIを（封入剤で）使用している。 PLAは、細胞型または細胞区画（ここでは図示せず）を決定する抗体で免疫蛍光の使用と互換性があります。正確な定量化は、信号と特定のソフトウェア（Duolinkのイメージツール、Olink Biosience）の使用を数えることにより行うことができます。

結論として、我々は固定された細胞でのBMPシグナル伝達を検出するためにDuolinkキットを使用して、 その場 PLA で使用する方法を実証し、その利点提示している：高感度で使いやすい、、無背景、そしてその場でアクティブなBMPのシグナル伝達を定量化するユニークな能力を。

異なるタンパク質間相互作用を研究するためにこの手法を適用の制限は、調査中のタンパク質を認識する一次抗体の可用性と品質に依存します。

この研究は、MRCとBBSRCの助成金によって運営されている。我々は技術と有用な助言を設定すると助けるために、ウルフLandegrenの研究室でウプサラ大学の阿形ZiebaとカテリーナPardalisに感謝。技術的なヘルプとプレゼンテーションのためのBiosienceをOlink。