PAR-Clip - метод идентификации транскриптома всей места связывания РНК-связывающие белки

РНК-транскрипты подвергаются обширные посттранскрипционные регулирование, которое опосредуется множеством транс действия РНК-связывающими белками (ОДП). Здесь мы представляем обобщению метода точно определить и на транскриптома масштабе РНК места связывания ОДП.

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary¹.

A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)² defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases^3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking^5,6 with immunoprecipitation^7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)¹⁰. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs^11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.

We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.

Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.¹⁸

Протокол ниже описывает PAR-Clip процедура HEK293 клеток, экспрессирующих ФЛАГ / HA с метками IGF2BP1 при индукции с доксициклин. Мы будем использовать Anti-Flag антитела для иммунопреципитации.

PAR-Clip будет работать с любой клеточной линии выражения определяемые уровни эндогенных без тегов РНК связывающий белок (РСБ) интересов, если эффективные антитела для иммунопреципитации доступна.

Расширение Клетки

1. Развернуть FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 клеток в питательную среду. Мы рекомендуем использовать между 100-400 х 10 ^{6 клеток} (около 15 см 10-40 пластин клеточной культуры) в качестве отправной точки. Вырастить их около 80% слияния.
2. 14 ч до сшивания добавить) 4-тиоуридина до конечной концентрации 100 мкМ (1:1000 / о от 1 М 4-тиоуридина маточного раствора) непосредственно в культуральной среде клеток и б) индуцируют экспрессию ФЛАГ / HA меткой IGF2BP1 путем добавления 1 мкг / мл доксициклина (1:10000 / об 10 мг / мл маточного раствора доксициклин). ПРИМЕЧАНИЕ: вместо 4-тиоуридина вы также можете использовать 100 мкМ 6-thioguanosine.

УФ-Сшивание

1. Вымойте клетки один раз с 10 мл ледяной PBS на чашку и удалить PBS полностью.
2. Место пластин на лотке со льдом и облучают с непокрытой 0,15 Дж / ​​см ² 365 нм УФ-света в Stratalinker 2400 (Stratagene) или аналогичное устройство.
3. Очистите от клетки с резиновыми полицейского в 1 мл PBS на чашку, передача до 50 мл пробирок центрифугирования и собирают центрифугированием при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант. 100 х 10 ⁶ НЕК293 (10 15 пластин см) дает ок. 1 мл мокрой осадок клеток.
4. (Опционально) Если вы хотите продолжить непосредственно с лизиса клеток, шоковой заморозки осадок клеток в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° C. Сотовые Гранулы могут храниться в течение не менее 12 месяцев.

Лизису клеток и RNaseT1 дайджест

1. Возьми осадок клеток из сшитого клетки в 3-х томов 1x NP40 лизис буфера и инкубируют на льду в течение 10 мин.
2. Очистить лизат ячейки центрифугированием при 13 000 мкг в течение 15 мин при 4 ° C.
3. Очистить лизат дальнейшего путем фильтрации через мембранный 0,2 мкм шприц фильтр (Acrodisc Pall или эквивалент).
4. Добавить РНКазы Т1 (Fermentas, 10000 ед / мкл) до конечной концентрации 1 ед / мкл и инкубировать на водяной бане в течение 15 мин при 22 ° C. Прохладный реакции впоследствии в течение 5 минут на льду, прежде чем продолжить.

Иммунопреципитация и восстановления сшитый целевых фрагментов РНК

Использование магнитного сепаратора

Следуйте этим рекомендациям всей подготовки проб для предотвращения магнитных шариков от высыхания.

1. Место трубку с бисером на магнитных выступаем за 1 2 минуты.
2. Добавить буфер для трубки в то время как лампы, магнитный сепаратор.
3. Крышка трубки, удалите его из магнитного сепаратора, и ресуспендируют бисером. Вы можете ресуспендирования бисером, щелкая трубки пальцем или использовать vortexer установлена ​​на уровне 5 6.
4. Центрифуга кратко собирать любые бусы, которые могут оставаться в трубке крышки.
5. Повторите шаги с 1 по 4 по мере необходимости.

Подготовка магнитных шариков

1. Передача 10 мкл Dynabeads Protein G магнитных частиц (Invitrogen) на мл Клеточный лизат (для типичного эксперимента он должен быть ок. 40 50 мкл из бисера), чтобы трубка микроцентрифужную 1,5 мл. Вымойте бисером в два раза с 1 мл цитрат-фосфатного буфера.
2. Ресуспендируют в два раза объема цитрат-фосфатного буфера относительно первоначального объема бисера подвески.
3. Добавить 0,25 мкг анти-FLAG M2 моноклональных антител (Sigma) в мл суспензии и инкубировать на вращающемся колесе в течение 40 мин при комнатной температуре.
4. Вымойте бисером два раза в 1 мл цитрат-фосфатного буфера для удаления несвязанных антител.
5. Ресуспендируют бисером в два раза объема цитрат-фосфатного буфера относительно первоначального объема бисера подвески.

Иммунопреципитация (ИС), во-вторых РНКазы Т1 пищеварения, а дефосфорилирование

1. Добавьте 20 мкл свежеприготовленного антител, конъюгированных магнитных шариков на мл РНКазы Т1 частичное лечение Клеточный лизат и инкубировать в 15 мл пробирок центрифугирования на вращающееся колесо в течение 1 ч при 4 ° C.
2. Сбор магнитных шариков на магнитной коллектор частиц на 15 и 50 мл пробирки центрифугирования (Invitrogen) и трансфер в пробирки на 1,5 мл отцентрифугировать.
3. Вымойте бисером 3 раза в 1 мл IP промывочным буфером.
4. Добавить RNaseT1 (Fermentas, 10000 ед / мкл) до конечной концентрации 100 ед / мкл и инкубировать бусины подвески на водяной бане в течение 15 мин при 22 ° C. Прохладный впоследствии на льдув течение 5 мин.
5. Вымойте бисером 3 раза в 1 мл высокого соль промывочный буфер.
6. Ресуспендируют бусины 1 объем буфера дефосфорилирование
7. Добавить кишечника теленка щелочной фосфатазы (CIAP, NEB) до конечной концентрации 0,5 Ед / мл, и инкубировать подвески в течение 10 мин при 37 ° C.
8. Вымойте бисером два раза в 1 мл промывочного буфера фосфатазы
9. Вымойте бисером дважды в полинуклеотидкиназы (ПНК) буфера без DTT (DTT концентрации необходимых для ферментативной реакции достаточно высока, чтобы повреждение магнитных шариков).
10. Ресуспендируют бусины в одном подлинном шарик объемом буфера PNK

Радиоактивной метки сегментов РНК, сшитый для иммунопреципитации белков

1. Чтобы шарик подвески, описанные выше, добавьте ^Υ-32 Р-АТФ в конечной концентрации 0,5 мкКи / мкл и Т4 PNK (НЭБ) до 1 ед / мкл в одном подлинном шарик объема. Инкубируйте подвески в течение 30 мин при 37 ° C.
2. Добавить нерадиоактивных АТФ для получения конечной концентрации 100 мкМ и инкубировать в течение еще 5 минут при температуре 37 ° C.
3. Вымойте магнитных гранул 5 раз с 800 мкл буфера без PNK DTT.
4. Ресуспендируют бусины в 70 мкл SDS-PAGE загрузки буфера.

SDS-PAGE и электроэлюцией из сшитого РНК-белковые комплексы из геля ломтиками

1. Инкубируйте меченые подвески в течение 5 мин в тепло блок при 95 ° С для денатурации и отпустите иммунопреципитации ОДП с сшитого РНК и вихря.
2. Удалить магнитных шариков на сепаратор и передачи супернатант на чистую 1,5 трубки микроцентрифужную мл.
3. Нагрузка 40 мкл надосадочной на лунку Novex Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) сборных полиакриламидном геле и запустить геля в течение 55 мин при 200 В.
4. Разберите гель камеры и демонтировать геля, оставляя его, смонтированных на одной пластине. Чтобы облегчить выравнивание гель для распечатки бумаги phosphorimager, мы рекомендуем имплантацию три крошечных радиоактивных частей гель асимметрично на трех из четырех углов геля. Радиоактивные части геля может быть собрана из гелей, которые ранее использовались для очистки радиоактивно синтетических олигонуклеотидов. Оберните геля в пластиковой пленки (например, Саран обернуть), чтобы избежать загрязнения.
5. Expose гель пустым phosphorimager экране в течение 1 ч и визуализировать на phosphorimager.
6. Совместите гель поверх распечатки phosphorimager использованием имплантированных частей гель для ориентации. Вырежьте группы, которые соответствуют ожидаемым размером ОДП (IGF2BP1, прибл. 75 кДа) и трансфер в D-Тюбе труб диализатора Midi и добавить 800 мкл 1x SDS работает буфера.
7. Electroelute сшитый РНК-ОДП комплекс 1x SDS работает буфера при 100 В в течение 2 ч. вырезали из геля и electroeluted в D-Тюбе диализатора Midi (Novagen) в 800 мкл SDS работает буфер в соответствии с инструкциями производителя.

Протеиназы К пищеварения

1. Добавить равный объем буфера 2x протеиназы К относительно electroeluate, после того протеиназы К (Roche) до конечной концентрации 1,2 мг / мл. Инкубируйте в течение 30 мин при 55 ° C.
2. Восстановление РНК кислой фенол / хлороформ / IAA добычи (25:24:1, рН 4,0), а затем добыча хлороформа. Добавить 1 мкл гликогена (10 мг / мл акций) осадок РНК, добавив 3 объема этанола. Растворить осадок в 10,5 мкл воды.

кДНК библиотеки подготовки и глубоких секвенирования

Carry восстановления РНК с помощью стандартного протокола кДНК подготовки библиотеки первоначально описано для клонирования малых РНК нормативно ^19. Первый шаг, адаптер перевязки 3 ', проводили, как описано на 20 мкл масштабе с использованием 10,5 мкл восстановленного РНК. Используйте Solexa секвенирования адаптер наборов описаны. В зависимости от количества РНК выздоровел, 5'-адаптер-3'-адаптер продукции без вставок могут быть обнаружены после усиления кДНК в качестве дополнительных полос ПЦР. В таких случаях, акцизным больше ПЦР продукт ожидаемого размера от 3% NuSieve низкой температурой плавления агарозном геле, элюировать ПЦР продукт от геля части, используя GelElute комплект (Qiagen) и последовательность, используя технологию Solexa. Один Solexa последовательности запуска обычно дает от 6 до 10 миллионов последовательность говорится, что вполне достаточно для транскриптома широкий охват сайтов связывания РНК связывающих белков.

Биоинформационные анализ

Тщательный анализ биоинформатики последовательность чтения необходимо сделать для получения значимых взглянуть на РНК сайты связывания для рассмотрены ОДП, такие как элемент РНК признание, предпочтительнее обязательных регионах ОДП имеет (exonic против интронных, кодирующей последовательностью против непереведенные последовательности). Последовательность чтения необходимо привести в соответствие с геномом и EST баз данных. Мы обычно используем читает mappiнг однозначно генома до одного несоответствия, вставка или удаление для создания кластеров последовательности говорится, что может в дальнейшем анализе. Частота характерные мутации в последовательности кластерных читает, Т С переходами при использовании 4-Су и G на переходах при использовании 6-SG, свидетельствуют об успешно сшитый последовательностей. По нашему опыту несшитой РНК помечена 4-SU-шоу фоновая скорость мутации около 20%. Этот показатель увеличивается до ок. 50-80% после сшивания.

Подробное описание биоинформатики анализ можно найти в дополнительном материала публикации Хафнер и др. ^18.

Дополнительные действия

Определение уровней включения 4-тиоуридина в общей РНК

Изолировать общей РНК из клеточной линии стабильно выражения ОДП интерес после того, растет в среде, дополненной 100 мкМ 4SU 16 ч до сбора урожая. В качестве контроля, сбора клеток, выращенных без 4SU дополнение. Изолировать общей РНК добавлением 3 объема Trizol реагента (Sigma), чтобы мыть гранулы ячейки соответствии с инструкциями изготовителя с. Далее было очистить общую РНК с использованием Qiagen RNeasy согласно протоколу производителя. Для предотвращения окисления 4SU во время РНК выделения и анализа, добавить 0,1 ммоль дитиотреитол (DTT), чтобы вымыть буферов и последующих ферментативных реакций. Дайджест и дефосфорилирован общей РНК выделить нуклеозидов для анализа ВЭЖХ, как описано выше ^20. Короче говоря, в 30 мкл, инкубировать 40 мкг очищенного общей РНК были в течение 16 часов при температуре 37 ° C с 0,4 U бактериальной щелочной фосфатазы (Уортингтон Биохимические) и 0,09 U змеиного яда фосфодиэстеразы (Уортингтон Биохимические). Как эталон, использование синтетических 4SU-меченой РНК, (мы стандартно использовать CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U), а также подвергнуть его полной ферментативного пищеварения. Отдельные полученные смеси нуклеозидов РНК методом ВЭЖХ на Supelco Discovery C18 (связанная фаза кремнезема 5 мкМ частицы, 250 х 4,6 мм) вскрывать колонку фазы (Беллефонт Пенсильвания, США). ВЭЖХ буфера 0,1 М TEAA в 3% ацетонитрила (А) и 90% ацетонитрила в воде (B). Используйте изократического градиент: 0% В в течение 15 мин, от 0 до 10% В в течение 20 мин, от 10 до 100% В в течение 30 мин. Применить 5 мин 100% B вымыть, приложенного между бежит к чистой колонки ВЭЖХ.

Представитель Результаты

Рисунок 1 (справа) показывает, представитель результате PAR-Clip выступал с клеточными линиями выражения ФЛАГ / HA с метками IGF2BP1 с 4-Су и 6-SG. Обратите внимание, что сшивание эффективность 6-SG для IGF2BP1 ниже, чем эффективность сшивания для 4-SU. Ниже сшивания эффективности приведет к более высоким фоном последовательностей основе фрагментов обильные сотовой РНК и, следовательно, вы должны изучить возможности для расширения эксперимента при использовании менее эффективных фотореакционноспособных нуклеозидов.

Левой панели На рисунке 1 показано сравнение с использованием различных фотореакционноспособных аналогов уридина, которые могут быть потенциально использованы для PAR-Clip по сравнению с традиционными УФ 254 нм сшивания.

Интенсивность радиоактивного полосы нужной длины дает Вам хорошую идею того PAR-Clip эксперимент работал, и вы выделили достаточное РНК довести до конца малых РНК последовательности протокола (шаг за шагом, описание подготовки кДНК библиотеки малых РНК последовательности можно найти в ^19). Частота характерные мутации в последовательности чтения, Т С переходами при использовании 4-Су и G на переходах при использовании 6-SG, свидетельствуют об успешно сшитый последовательностей. По нашему опыту несшитой РНК помечена 4-SU-шоу фоновая скорость мутации около 20%. Этот показатель увеличивается до ок. 50-80% после сшивания.

Мы благодарим членов Tuschl лаборатории за полезные обсуждения. MH поддерживается Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Работа выполнена при поддержке Швейцарского национального фонда, грант № 3100A0-114001 для MZ; ТТ следователь HHMI, и работать в его лаборатории была поддержана грантами NIH GM073047 и MH08442 и Старр Foundation.