PAR كليب -- وسيلة لتحديد نطاق Transcriptome مواقع الربط من البروتينات الحمض النووي الريبي تجليد

محاضر RNA تخضع للتنظيم واسعة posttranscriptional التي توسطت فيها العديد من البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم عبر التمثيل (الممارسات التجارية التقييدية). هنا نقدم طريقة للتعميم لتحديد بدقة وعلى نطاق واسع transcriptome - RNA المواقع ملزمة الممارسات التجارية التقييدية.

RNA transcripts are subjected to post-transcriptional gene regulation by interacting with hundreds of RNA-binding proteins (RBPs) and microRNA-containing ribonucleoprotein complexes (miRNPs) that are often expressed in a cell-type dependently. To understand how the interplay of these RNA-binding factors affects the regulation of individual transcripts, high resolution maps of in vivo protein-RNA interactions are necessary¹.

A combination of genetic, biochemical and computational approaches are typically applied to identify RNA-RBP or RNA-RNP interactions. Microarray profiling of RNAs associated with immunopurified RBPs (RIP-Chip)² defines targets at a transcriptome level, but its application is limited to the characterization of kinetically stable interactions and only in rare cases^3,4 allows to identify the RBP recognition element (RRE) within the long target RNA. More direct RBP target site information is obtained by combining in vivo UV crosslinking^5,6 with immunoprecipitation^7-9 followed by the isolation of crosslinked RNA segments and cDNA sequencing (CLIP)¹⁰. CLIP was used to identify targets of a number of RBPs^11-17. However, CLIP is limited by the low efficiency of UV 254 nm RNA-protein crosslinking, and the location of the crosslink is not readily identifiable within the sequenced crosslinked fragments, making it difficult to separate UV-crosslinked target RNA segments from background non-crosslinked RNA fragments also present in the sample.

We developed a powerful cell-based crosslinking approach to determine at high resolution and transcriptome-wide the binding sites of cellular RBPs and miRNPs that we term PAR-CliP (Photoactivatable-Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation) (see Fig. 1A for an outline of the method). The method relies on the incorporation of photoreactive ribonucleoside analogs, such as 4-thiouridine (4-SU) and 6-thioguanosine (6-SG) into nascent RNA transcripts by living cells. Irradiation of the cells by UV light of 365 nm induces efficient crosslinking of photoreactive nucleoside-labeled cellular RNAs to interacting RBPs. Immunoprecipitation of the RBP of interest is followed by isolation of the crosslinked and coimmunoprecipitated RNA. The isolated RNA is converted into a cDNA library and deep sequenced using Solexa technology. One characteristic feature of cDNA libraries prepared by PAR-CliP is that the precise position of crosslinking can be identified by mutations residing in the sequenced cDNA. When using 4-SU, crosslinked sequences thymidine to cytidine transition, whereas using 6-SG results in guanosine to adenosine mutations. The presence of the mutations in crosslinked sequences makes it possible to separate them from the background of sequences derived from abundant cellular RNAs.

Application of the method to a number of diverse RNA binding proteins was reported in Hafner et al.¹⁸

بروتوكول يصف الإجراء أدناه PAR كليب لHEK293 الخلايا معربا عن FLAG / HA - المفتاحية مع الحث على IGF2BP1 الدوكسيسيكلين. سوف نستخدم جسم مضاد ضد العلم للمناعي.

سوف PAR كليب عمل مع أي خط خلية معربا عن المستويات التي يمكن اكتشافها من الذاتية ، معلم RNA البروتينات ملزمة (RBP) من الفائدة إذا كان الضد فعالة لمناعي غير متوفرة.

توسيع خلايا

1. توسيع FlpIn-HEK293/TO/FLAG/HA-IGF2BP1 الخلايا في المتوسطة النمو. ونحن نوصي باستخدام الخلايا بين 100-400 س ⁶ 10 (حوالي 10-40 سم لوحات الخلية ثقافة 15) كنقطة انطلاق. تنمو لهم ما يقرب من 80 ٪ confluency.
2. 14 ساعة قبل يشابك إضافة) 4 thiouridine إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر (1:1000 V / V لM - 1 4 thiouridine الأسهم الحل) مباشرة إلى الخلية الثقافة والمتوسطة ب) حث تعبير عن FLAG / HA الموسومة IGF2BP1 بإضافة من 1 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين (1:10،000 V / V من 10 ملغ / مل محلول المخزون الدوكسيسيكلين). ملاحظة : بدلا من thiouridine - 4 يمكنك أيضا استخدام 100 ميكرومتر من thioguanosine - 6.

الأشعة فوق البنفسجية يشابك

1. غسل خلايا مرة واحدة مع 10 PBS الجليد الباردة مل لكل لوحة وإزالة PBS تماما.
2. لوحات مكان على الدرج مع الجليد وكشفت أشرق بنور 0.15 نانومتر J / سم ² من 365 الأشعة فوق البنفسجية في Stratalinker 2400 (Stratagene) أو أي جهاز مماثل.
3. كشط خلايا قبالة مع شرطي المطاط في برنامج تلفزيوني في 1 مل نقل ، لوحة أنابيب الطرد المركزي الى 50 مل وجمع بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق عند درجة 4 وتجاهل طاف. و100 × 10 ⁶ HEK293 خلايا (لوحات 10 سم 15) العائد تقريبا. 1 مل من بيليه الخلية الرطب.
4. (اختياري) إلا إذا كنت تريد أن تواصل مباشرة مع تحلل الخلية ، صدمة تجميد بيليه خلية في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية. ويمكن تخزين كريات الخلية لا يقل عن 12 شهرا.

تحلل الخلايا وهضم RNaseT1

1. تناول بيليه خلية من خلايا crosslinked في 3 مجلدات من 1X العازلة تحلل NP40 واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
2. واضح lysate الخلية بواسطة الطرد المركزي في 13000 XG لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
3. مسح lysate المزيد من التصفية عليه من خلال 0.2 ميكرومتر غشاء تصفية حقنة (Acrodisc بال أو ما يعادلها).
4. إضافة ريبونوكلياز T1 (Fermentas ، 10،000 U / ميكرولتر) إلى التركيز النهائي للدرجة مئوية 1 U / ميكرولتر واحتضانها في حمام الماء لمدة 15 دقيقة في 22 بعد ذلك رد فعل باردة لمدة 5 دقائق على الجليد قبل المتابعة.

مناعي واسترداد crosslinked الهدف شظايا الحمض النووي الريبي

استخدام فاصل مغناطيسي

اتبع هذه الإرشادات في جميع أنحاء إعداد نموذج لمنع الخرز المغناطيسي من الجفاف.

1. وضع أنبوب يحتوي على حبات على الوقوف لدقائق المغناطيسي 2 1.
2. إضافة إلى العازلة أنبوب أنبوب بينما هو على فاصل المغناطيسي.
3. غطاء الأنبوب ، إزالته من فاصل المغناطيسي ، وresuspend الخرز. يمكنك resuspend حبات عبها بواسطة أنبوب بإصبعك أو استخدام vortexer حددت في 5 6.
4. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع أي الخرز التي قد تبقى في غطاء الأنبوب.
5. كرر الخطوات من 1 إلى 4 على النحو المطلوب.

إعداد حبات المغناطيسي

1. نقل 10 ميكروليتر من البروتين Dynabeads G الجسيمات المغناطيسية (Invitrogen) لكل خلية lysate مل (للاطلاع على تجربة نموذجية ينبغي أن يكون حوالي 40 50 ميكروليتر من الخرز) إلى أنبوب 1.5 مل microfuge. تغسل حبات مرتين مع 1 مل من سيترات فوسفات العازلة.
2. Resuspend في حجم مرتين من سترات فوسفات العازلة النسبية لحجم الأصلي للتعليق حبة.
3. إضافة 0.25 ميكروغرام من الأضداد وحيدة النسيلة المضادة للFLAG M2 (سيغما) لكل مل تعليق واحتضان على عجلة دوارة لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. تغسل حبات مرتين في 1 مل من سيترات فوسفات عازلة لإزالة الأجسام المضادة غير منضم.
5. Resuspend في حجم حبات ضعف سيترات فوسفات العازلة النسبية لحجم الأصلي للتعليق حبة.

مناعي (IP) ، والثانية T1 ريبونوكلياز الهضم ، ونزع الفسفات

1. إضافة 20 ميكرولتر الضد من الخرز ، مترافق الطازجة المغناطيسي لكل مل من lysate جزئية ريبونوكلياز T1 الخلية المعالجة واحتضان أنابيب الطرد المركزي في 15 مل على عجلة دوارة لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية.
2. جمع حبات المغناطيسي على جمع الجسيمات المغناطيسية لمدة 15 و 50 أنابيب الطرد المركزي مل (Invitrogen) ونقل إلى 1.5 مل أنابيب microfuge.
3. تغسل حبات 3 مرات في 1 مل من غسل العازلة للملكية الفكرية.
4. إضافة RNaseT1 (Fermentas ، 10،000 U / ميكرولتر) إلى التركيز النهائي من 100 U / ميكرولتر واحتضان تعليق خرزة في حمام الماء لمدة 15 دقيقة عند 22 درجة مئوية. بارد في وقت لاحق على الجليدلمدة 5 دقائق.
5. تغسل حبات 3 مرات في 1 مل من غسل العازلة عالية من الملح.
6. 1 Resuspend حبات في حجم المخزن المؤقت نزع الفسفات
7. إضافة العجل الفوسفاتيز القلوية المعوية (CIAP ، NEB) إلى التركيز النهائي من 0.5 U / ميكرولتر ، واحتضان تعليق لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
8. تغسل حبات مرتين في 1 مل من غسل العازلة الفوسفاتيز
9. تغسل حبات مرتين في عديد النوكليوتيد العازلة (PNK) كيناز دون DTT (تركيز DTT اللازمة للتفاعل الأنزيمي عالية بما يكفي لإتلاف الخرز المغناطيسي).
10. Resuspend حبات في مجلد واحد حبة الأصلي العازلة PNK

Radiolabeling من شرائح الحمض النووي الريبي للبروتينات crosslinked immunoprecipitated

1. إلى تعليق حبة المذكورة أعلاه ، إضافة Υ - ³² - P ATP إلى التركيز النهائي للPNK μCi / ميكرولتر و T4 0.5 (NEB) إلى 1 U / ميكرولتر في مجلد واحد حبة الأصلي. احتضان تعليق لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
2. إضافة غير المشعة للاعبي التنس المحترفين للحصول على التركيز النهائي من 100 ميكرومتر واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
3. تغسل حبات المغناطيسي 5 مرات مع 800 ميكرولتر من دون DTT PNK العازلة.
4. Resuspend الخرز في 70 ميكرولتر من العازلة تحميل SDS - PAGE.

SDS - PAGE وelectroelution المجمعات الحمض النووي الريبي من البروتين crosslinked من شرائح هلام

1. احتضان تعليق radiolabeled لمدة 5 دقائق في كتلة الحرارة الى 95 درجة مئوية إلى تفسد والإفراج عن الممارسات التجارية التقييدية immunoprecipitated crosslinked مع الحمض النووي الريبي والدوامة.
2. إزالة الخرز المغناطيسي على الفاصل ونقل طاف على تنظيف الأنبوب microfuge 1.5 مل.
3. تحميل 40 ميكروليتر من طاف في بئر Novex مكرر تريس 4-12 ٪ بولي أكريلاميد الجاهزة هلام (Invitrogen) وتشغيل لمدة 55 دقيقة هلام في 200 V.
4. تفكيك غرفة الجل وتفكيك هلام ، وترك منصة واحدة لوحة. لتسهيل محاذاة الجل إلى الورقة المطبوعة phosphorimager ، نوصي زرع قطعة صغيرة three هلام المشعة غير متماثلة في ثلاث من أربع زوايا من هلام. ويمكن جمع قطع هلام المشعة من المواد الهلامية التي كانت تستخدم سابقا لتنقية [أليغنوكليوتيد] الاصطناعية radiolabeled. التفاف هلام في فيلم من البلاستيك (مثل ساران الختامية) لتجنب التلوث.
5. يعرض على شاشة هلام phosphorimager مموها لمدة 1 ساعة وتصور على phosphorimager.
6. محاذاة هلام على رأس المطبوعة phosphorimager باستخدام قطعة جل مزروع لتحديد اتجاهاتها. تخلص من العصابات التي تتوافق مع الحجم المتوقع من الممارسات التجارية التقييدية (IGF2BP1 ، حوالي 75 كيلو دالتون) ونقل إلى مد أنبوب أنبوب ميدي مديال وإضافة 800 ميكرولتر SDS 1X العازلة على التوالي.
7. Electroelute في crosslinked RNA - RBP المعقدة في SDS 1X تشغيل العازلة عند 100 فولت لمدة 2 ساعة. يستأصل من الجل وelectroeluted في ميدي مديال مد انابيب (Novagen) في 800 العازلة SDS ميكرولتر تشغيل وفقا لتعليمات الصانع.

بروتين الهضم K

1. إضافة حجم مساو من الاحتياطي 2X K بروتين فيما يتعلق electroeluate ، تليها إضافة K بروتين (روش) إلى التركيز النهائي من 1.2 ملغ / مل. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 55 درجة مئوية.
2. استرداد رنا التي الحمضية كلوروفورم / الفينول / استخراج IAA (25:24:1 ، ودرجة الحموضة 4.0) يليها استخراج الكلوروفورم. إضافة 1 ميكرولتر من الجليكوجين (10 ملغ / مل الأسهم) ترسيب الحمض النووي الريبي بإضافة 3 مجلدات من الايثانول. حل بيليه في المياه 10.5 ميكرولتر.

[كدنا] تسلسل إعداد المكتبة وعميقة

تحمل الحمض النووي الريبي تعافى من خلال معيار [كدنا] مكتبة بروتوكول إعداد وصف للاستنساخ الأصل من RNAs التنظيمية الصغيرة ^19. تم تنفيذ الخطوة الأولى ، وربط 3 'محول ، كما هو موضح بها على نطاق و20 ميكرولتر باستخدام 10.5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي استردادها. استخدام التسلسل Solexa محول مجموعات وصفها. اعتمادا على كمية من الحمض النووي الريبي المستردة ، قد يتم الكشف عن محول 5' - 3' محول المنتجات دون إدراج بعد التضخيم من [كدنا] والعصابات PCR إضافية. في مثل هذه الحالات ، الاستهلاك للمنتج PCR أطول من الحجم المتوقع من 3 ٪ NuSieve المنخفضة نقطة ذوبان agarose هلام ، أزل المنتج PCR من القطع هلام استخدام عدة GelElute (Qiagen) وتسلسل باستخدام التكنولوجيا Solexa. واحد Solexa التسلسل تشغيل يتيح عادة بين 6 و 10 ملايين تسلسل أن يقرأ ما يكفي لتغطية مجموعة واسعة من المواقع transcriptome ملزم للبروتينات الحمض النووي الريبي ملزمة.

تحليل بيوينفورمتيك

تحليل دقيق للبيوينفورمتيك تسلسل القراءات الذي يتعين القيام به للحصول على الاحتياجات رؤى هادفة إلى مواقع RNA ملزم للفحص الممارسات التجارية التقييدية ، مثل عنصر الاعتراف الحمض النووي الريبي ، ويفضل ربط المناطق والممارسات التجارية التقييدية (exonic مقابل intronic الترميز تسلسل مقابل غير مترجمة تسلسل). تسلسل القراءات حاجة إلى محاذاة ضد قواعد بيانات الجينوم وEST. نستخدم عادة يقرأ mappiنانوغرام فريد لجينوم مع ما يصل إلى واحد الإدراج ، أو عدم تطابق الحذف لبناء مجموعات من تسلسل القراءات التي يمكن بعد ذلك لمزيد من التحليل. تواتر الطفرات المميزة في التسلسل عنقودية يقرأ ، تي إلى التحولات C عند استخدام SU - 4 وزاي إلى A التحولات عند استخدام 6 - SG ، تدل على تسلسل crosslinked بنجاح. في تجربتنا الرناوات uncrosslinked المسمى مع SU - 4 تظهر معدل الطفرة خلفية ما يقرب من 20 ٪. هذا المعدل يزيد إلى تقريبا. 50-80 ٪ عند يشابك.

يمكن العثور على وصف تفصيلي للتحليل بيوينفورمتيك في المواد التكميلية من المنشور من قبل وآخرون هافنر ^(18).

خطوات اختياري

تحديد مستويات إدماج thiouridine - 4 في مجموع RNA

عزل الحمض النووي الريبي مجموع من خط ثابت للتعبير عن خلية من الممارسات التجارية التقييدية الفائدة بعد تزايد في المتوسط ​​تستكمل مع 100 ميكرومتر 4SU 16 ساعة قبل الحصاد. كعنصر تحكم ، وخلايا الحصاد نمت دون إضافة 4SU. عزل الحمض النووي الريبي مجموع إضافة 3 مجلدات من كاشف Trizol (سيغما) إلى خلية الكريات غسلها باتباع إرشادات الشركة المصنعة ليالي. وعلاوة على ذلك تم تطهير إجمالي باستخدام الحمض النووي الريبي Qiagen RNeasy وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. لمنع أكسدة 4SU خلال عزل وتحليل الحمض النووي الريبي ، إضافة dithiothreitol 0.1 ملم (DTT) إلى مخازن يغسل والخطوات اللاحقة الأنزيمية. هضم والحمض النووي الريبي مجموع dephosphorylated النيوكليوسيدات لتحليل واحد لهبلك قبل ²⁰ كما هو موضح. لفترة وجيزة ، في المجلد 30 ميكرولتر ، احتضان 40 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع المنقى وكانت لمدة 16 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 0،4 الفوسفاتيز القلوية U البكتيرية (رثينجتون بيوكيميائية) و 0.09 سم الأفعى U فسفودايستراز (رثينجتون بيوكيميائية). كمعيار مرجعي ، استخدام الحمض النووي الريبي الاصطناعية 4SU المسمى (نستخدم standardly CGUACGCGGAAUACUUCGA (4SU) U) ، ويخضع أيضا لإكمال عملية الهضم الأنزيمي. فصل المخاليط الناتجة من ribonucleosides بواسطة HPLC على اكتشاف Supelco C18 (المرحلة المستعبدين جسيمات السيليكا ميكرومتر 5 ، 250 × 4.6 مم) عكس المرحلة العمود (Bellefonte السلطة الفلسطينية ، الولايات المتحدة). مخازن HPLC هي 0.1 م TEAA في أسيتونتريل 3 ٪ (أ) و 90 ٪ في أسيتونتريل المياه (B). استخدام التدرج isocratic : 0 B ٪ لمدة 15 دقيقة ، 0 إلى 10 B ٪ لمدة 20 دقيقة ، 1-10 B ٪ لمدة 30 دقيقة. تطبيق 5 باء دقيقة بنسبة 100 ٪ بين غسل تطبيق يعمل على تنظيف العمود هبلك.

ممثل النتائج

الشكل 1 (اللوحة اليمنى) يظهر نتيجة لممثل كليب PAR مع تنفيذ خطوط الخلايا معربا عن FLAG / HA - الموسومة IGF2BP1 مع SU - 4 و 6 SG. علما أن كفاءة يشابك من SG - 6 لIGF2BP1 أقل من الكفاءة ليشابك SU - 4. وأقل كفاءة في يشابك نتيجة ارتفاع خلفية تسلسل المستمدة من شظايا من RNAs الخلوية وفيرة ، وبالتالي يجب النظر في رفع مستوى التجربة عند استخدام النيوكليوسيدات photoreactive أقل كفاءة.

اللوحة اليسرى من الشكل 1 يبين مقارنة بين استخدام مختلف النظير يوريدين photoreactive التي يمكن استخدامها المحتمل لكليب PAR مقارنة التقليدية للأشعة فوق البنفسجية يشابك نانومتر 254.

كثافة الموجات المشعة من طول الصحيح يمنحك فكرة جيدة عما إذا كانت التجربة PAR كليب عملت وكنت قد عزل الحمض النووي الريبي كافية لتنفيذ البروتوكول من خلال تسلسل الحمض النووي الريبي الصغيرة (خطوة بخطوة لإعداد الوصف [كدنا] مكتبة صغيرة يمكن العثور على التسلسل في الرناوات ^19). تواتر الطفرات مميزة في قراءة التسلسل ، تي إلى التحولات C عند استخدام SU - 4 ومجموعة لتصل إلى التحولات عند استخدام 6 - SG ، تدل على تسلسل crosslinked بنجاح. في تجربتنا الرناوات uncrosslinked المسمى مع SU - 4 تظهر معدل الطفرة خلفية ما يقرب من 20 ٪. هذا المعدل يزيد إلى تقريبا. 50-80 ٪ عند يشابك.

نشكر أعضاء Tuschl المختبر لإجراء مناقشات مفيدة. معتمد من قبل الشقيقين MH Akademischer الألماني (DAAD). وأيد هذا العمل من قبل الصندوق الوطني السويسري المنحة # 3100A0 - 114001 لMZ ؛ TT غير محقق HHMI ، وكان يؤيد العمل في مختبره من المنح والمعاهد الوطنية للصحة GM073047 MH08442 ومؤسسة ستار.