Method Article
РНК-транскрипты подвергаются обширные посттранскрипционные регулирование, которое опосредуется множеством транс действия РНК-связывающими белками (ОДП). Здесь мы представляем обобщению метода точно определить и на транскриптома масштабе РНК места связывания ОДП.
RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary1.
A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)2 defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking5,6 with immunoprecipitation7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)10. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.
We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.
Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.18
Протокол ниже описывает PAR-Clip процедура HEK293 клеток, экспрессирующих ФЛАГ / HA с метками IGF2BP1 при индукции с доксициклин. Мы будем использовать Anti-Flag антитела для иммунопреципитации.
PAR-Clip будет работать с любой клеточной линии выражения определяемые уровни эндогенных без тегов РНК связывающий белок (РСБ) интересов, если эффективные антитела для иммунопреципитации доступна.
Расширение Клетки
УФ-Сшивание
Лизису клеток и RNaseT1 дайджест
Иммунопреципитация и восстановления сшитый целевых фрагментов РНК
Использование магнитного сепаратора
Следуйте этим рекомендациям всей подготовки проб для предотвращения магнитных шариков от высыхания.
Подготовка магнитных шариков
Иммунопреципитация (ИС), во-вторых РНКазы Т1 пищеварения, а дефосфорилирование
Радиоактивной метки сегментов РНК, сшитый для иммунопреципитации белков
SDS-PAGE и электроэлюцией из сшитого РНК-белковые комплексы из геля ломтиками
Протеиназы К пищеварения
кДНК библиотеки подготовки и глубоких секвенирования
Carry восстановления РНК с помощью стандартного протокола кДНК подготовки библиотеки первоначально описано для клонирования малых РНК нормативно 19. Первый шаг, адаптер перевязки 3 ', проводили, как описано на 20 мкл масштабе с использованием 10,5 мкл восстановленного РНК. Используйте Solexa секвенирования адаптер наборов описаны. В зависимости от количества РНК выздоровел, 5'-адаптер-3'-адаптер продукции без вставок могут быть обнаружены после усиления кДНК в качестве дополнительных полос ПЦР. В таких случаях, акцизным больше ПЦР продукт ожидаемого размера от 3% NuSieve низкой температурой плавления агарозном геле, элюировать ПЦР продукт от геля части, используя GelElute комплект (Qiagen) и последовательность, используя технологию Solexa. Один Solexa последовательности запуска обычно дает от 6 до 10 миллионов последовательность говорится, что вполне достаточно для транскриптома широкий охват сайтов связывания РНК связывающих белков.
Биоинформационные анализ
Тщательный анализ биоинформатики последовательность чтения необходимо сделать для получения значимых взглянуть на РНК сайты связывания для рассмотрены ОДП, такие как элемент РНК признание, предпочтительнее обязательных регионах ОДП имеет (exonic против интронных, кодирующей последовательностью против непереведенные последовательности). Последовательность чтения необходимо привести в соответствие с геномом и EST баз данных. Мы обычно используем читает mappiнг однозначно генома до одного несоответствия, вставка или удаление для создания кластеров последовательности говорится, что может в дальнейшем анализе. Частота характерные мутации в последовательности кластерных читает, Т С переходами при использовании 4-Су и G на переходах при использовании 6-SG, свидетельствуют об успешно сшитый последовательностей. По нашему опыту несшитой РНК помечена 4-SU-шоу фоновая скорость мутации около 20%. Этот показатель увеличивается до ок. 50-80% после сшивания.
Подробное описание биоинформатики анализ можно найти в дополнительном материала публикации Хафнер и др. 18.
Дополнительные действия
Определение уровней включения 4-тиоуридина в общей РНК
Изолировать общей РНК из клеточной линии стабильно выражения ОДП интерес после того, растет в среде, дополненной 100 мкМ 4SU 16 ч до сбора урожая. В качестве контроля, сбора клеток, выращенных без 4SU дополнение. Изолировать общей РНК добавлением 3 объема Trizol реагента (Sigma), чтобы мыть гранулы ячейки соответствии с инструкциями изготовителя с. Далее было очистить общую РНК с использованием Qiagen RNeasy согласно протоколу производителя. Для предотвращения окисления 4SU во время РНК выделения и анализа, добавить 0,1 ммоль дитиотреитол (DTT), чтобы вымыть буферов и последующих ферментативных реакций. Дайджест и дефосфорилирован общей РНК выделить нуклеозидов для анализа ВЭЖХ, как описано выше 20. Короче говоря, в 30 мкл, инкубировать 40 мкг очищенного общей РНК были в течение 16 часов при температуре 37 ° C с 0,4 U бактериальной щелочной фосфатазы (Уортингтон Биохимические) и 0,09 U змеиного яда фосфодиэстеразы (Уортингтон Биохимические). Как эталон, использование синтетических 4SU-меченой РНК, (мы стандартно использовать CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U), а также подвергнуть его полной ферментативного пищеварения. Отдельные полученные смеси нуклеозидов РНК методом ВЭЖХ на Supelco Discovery C18 (связанная фаза кремнезема 5 мкМ частицы, 250 х 4,6 мм) вскрывать колонку фазы (Беллефонт Пенсильвания, США). ВЭЖХ буфера 0,1 М TEAA в 3% ацетонитрила (А) и 90% ацетонитрила в воде (B). Используйте изократического градиент: 0% В в течение 15 мин, от 0 до 10% В в течение 20 мин, от 10 до 100% В в течение 30 мин. Применить 5 мин 100% B вымыть, приложенного между бежит к чистой колонки ВЭЖХ.
Представитель Результаты
Рисунок 1 (справа) показывает, представитель результате PAR-Clip выступал с клеточными линиями выражения ФЛАГ / HA с метками IGF2BP1 с 4-Су и 6-SG. Обратите внимание, что сшивание эффективность 6-SG для IGF2BP1 ниже, чем эффективность сшивания для 4-SU. Ниже сшивания эффективности приведет к более высоким фоном последовательностей основе фрагментов обильные сотовой РНК и, следовательно, вы должны изучить возможности для расширения эксперимента при использовании менее эффективных фотореакционноспособных нуклеозидов.
Левой панели На рисунке 1 показано сравнение с использованием различных фотореакционноспособных аналогов уридина, которые могут быть потенциально использованы для PAR-Clip по сравнению с традиционными УФ 254 нм сшивания.
Интенсивность радиоактивного полосы нужной длины дает Вам хорошую идею того PAR-Clip эксперимент работал, и вы выделили достаточное РНК довести до конца малых РНК последовательности протокола (шаг за шагом, описание подготовки кДНК библиотеки малых РНК последовательности можно найти в 19). Частота характерные мутации в последовательности чтения, Т С переходами при использовании 4-Су и G на переходах при использовании 6-SG, свидетельствуют об успешно сшитый последовательностей. По нашему опыту несшитой РНК помечена 4-SU-шоу фоновая скорость мутации около 20%. Этот показатель увеличивается до ок. 50-80% после сшивания.
Мы благодарим членов Tuschl лаборатории за полезные обсуждения. MH поддерживается Deutscher Akademischer Austauschdienst (DAAD). Работа выполнена при поддержке Швейцарского национального фонда, грант № 3100A0-114001 для MZ; ТТ следователь HHMI, и работать в его лаборатории была поддержана грантами NIH GM073047 и MH08442 и Старр Foundation.
Буферы и реагенты
Рост средний НЕК293
4-тиоуридина маточного раствора (1 М)
Doxycyclin акции (10 мг / мл)
1x NP40 лизирующего буфера
Подготовить запас 5x буфера без DVB-T и ингибиторы протеазы. Добавить DTT и ингибитор протеазы непосредственно перед экспериментом.
Цитрат-фосфатного буфера
IP-промывочный буфер
Высокая-солевого буфера для промывки
Дефосфорилирования буфер
Фосфатазы промывочный буфер
Полинуклеотидкиназы (ПНК) буфера без DTT
PNK буфер
SDS загрузки страниц буфера
2x протеиназы K буфера
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены