PAR-Clip - Ein Verfahren zur Transkriptom-weiten die Bindungsstellen des RNA-bindende Proteine ​​Identifizieren

RNA-Transkripte sind Gegenstand intensiver posttranskriptioneller Regelung, die durch eine Vielzahl von trans-agierenden RNA-bindende Proteine ​​(RBPs) vermittelt wird. Hier präsentieren wir Ihnen eine verallgemeinerbare Methode zur Identifizierung und präzise auf Transkriptom-weiten Skala der RNA-Bindungsstellen von RBPs.

RNA-Transkripte sind post-transkriptionellen Genregulation durch die Interaktion mit Hunderten von RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und microRNA-haltigen Ribonukleoproteinkomplexe (miRNPs), die oft in einem Zelltyp abhängig exprimiert werden. Unterzogen Um zu verstehen, wie das Zusammenspiel dieser RNA-bindenden Faktoren beeinflusst die Regulierung einzelner Transkripte, hochauflösende Karten von in vivo Protein-RNA-Wechselwirkungen sind notwendig ^1.

Eine Kombination von genetischen, biochemischen und computergestützte Ansätze sind in der Regel angewendet, um RNA-RBP-oder RNA-RNP-Interaktionen zu identifizieren. Microarray-Profiling von RNAs mit immunopurified RBPs assoziiert (RIP-Chip) ² definiert Ziele bei einer Transkriptom-Ebene, aber ihre Anwendung ist die Charakterisierung von kinetisch stabile Interaktionen und nur in seltenen Fällen ^3,4 erlaubt es, die RBP Anerkennung Element (RRE identifizieren begrenzt ) innerhalb der langen Ziel-RNA. Mehr direkte RBP Zielort Informationen wird durch die Kombination in vivo UV-Vernetzung mit ^5,6 Immunpräzipitation ^7-9 durch die Isolierung aus vernetztem RNA-Segmenten und cDNA-Sequenzierung (CLIP) ¹⁰ gewonnen wird. CLIP wurde benutzt, um Ziele einer Reihe von RBPs ^11-17 identifizieren. Allerdings ist CLIP durch die geringe Effizienz der UV 254 nm RNA-Protein-Vernetzung beschränkt, und die Lage der Vernetzung ist nicht leicht zu identifizieren innerhalb des sequenzierten vernetzt Fragmente, was es schwierig macht UV-vernetzten Ziel-RNA-Segmente aus dem Hintergrund nicht-vernetzten separaten RNA-Fragmente auch in der Probe vorhanden.

Wir entwickelten eine starke Zell-basierten Ansatz zur Vernetzung bei hoher Auflösung und Transkriptom-weiten Bindungsstellen der zellulären RBPs und miRNPs feststellen, dass wir als PAR-Clip (Photoaktivierbare-Ribonucleosid-Enhanced Vernetzung und Immunpräzipitation) (siehe Abb.. 1A für eine Gliederung der Methode). Die Methode beruht auf dem Einbau von photoreaktiven Ribonukleosid Analoga, wie 4-Thiouridin (4-SU) und 6-thioguanosine (6-SG) in naszierenden RNA-Transkripte von lebenden Zellen. Die Bestrahlung der Zellen durch UV-Licht von 365 nm induziert eine effiziente Vernetzung von photoreaktiven Nukleosid-markierten zellulären RNAs zu interagieren RBPs. Immunpräzipitation des RBP in der Umgebung ist durch Isolierung des vernetzten und coimmunoprecipitated RNA gefolgt. Die isolierte RNA wird in einer cDNA-Bibliothek umgewandelt und tiefe sequenziert mit Solexa-Technologie. Ein charakteristisches Merkmal von cDNA-Bibliotheken von PAR-CliP vorbereitet ist, dass die genaue Position der Vernetzung durch Mutationen mit Wohnsitz in der sequenzierten cDNA identifiziert werden können. Bei der Verwendung von 4-SU, Thymidin vernetzt Sequenzen zu Cytidin Übergang, während mit 6-SG-Ergebnis in Guanosin zu Adenosin-Mutationen. Das Vorhandensein der Mutationen in vernetzten Sequenzen ist es möglich, sie aus dem Hintergrund der Sequenzen aus reichlich zellulären RNAs abgeleitet trennen.

Die Anwendung der Methode auf eine Reihe von verschiedenen RNA-bindende Proteine ​​wurde in Hafner et al. ¹⁸

Das Protokoll beschreibt die PAR-CliP Verfahren für HEK293-Zellen, die FLAG / IGF2BP1 bei Induktion mit Doxycyclin HA-markierten. Wir werden eine Anti-FLAG-Antikörper für die Immunpräzipitation verwendet werden.

PAR-Clip wird mit jeder Zelllinie nachweisbare Mengen des endogenen, untagged RNA bindenden Proteins (RBP) von Interesse, wenn eine effiziente Antikörper für die Immunpräzipitation ist Arbeit.

Expanding Cells

1. Expand FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 Zellen in Wachstumsmedium. Wir empfehlen zwischen 100-400 x 10 ⁶ Zellen (ca. 10 bis 40 15 cm Zellkulturplatten) mit als Ausgangspunkt. Wachsen sie auf etwa 80% Konfluenz.
2. 14 h vor dem Vernetzen add a) 4-Thiouridin bis zu einer Endkonzentration von 100 nM (1:1000 v / v einer 1 M 4-Thiouridin Stammlösung) direkt an das Zellkulturmedium und b) induzieren die Expression der FLAG / HA getaggt IGF2BP1 durch Zugabe von 1 pg / ml Doxycyclin (1:10.000 v / v von 10 mg / ml Doxycyclin Stammlösung). HINWEIS: statt 4-Thiouridin können Sie auch 100 uM von 6-thioguanosine.

UV-Crosslinking

1. Wash-Zellen einmal mit 10 ml eiskaltem PBS pro Platte und entfernen PBS vollständig.
2. Legen Platten auf einem Tablett mit Eis und bestrahlen mit 0,15 J / cm ² von 365 nm UV-Licht in einem Stratalinker 2400 (Stratagene) oder ein ähnliches Gerät entdeckt.
3. Scrape-Zellen mit einem Gummi-Polizist in 1 ml PBS pro Platte, Transfer zum 50 ml Zentrifugenröhrchen sammeln und durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C und den Überstand verwerfen. 100 x 10 ⁶ HEK293-Zellen (10 15 cm-Platten) werden Ausbeute ca.. 1 ml des nassen Zellpellets.
4. (Optional) Wenn Sie nicht direkt weiter mit Zelllyse wollen, frieren Schock das Zellpellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C. Zellpellets können für mindestens 12 Monate gelagert werden.

Zelllyse und RNaseT1 verdauen

1. Nehmen Sie Zellpellet aus vernetzten Zellen in 3 Bänden von 1x NP40-Lysepuffer und auf Eis inkubieren für 10 min.
2. Klare Zelllysat durch Zentrifugation bei 13.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
3. Deaktivieren Sie das Lysat durch Filtrieren über eine 0,2 um Membran Spritzenfilter (Pall Acrodisc oder gleichwertig).
4. Add RNase T1 (Fermentas, 10.000 U / ul) auf eine Endkonzentration von 1 U / ul und inkubieren in einem Wasserbad für 15 min bei 22 ° C. Coole Reaktion anschließend für 5 min auf Eis, bevor Sie fortfahren.

Immunpräzipitation und Wiederherstellung von vernetzten Ziel-RNA-Fragmente

Mit dem Magnetabscheider

Befolgen Sie diese Richtlinien in der Probenvorbereitung auf die magnetischen Beads vor dem Austrocknen zu verhindern.

1. Das Röhrchen mit den Perlen auf den magnetischen Ständer für 1 2 Minuten.
2. Fügen Sie den Puffer in die Röhre, während der Schlauch auf dem Magnetabscheider.
3. Cap der Röhre, entfernen Sie sie aus dem Magnetabscheider und resuspendieren Perlen. Sie können die Perlen durch flicking das Rohr mit dem Finger resuspendieren oder verwenden Sie einen Vortexer bei 5 6 gesetzt.
4. Kurz zentrifugieren, um Beads, die in die Röhre Kappe verbleiben können zu sammeln.
5. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 4 wie erforderlich.

Herstellung von magnetischen Kügelchen

1. Transfer 10 ul der Dynabeads Protein G magnetischen Partikeln (Invitrogen) pro ml Zelllysat (bei einem typischen Experiment sollte ca.. 40 50 ul von Kugeln) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Wash Perlen zweimal mit 1 ml Citrat-Phosphat-Puffer.
2. Resuspendieren in das doppelte Volumen von Citrat-Phosphat-Puffer gegenüber dem ursprünglichen Volumen von Beadsuspension.
3. Add 0,25 ug der anti-FLAG M2 monoklonalen Antikörper (Sigma) pro ml Suspension und Inkubation auf einem rotierenden Rad für 40 min bei Raumtemperatur.
4. Wash Perlen zweimal in 1 ml Citrat-Phosphat-Puffer, um ungebundenen Antikörper zu entfernen.
5. Resuspendieren Perlen in das doppelte Volumen von Citrat-Phosphat-Puffer gegenüber dem ursprünglichen Volumen von Beadsuspension.

Immunpräzipitation (IP), zweite RNase T1 Verdauung und Dephosphorylierung

1. Add 20 ul frisch zubereiteten Antikörper-konjugierten magnetischen Beads pro ml teilweisen RNase T1 behandelt Zelllysat und inkubieren in 15 ml Zentrifugenröhrchen auf einem rotierenden Rad für 1 h bei 4 ° C.
2. Sammeln magnetische Perlen auf einer magnetischen Partikel Sammler für 15 und 50 ml Zentrifugenröhrchen (Invitrogen) und Transfer zu 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Wash Perlen 3-mal in 1 ml IP-Waschpuffer.
4. Add RNaseT1 (Fermentas, 10.000 U / ul) auf eine Endkonzentration von 100 U / ul und inkubieren der Beadsuspension in einem Wasserbad für 15 min bei 22 ° C. Coole anschließend auf Eisfür 5 min.
5. Wash Perlen 3-mal in 1 ml der High-Salz Waschpuffer.
6. Resuspendieren Perlen in 1 Volumen Dephosphorylierungspuffer
7. Add Kälberdarm alkalische Phosphatase (CIAP, NEB) auf eine Endkonzentration von 0,5 U / ul, und inkubieren der Suspension für 10 min bei 37 ° C.
8. Wash Perlen zweimal in 1 ml der Phosphatase Waschpuffer
9. Wash Perlen zweimal in Polynukleotidkinase (PNK)-Puffer ohne DTT (DTT-Konzentration, die für die enzymatische Reaktion ist hoch genug, um die magnetischen Beads Schaden).
10. Resuspendieren Perlen in einem Original bead Volumen von PNK-Puffer

Radiomarkierung von RNA-Segmente vernetzt immunpräzipitiert Proteine

1. Um der Beadsuspension oben beschrieben, fügen ^Υ-32 P-ATP zu einer Endkonzentration von 0,5 Ci / ul und T4 PNK (NEB) auf 1 U / ul in einem Original bead Volumen. Inkubieren der Suspension für 30 min bei 37 ° C.
2. Fügen Sie nicht radioaktiven ATP zu einer Endkonzentration von 100 uM zu erhalten und Inkubation für weitere 5 min bei 37 ° C.
3. Waschen Sie die magnetischen Beads 5-mal mit 800 ul PNK-Puffer ohne DTT.
4. Resuspendieren der Beads in 70 ul SDS-PAGE-Ladepuffer.

SDS-PAGE und Elektroelution aus vernetztem RNA-Protein-Komplexe aus Gelscheiben

1. Inkubieren Sie die radioaktiv markierten Suspension für 5 min in einem Heizblock bei 95 ° C zu denaturieren und lassen Sie die immunpräzipitiert RBP mit vernetzten RNA und vortexen.
2. Entfernen Sie die magnetische Kügelchen auf dem Separator und den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
3. Last 40 ul des Überstandes pro Vertiefung einer Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) Fertigteile Polyacrylamidgel und führen Sie das Gel für 55 min bei 200 V.
4. Demontieren Sie die Gelkammer und Abbau des Gels, so dass es montiert auf einer Platte. Zur Erleichterung der Ausrichtung des Gels auf die Phosporimager Papierausdruck, empfehlen wir implantieren drei winzige radioaktive Gelstückchen asymmetrisch an drei der vier Ecken des Gels. Radioaktive Gelstücke können von Gelen, die bisher verwendet wurden, um radioaktiv markierte synthetische Oligonukleotide reinigen gesammelt werden. Wickeln Sie das Gel in Kunststoff-Folie (zB Frischhaltefolie), um Verunreinigungen zu vermeiden.
5. Setzen Sie das Gel auf eine ausgeblendet Phosporimager Bildschirm für 1 h und visualisieren auf einem Phosporimager.
6. Richten Sie das Gel auf der Oberseite des Phosporimager Ausdruck mit dem implantierten Gelstückchen zur Orientierung. Schneiden Sie die Bänder, die zu der erwarteten Größe von RBP (IGF2BP1, ca.. 75 kDa) entsprechen und in ein D-Tube Dialysator Midi Tube und fügen Sie 800 ul 1x SDS Laufpuffer.
7. Electroelute das vernetzte RNA-RBP-Komplex in 1x SDS-Laufpuffer bei 100 V für 2 h. aus dem Gel und elektroeluiert in einem D-Rohr Dialysator Midi (Novagen) in 800 ul SDS Laufpuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Proteinase K-Verdau

1. Fügen Sie dem gleichen Volumen 2x Proteinase K Puffer mit Bezug auf die electroeluate, durch die Zugabe von Proteinase K (Roche) auf eine Endkonzentration von 1,2 mg / ml an. Inkubieren für 30 min bei 55 ° C.
2. Recover der RNA durch saure Phenol / Chloroform / IAA-Extraktion (25:24:1, pH 4,0), gefolgt von einer Chloroform-Extraktion. Add 1 ul Glykogen (10 mg / ml Stammlösung) Fällung der RNA durch Zugabe von 3 Volumen Ethanol. Lösen Sie das Pellet in 10,5 ul Wasser.

cDNA-Bibliothek Vorbereitung und Deep-Sequencing

Carry das gewonnene RNA über einen Standard-cDNA-Bibliothek Vorbereitung Protokoll ursprünglich für das Klonen von kleinen regulatorischen RNAs ¹⁹ beschrieben. Der erste Schritt, 3 'Adaptorligation, wurde, wie auf einem 20 ul Skala In 10.5 ul des gewonnenen RNA beschrieben. Verwenden Sie die Solexa-Sequenzierung Adapter-Sets beschrieben. Je nach der Menge der RNA erholt, kann 5'-Adapter-3'-Adapter Produkte ohne Einsätze nach Amplifikation der cDNA als zusätzliche PCR-Bands erkannt werden. In solchen Fällen, Verbrauchsteuer je länger PCR-Produkt der erwarteten Größe von einem 3% NuSieve niedrigen Schmelzpunkt Agarosegel eluiert das PCR-Produkt aus dem Gel Stücke mit dem GelElute Kit (Qiagen) und die Sequenz mit der Solexa-Technologie. Ein Solexa-Sequenzierung laufen in der Regel bietet zwischen 6 und 10 Millionen Reihenfolge liest, dass genug sind für eine Transkriptom breite Abdeckung der Bindungsstellen der RNA-bindenden Proteinen.

Die bioinformatische Analyse

Sorgfältige bioinformatische Analyse der Sequenz liest getan werden muss, um aussagekräftige Einblicke in die RNA-Bindungsstellen für die untersuchten RBP, wie die RNA-Erkennung Element, das bevorzugte bindenden Regionen der RBP hat (exonische vs intronischen zu erhalten, kodierender Sequenz vs unübersetzt Sequenz). Die Sequenzabschnitte müssen gegen die Genom-und EST-Datenbanken ausgerichtet werden. Wir verwenden normalerweise liest Mapping eindeutig das Genom mit bis zu einem Missverhältnis, Insertion oder Deletion von Clustern von Sequenz zu bauen heißt es, dass kann dann weiter analysiert werden. Die Frequenz der charakteristischen Mutationen in den gruppierten sequenziert liest, T zu C-Übergänge bei der Verwendung von 4-SU und G bis A-Übergänge bei der Verwendung von 6-SG, sind bezeichnend für erfolgreich vernetzt Sequenzen. In unserer Erfahrung unvernetzten RNAs mit 4-SU beschriftet zeigen einen Hintergrund Mutationsrate von ca. 20%. Diese Rate wird erhöht auf ca.. 50-80% auf Vernetzung.

Eine detaillierte Beschreibung der bioinformatischen Analyse kann in der ergänzenden Material der Veröffentlichung von Hafner et al. ¹⁸

Optional Steps

Bestimmung der Inkorporation Ebenen des 4-Thiouridin in Gesamt-RNA

Isolieren der Gesamt-RNA aus der Zelllinie stabil exprimieren die RBP von Interesse nach wächst in Medium mit 100 uM 4SU 16 h vor der Ernte ergänzt. Als Kontrolle Ernte Zellen ohne 4SU hinaus gewachsen. Isolieren der Gesamt-RNA durch Zugabe von 3 Volumen Trizol Reagenz (Sigma) zu den gewaschenen Zellpellets nach Angaben des Herstellers s Anweisungen. war weiter zu reinigen Gesamt-RNA mit Qiagen RNeasy nach dem Protokoll des Herstellers. Um zu verhindern, Oxidation von 4SU während der RNA-Isolierung und Analyse, fügen 0,1 mM Dithiothreitol (DTT), um den Waschpuffer und nachfolgende enzymatische Schritte. Digest und dephosphoryliert Gesamt-RNA zu einzelnen Nukleoside zur HPLC-Analyse, wie zuvor beschrieben ^20. Kurz gesagt, in einem 30 ul Volumen, inkubieren 40 ug des gereinigten Gesamt-RNA wurden für 16 h bei 37 ° C mit 0,4 U bakterieller alkalischer Phosphatase (Worthington Biochemical) und 0,09 U Schlangengift-Phosphodiesterase (Worthington Biochemical). Als Referenz-Standard, mit einem synthetischen 4SU-markierte RNA, (wir standardmäßig verwenden CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) und unterliegen auch sie enzymatische Verdauung abgeschlossen. Trennen Sie die resultierenden Mischungen von Ribonukleosiden durch HPLC auf einer Supelco Entdeckung C18 (gebundene Phase Silica 5 uM Partikel, 250 x 4,6 mm) Reverse-Phase-Säule (Bellefonte PA, USA). HPLC Puffer 0,1 M TEAA in 3% Acetonitril (A) und 90% Acetonitril in Wasser (B). Verwenden Sie einen isokratischen Gradienten: 0% B für 15 min, 0 bis 10% B für 20 min, 10 bis 100% B für 30 min. Tragen Sie eine 5 min 100% B waschen angewendet zwischen den Läufen auf der HPLC-Säule zu reinigen.

Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1 (rechts) zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer PAR-Clip mit Zelllinien, FLAG / HA-markierten IGF2BP1 mit 4-SU und 6-SG durchgeführt. Beachten Sie, dass die Vernetzung Effizienz des 6-SG für IGF2BP1 niedriger als die Vernetzungseffizienz für 4-SU ist. Die untere Vernetzungseffizienz wird in eine höhere Hintergrund-Sequenzen aus Fragmenten von reichlich zellulären RNAs abgeleitete Ergebnis und deshalb sollten Sie sich überlegen Aufstockung des Experiments bei der Verwendung von weniger effizienten photoreaktiven Nukleoside.

Der linke Teil der Abbildung 1 zeigt einen Vergleich der mit verschiedenen photoreaktiven Uridin-Analoga, die potenziell für PAR-CliP werden im Vergleich zu herkömmlichen UV 254 nm Vernetzung könnte verwendet werden.

Die Intensität der radioaktiven Bande der richtigen Länge gibt Ihnen eine gute Idee, ob die PAR-CliP Experiment hat funktioniert, und Sie haben genügend RNA isoliert zu tragen durch ein kleines RNA-Sequenzierung Protokoll (Schritt-für-Schritt-Beschreibung für cDNA-Bibliothek Herstellung kleiner RNAs Sequenzierung kann in ¹⁹ zu finden). Die Häufigkeit der charakteristische Mutationen im sequenziert liest, T zu C-Übergänge bei der Verwendung von 4-SU und G bis A-Übergänge bei der Verwendung von 6-SG, sind bezeichnend für erfolgreich vernetzt Sequenzen. In unserer Erfahrung unvernetzten RNAs mit 4-SU beschriftet zeigen einen Hintergrund Mutationsrate von ca. 20%. Diese Rate wird erhöht auf ca.. 50-80% auf Vernetzung.

Wir danken Mitglieder der Tuschl Labor für hilfreiche Diskussionen. MH ist durch den Deutschen Akademischen Austauschdienst (DAAD) unterstützt. Diese Arbeit wurde vom Schweizerischen Nationalfonds Grant # 3100A0-114001 bis MZ unterstützt; TT ist ein HHMI Ermittler, und die Arbeit in seinem Labor wurde durch die NIH gewährt GM073047 und MH08442 und der Starr Foundation unterstützt.