Method Article
RNA transkript trans etkili RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) çok sayıda aracılığı ile geniş posttranskripsiyonel düzenlemeye tabidir. Burada hassas ve transcriptome geniş bir ölçekte RBPs, RNA bağlayıcı siteleri tanımlamak için genellenememektedir bir yöntem mevcut.
RNA transkript yüzlerce RNA bağlayıcı proteinler (RBPs) ve microRNA içeren, genellikle bağımlı bir hücre tipi ifade ribonükleoprotein kompleksleri (miRNPs) ile etkileşim transkripsiyon sonrası gen düzenlemeye tabi Anlamak için bu RNA bağlayıcı faktörlerin etkileşimi bireysel transkript, in vivo protein-RNA etkileşimleri 1 gerekli olan yüksek çözünürlüklü haritalar yönetmelik nasıl etkiler.
Genetik, biyokimyasal ve hesaplama yaklaşımları bir arada genellikle RNA RBP veya RNA-RNP etkileşimleri belirlemek için uygulanır. Immunopurified RBPs ile ilişkili RNA'lar mikroarray (RIP-Chip) 2 transcriptome bir seviyede hedefler tanımlar, ancak uygulaması, kinetik istikrarlı etkileşimler ve sadece nadir durumlarda 3,4 RBP tanıma elemanı (RRE tanımlamanıza olanak sağlar karakterizasyonu ile sınırlıdır Uzun hedef RNA içinde). Daha doğrudan RBP hedef site bilgileri, in vivo UV crosslinking 5,6 çapraz RNA segment ve cDNA sıralama (CLIP) 10 izolasyonu takip immunoprecipitation 7-9 ile birleştirerek elde edilir . CLIP 11-17 RBPs bir takım hedefleri tanımlamak için kullanılır oldu. Ancak UV 254 nm RNA-protein çapraz bağlanma, düşük verimlilik, CLIP sınırlıdır ve çapraz bağ yerini zor arka planı olmayan-çapraz UV-çapraz hedef RNA segmentlerinde ayrı, sıralı çapraz parçaları içinde kolayca tanımlanabilir. RNA aynı zamanda örnek mevcut parçaları.
Biz, yüksek çözünürlük ve hücresel RBPs ve miRNPs transcriptome çapında bağlayıcı siteleri belirlemek için güçlü bir hücre tabanlı crosslinking yaklaşım geliştirdi ki dönem PAR-Klip (Photoactivatable ribonükleozit-Geliştirilmiş Crosslinking ve Immunoprecipitation) (Şekil 1A anahat yöntemi). Bu yöntem, canlı hücreler tarafından 4-thiouridine (4-SU) ve 6-thioguanosine (6-SG) olarak photoreactive ribonükleozit analogları, doğmakta olan RNA transkript içine eklenmesi dayanmaktadır. 365 nm UV ışık hücreleri tarafından Işınlama etkileşim RBPs photoreactive nükleozid etiketli hücresel RNA'lar verimli crosslinking neden olur. Ilgi RBP Immunoprecipitation çapraz ve coimmunoprecipitated RNA izolasyonu ile takip edilmektedir. Izole RNA, cDNA kütüphanesi dönüştürülür ve derin Solexa teknoloji kullanarak sıralı. CDNA kütüphaneleri PAR-Klip tarafından hazırlanan bir karakteristik özelliği de crosslinking kesin konumunu sıralı cDNA ikamet eden mutasyonların tespit edilebilir olmasıdır. sitidinin geçiş mutasyonlar adenozin guanozin 6-SG sonuçlarını kullanarak ise 4-SU kullanarak, çapraz dizileri timidin,. Çapraz dizileri mutasyonların varlığı mümkün bol hücresel RNA'lar türetilen dizilerinin arka plan onları ayırmak için yapar.
Çeşitli RNA bağlayıcı proteinler bir dizi yöntem Uygulama Hafner ve ark bildirilmiştir. 18
Aşağıdaki protokol HEK293 hücreleri ifade BAYRAK / doksisiklin ile indüksiyon üzerine IGF2BP1 HA-etiketli PAR-Klip prosedürü açıklamaktadır. Biz anti-BAYRAK antikor immunoprecipitation için kullanacaktır.
PAR-Klip immunoprecipitation için etkin bir antikor varsa, herhangi bir hücre hattı ilgi RNA bağlayıcı protein (RBP) etiketsiz endojen saptanabilir düzeyleri, ifade çalışacaktır.
Genişleyen Hücreler
UV-Crosslinking
Hücre parçalama ve RNaseT1 sindirimi
Immunoprecipitation kurtarma ve çapraz hedef RNA parçaları
Manyetik ayırıcı
Manyetik boncuklar kurumasını önlemek için numune hazırlama boyunca bu yönergeleri izleyin.
Manyetik boncuk hazırlanması
Immunoprecipitation (IP), ikinci RNaz T1 sindirim, ve Defosforilasyon
Immunoprecipitated proteinlerin çapraz RNA segmentleri, Radyoaktif
SDS-PAGE jel dilimleri ve çapraz RNA-protein kompleksleri, electroelution
Proteinaz K sindirimi
cDNA kütüphanesi hazırlama ve derin sıralama
Başlangıçta küçük düzenleyici RNA'lar 19 klonlama açıklanan standart bir cDNA kütüphanesi hazırlık protokolü aracılığıyla kurtarılan RNA taşır. Kurtarılan RNA 10.5 ul kullanarak 20 ul ölçekte açıklandığı gibi ilk adım, 3 'adaptörü ligasyonu, gerçekleştirildi. Solexa sıralama adaptörü açıklanan ayarlar kullanın. Iyileşti RNA miktarını bağlı olarak, ekler olmadan 5'-adaptör-3'-adaptör ürünleri, ek PCR bantları gibi cDNA amplifikasyonu sonra tespit edilebilir. Bu gibi durumlarda, beklenen büyüklüğü% 3 NuSieve uzun PCR ürününün tüketim düşük erime noktası agaroz jel, Solexa teknolojisini kullanarak GelElute kiti (Qiagen) ve sırası ile jel parçalarından PCR ürünü Zehir. Bir Solexa sıralama çalıştırmak genellikle sırası 6 ve 10 milyon arasında tanıyor, RNA bağlayıcı proteinlerin bağlanma yerleri bir transcriptome geniş kapsama alanı için yeterli olduğunu okur.
Biyoinformatik analizi
Dikkatli biyoinformatik analiz dizisi dizisi vs çevrilmemiş kodlama ihtiyaçlarına incelenen RBP, RNA tanıma elemanı, RBP tercih edilen bağlayıcı bölgeleri (exonic vs intronik gibi RNA bağlayıcı siteleri, anlamlı anlayışlar elde etmek için yapılması gereken okur dizisi). Okuma sırası genom ve EST veritabanlarının karşı uyumlu hale getirilmesi gerekir. Biz genellikle okuma mappibir uyumsuzluk, ekleme veya silme sırası kümeleri oluşturmak için benzersiz genom ng daha sonra analiz edilebilir okur. Kümelenmiş sıralı frekans karakteristik mutasyonlar, C geçişler 6-SG kullanırken bir geçişler 4-SU ve G kullanırken, T okur başarıyla çapraz dizilerinin göstergesidir. Bizim tecrübelerimize göre bir arka plan mutasyon oranı yaklaşık% 20 4-SU ile etiketlenmiş uncrosslinked RNA'lar göstermektedir. Bu oran yaklaşık artar. Crosslinking üzerine% 50-80.
Biyoinformatik analizi ayrıntılı bir açıklama Hafner ve arkadaşları tarafından yayın Ek malzeme bulundu. 18
İsteğe bağlı adımlar
Toplam RNA içine 4-thiouridine dahil düzeylerinin belirlenmesi
100 mcM hasattan önce 4SU 16 saat ile desteklenmiş ortamda büyüyen sonra stabil bir şekilde ilgi RBP ifade hücre hattı toplam RNA izole edin. Kontrol olarak, hasat hücreler 4SU ilave edilmeden büyüdü. Ayrıca üreticinin talimatlarına izleyerek yıkanmış hücre granül Trizol reaktifi (Sigma) 3 cilt toplam RNA izole edin. Ayrıca üreticinin protokole göre Qiagen RNeasy kullanarak toplam RNA arındırmak oldu. 4SU, RNA izolasyonu ve analizi sırasında oksitlenmeyi önlemek için, yıkama tamponları ve enzimatik adımdan sonraki 0.1 mM dithiothreitol (DTT) ekleyin. Digest ve HPLC analizi için tek nükleosidlerin A'ya defosforilize toplam RNA 20 önce nitelendirdi. Kısaca, 30 ul hacmi, 37, 16 saat, toplam RNA saflaştırılmış 40 mikrogram idi inkübe ° C 0.4 U bakteriyel alkalin fosfataz (Biyokimyasal Worthington) ve 0.09 U yılan zehiri fosfodiesteraz (Worthington Biyokimyasal). Bir referans standart olarak, 4SU etiketli sentetik RNA (standart CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) ve enzimatik sindirimi tamamlamak için maruz kullanın. Bir Supelco Discovery C18 (gümrüklü faz silika 5 mcM parçacık, 250 x 4.6 mm) ters faz kolon (Bellefonte PA, USA) HPLC ile ribonucleosides çıkan karışımları ayırın. HPLC tamponlar% 3 asetonitril (A) ve% 90 su asetonitril (B) 0,1 M TEAA. 15 dakika, 20 dakika 0 -% 10 B, 30 dakika 10 ila% 100 B: 0% B izokratik degrade kullanın. Arasında uygulanan yıkama HPLC kolon temizlemek için çalışan bir 5 dakika% 100 B uygulayın.
Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 (sağ panel) hücre hatları BAYRAK / 4-SU ve 6-SG ile IGF2BP1 HA etiketli ifade ile yapılan bir PAR-Klip temsili bir sonuç göstermektedir. IGF2BP1 6-SG crosslinking verimliliği 4-SU crosslinking verimliliği daha düşük olduğunu unutmayın. Düşük crosslinking verimliliği daha yüksek bir arka planda bol hücresel RNA parçaları elde dizilerinin neden olacaktır ve bu nedenle daha az verimli photoreactive nükleosidlerin kullanırken deneme ölçeklendirme düşünmelisiniz.
Şekil 1 sol panelindeki potansiyel geleneksel UV 254 nm crosslinking göre PAR-Klip için kullanılan olabilir farklı photoreactive üridin analogları kullanarak bir karşılaştırma gösterir.
Doğru uzunlukta radyoaktif bant yoğunluğu PAR-Klip deney küçük bir RNA sıralama protokolü (küçük cDNA kütüphanesi hazırlamak için adım adım açıklaması ile çalıştı ve taşımak için yeterli RNA izole olup olmadığını iyi bir fikir verir RNA'lar sıralama) 19 bulunabilir. 6-SG kullanarak bir geçişler 4-SU ve G ile C geçişler için sıralı okuma, T karakteristik mutasyonlar, frekans, başarılı bir şekilde çapraz dizilerinin göstergesidir. Bizim tecrübelerimize göre bir arka plan mutasyon oranı yaklaşık% 20 4-SU ile etiketlenmiş uncrosslinked RNA'lar göstermektedir. Bu oran yaklaşık artar. Crosslinking üzerine% 50-80.
Biz yararlı tartışmalar için Tuschl laboratuvar üyeleri teşekkür ederiz. MH Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, İsviçre Ulusal Fonu Hibe MZ # 3100A0-114.001 tarafından desteklenen; TT bir HHMI araştırmacı, ve onun laboratuvarda çalışma NIH hibe GM073047 ve MH08442 ve Starr Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Tamponlar ve reaktifler
Büyüme orta HEK293 hücreleri
4-thiouridine stok solüsyonu (1 M)
Doksisiklin stok (10 mg / ml)
1x NP40 lizis tamponu
DTT ve proteaz inhibitörleri olmadan 5x tampon stok hazırlayın. DTT ve proteaz inhibitörü doğrudan deneyden önce ekleyin.
Sitrat-Fosfat tampon
IP-yıkama tamponu
Yüksek tuz yıkama tamponu
Defosforilasyon tampon
Fosfataz yıkama tamponu
DTT olmadan polinükleotid kinaz (PNK) tampon
PNK tampon
SDS PAGE yükleme tamponu
2x Proteinaz K tampon
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır