Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

Biz insan fetal retina pigment epitel hücreleri (hfRPE) hücrelerin kültür konfluent mono tabakaları, morfoloji, fizyoloji, polarite, ve yetişkin doğal doku protein ve gen ekspresyonu sergilediği için tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bu çalışma, çeşitli göz hastalıkları bir hayvan modeli uzatıldı.

Biz yerli insan RPE morfolojik, fizyolojik ve genetik özellikleri ile birincil insan fetal retina pigment epitel (hfRPE) kültürler konfluent mono tabakaları büyük miktarlarda üretebilir bir hücre kültürü prosedürü geliştirdik. Bu hfRPE hücre kültürleri ağır pigmentasyon sergi ve elektron mikroskobu geniş apikal membran mikrovilluslar göstermektedir. Junctional kompleksleri çeşitli sıkı kavşak proteinlerin immünofloresan etiketlenmesi ile tespit edildi. Bu kolayca tekrarlanabilir birincil kültürlerin Epitel polarite ve fonksiyon yakından Daha önce insan dahil olmak üzere yerli RPE memeli modelleri, çalışılan benzerler. Bu sonuçlar, birçok hayvan modellerinde insan göz hastalığı tedavi edici girişimlerin geliştirilmesi ile uzatıldı. Biz, retina veya subretinal alan anormal sıvı birikimi kaldırılması için stratejiler üzerinde duruldu. Ekstrasellüler subretinal alan fotoreseptör dış segmentleri ve RPE apikal membran ayırır ve retina ekleri bakım ve RPE / retinanın etkileşimi bir bütün ana için kritik öneme sahiptir.

1. İnsan Fetal Doku

Bütün insan dokusu ile ilgili araştırma, Helsinki Bildirgesi ve NIH kurumsal inceleme kurulu ilkelerini izler. Fetal gözleri buz üzerinde dolu tüpler (ABR tarafından sağlanan) içeren RPMI-1640 medya yerleştirilir rastgele donörler, gebeliğin 16 ila 22 hafta, bağımsız bir pezevengi, Gelişmiş Bioscience Kaynakları (ABR, Alameda, CA) tarafından elde edilen ve bir gecede öncelikli teslimat hizmeti tarafından teslim edilir. Dokular enükleasyon sonra 48 saat kadar canlı kalır.

2. Hücre Kültürü Orta

MEM-alfa modifiye orta% 5 (Sigma-Aldrich) hazırlamak için temel aracı olarak kullanılan ve RPE hücrelerinin kültür (RPE orta, aşağıda Tablo 1) için% 15 serum içeren medya.

Tablo 1. 500 ml Orta hazırlanması için İnsan Fetal RPE Orta Bileşenleri

* THT orta yapmadan önce 1 1.5 ml PBS taurin hidrokortizon triiodo-thyronin eriterek yapılır. Birden fazla alikotları -80 yapılır ve saklanır ° C kültür kültür ortamı hazırlanması basitleştirmek için.

** Fetal sığır serumu, Sigma-Aldrich veya Gibco elde değildir.

Medya hazırlanmasında kullanılan fetal sığır serumu Atlanta Biyolojik (Norcross, GA) elde edilir. Her şişe serum kullanmadan önce (56 ° C 1hr) inaktive ısı. Aynı lottan serum hücre kültürü tutarlılık büyük miktarda sağlamak için ortam hazırlanması için kullanılması kadar satın alınan ve -20 ° C'de saklanır. % 20 FBS içeren farklı birçok medya birkaç hafta iyi plakaları - veya 12 - 24 hfRPE hücreleri belirli bir toplu seyrek numaralı seribaşı hücreleri yetiştirilmektedir. En klasik RPE morfolojisi (arnavut kaldırımı) ile en hızlı büyüyen melanated hücreleri, hücre kültürü için kullanılabilecek uygun bir serum çok göstermektedir.

Hücre kültürü ortamı da içerir: N1 takviyesi (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / ml, GlutaMax / penisilin-streptomisin 1:100 ml / ml (Gibco) ve esansiyel olmayan amino asit çözeltisi (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / ml. Buna ek olarak, hidrokortizon (20 mg / L), taurin (250 mg / L) ve triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) 1:500 bir nihai konsantrasyonu PBS içinde eriterek, bu üç bileşenin önceden hazırlanan (ml / ml). THT, Alikot 80 saklanır ° C kadar RPE orta eklendi.

3. Hücre Kültürü

Alındıktan sağlam küreler antibiyotik antimikotik çözüm durulanır (10X seyreltilir. Kedi hayır 15.240-096; Invitrogen) artı gentamisin (1 mg / ml) 3 ila 5 dakika (aşağıda Şekil 1).

Şekil 1. Inkübasyon antibiyotik HBSS veya PBS gibi orta iki kez durulanır sonra. Bir anda göz dünya Sylgard-184 (TEFE) ile kaplı 10 cm Petri kabı aktarılır ve 27G iğne ile güvence altına alınmıştır. K seçik SidePort bıçak kullanma (Alcon) sklerasına siliyer cisim (ön yüzey göz ekvator mesafenin 1 / 3) altında bir kesi ile yapılır. Bu kesi ön göz kısmının çıkarılması için dairesel kesim başlatmak için kullanılır. Bu kesim, bir bıçak tırtıllı (FST) ile bir tungsten-karbür kaplı kavisli iris makası kullanılarak yapılır. Gözün ön kısmının kaldırılması için önce, bir kesim r koparmasını önlemek için vitreus ile yapılırarka kutbunda RPE etina. 5% 40-60 dakika süreyle serum içeren orta gözün ön kısmı çıkarıldıktan sonra, arka kutupta dispase-I çözeltisi (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN. 2 U / ml, kedi hayır 04942086001) ile inkübe edilir 37 ° C-% 5 CO _2. Dispase tedaviden sonra, posterior direkleri silikon dolgu (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) Petri kapları bir HBSS aktarılır ve kadran veya dokuların yeterince düzleştirmek için büyük parçalar halinde disseke. Daha sonra retinanın forseps ile yavaşça kaldırılır. Tek hücreli RPE katmanları sayfaları sıyrılır ve soğuk tripsin-EDTA (Gibco, # 25.200-056) çözümü doğrudan toplanmıştır. RPE toplandıktan sonra, tripsin-EDTA doku tüpler 37 mühürlü ve 10-15 dakika su banyosunda aktarılır ° C Inkübasyon 10 dakika sonra, küçük kümeler halinde RPE ayrı tüpler şiddetle sarsıldı. Mesafeyi tam değilse, tüpler 5 dakika su banyosu içine yerleştirilmiştir. Tripsin-EDTA inkübasyondan sonra, tüpler mümkün un çözünmüş karışık hücre kümeleri için denetlenmektedir. Herhangi bir gözlenen kümeleri ince uçlu cam Pasteur pipeti kullanarak kaldırılır. Aşağı iplik (4 dakika için 1.4 klinik santrifüj rpm) sonra, hfRPE hücrelerin% 15 RPE medyada yeniden askıya alınır ve daha sonra (örneğin primaria şişeler içine koyun: kedi hayır 08-772-45; Fisher Scientific, Pittsburgh, PA. .) Bu orta,% 5 serum içeren RPE orta ile 1 gün sonra değiştirilir ve 2 ila 3 günde bir sonraki değişiklikler yapılmıştır. 3 ila 4 hafta sonra, hücreler belirsiz ve düzgün pigmentli oldu. Corning Costar Daha sonra% 15 serum içeren RPE hücre kültür ortamı yeniden askıya alınmış ve ortalama 150 200K hücreleri (transwell açık hücre kültürü ekler üzerine numaralı seribaşı, 10 ila 15 dakika boyunca% 0.25 'lik tripsin-EDTA tripsinize. kedi hayır 07-200-161 Fisher Scientific): 12 mm çap ekler, 0.4-um gözenekleri, polyester membranlar (örneğin kullanarak Corning, NY). Tohumlama önce, kuyulardan insan ekstrasellüler matriks (ortalama iyi 150 mcL HBSS 10 mikrogram, kedi hayır 354.237, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) ile kaplandı ve 2 saat boyunca başlık UV ışık ile tedavi. Bazı durumlarda, trypsinization prosedürü ilk trypsinization sonra ayırmak vermedi hücreleri toplamak için, ikinci kez tekrarlandı. Aynı protokolü (ECM ile kaplama hariç), matara, hücre P1 nüfus oluşturmak için kültür hücreleri kullanıldı. Bu hücreler ≥ 200 Ω • cm ² olmak üzere toplam doku direnci vardı ve düzgün pigmentli deneylerde kullanıldı.

Daha büyük bir şekil 1 için buraya tıklayınız .

4. Adım Adım Prosedürleri

1. Birden fazla çözümleri (4 kuyu ihtiyaç duyulan her gözün) ile 12-plaka hazırlayın:
   1. 1 / göz - 10x antibiyotik antimikotik çözüm eklemek
   2. PBS / HBSS durulama için bir çözüm eklemek - 2 kuyuları / göz
   3. dispase çözüm - 1 / göz
2. Petri kabı 5 fiksasyon iğneler açma ve HBSS ile doldurma diseksiyon hazırlayın
3. Paketinden çıkarın gözleri ve 3-5 dakika (adım 1 hazırlanan) antibiyotik antimikotik çözüm içine yerleştirin
4. Iki kuyu (adım 1 hazırlanan) PBS / HBSS ile yıkayınız, daha sonra çanak diseksiyon aktarabilirsiniz.
5. Trim aşırı kas ve göz çevresindeki bağ dokuları
6. Güvenli 27G iğneler (silikon taban aşağı pin) gözleri korneanın yukarı bakacak şekilde hizalayarak çanak diseksiyon kullanma.
7. Dairesel kesme başlayacak SidePort bıçak kullanarak, kornea altında kesi yapmak
8. Kullanarak iris makası, göz etrafında vitreus üzerinden kesilmiş ve gözün ön kısmını kaldırın sonra aynı makas kullanarak kesin.
   Not: 3 ile 8 adımda göz küresinin herhangi bir aşırı mekanik basınç önlemek.
9. (Adım 1 hazırlanan) dispase çözüm Transfer açık göz
10. 37, 40-60 dakika süreyle göz fincan inkübe ° C ile% 5 _CO 2
11. Taze bir çanak diseksiyon HBSS çözüm değiştirin.
12. Dispase çözüm diseksiyon çanak göz aktarın.
13. Konum Petri kabındaki göz (göz küresinin fincan yukarı bakacak şekilde) ve iki 27G iğne ile güvenli.
14. Yavaşça kaldırın ve kısmen ayrılmış retina retina makas kullanarak optik sinir uzak retina kesti. Retinanın atın.
15. Iris makası kullanarak, optik sinir doğru göz çevreden bir kesi yapmak.
16. Tüm beş 27G iğneler kullanarak güzel gergin göz yapma RPE düzleştirmek.
17. Retina makas kullanarak optik sinir bağlılık RPE ayıran optik sinir etrafında dairesel kesim olun.
    Not: 13-17 adımları düşük büyütme ya da stereo mikroskop olmadan yapılabilir
18. 250x büyütme stereomikroskopta ayarlayın.veya daha fazla ve iris makas tarafından yapılan kesim birlikte optik sinir yakın RPE sayfasının kenarına bulmak.
19. Koroidal doku tabakası ayrı RPE-Bruch membran iki forseps kullanma. Kenarı boyunca RPE ve koroid bağlantı zayıf olduğu alanı bulmak için birkaç girişim gerekebilir.
20. Yeri RPE yaprak soğuk tripsin-EDTA çözeltisi içine 15 ml tüp
21. 37 RPE 10-15mins tripsin-EDTA su banyosu içine dokuları ile, şapka ve transfer borular toplandıktan sonra ° C
22. 10 dakika inkübasyondan sonra, şiddetle, küçük kümeler halinde RPE ayırmak için 15 ml tüpler sallayın. Mesafeyi tam değilse, başka bir 5 dakika su banyosunda geri tüpler içine yerleştirin.
23. Mümkün un çözünmüş karışık hücre kümeleri için tüpleri kontrol edin. Herhangi bir gözlenen kümeleri ince uçlu cam Pasteur pipeti kullanarak çıkarılmalıdır.
24. (4 dakika için 1.4 klinik santrifüj rpm) hfRPE hücreleri aşağı Spin,% 15 RPE medya (9 ml toplam) süpernatant kaldırmak ve yeniden askıya hücreleri
25. Primaria şişeler 2 mL taze% 15 RPE medya, ertesi gün (37 ° C,% 5 CO ₂₎ kadar kuvöz içine balon içine 3 ml hücre süspansiyonu koyun

5. Temsilcisi Sonuçlar

Fonksiyonel doğrulama hfRPE hücre kültürü

Daha önceki deneylerde, plazma membran transport proteinleri ifade, kutuplaşma ve işlevini belirlemek ve uygulanabilir özellikleri ayarlanan bir doğrulama sağlamak birikmiş olarak ^RPE fonksiyonu 1-11 Bu özellikler düzenleyen özel sinyalizasyon yollar tanımlamak için bu primer kültürlerinde var her hücre nesil. Transepitelyal sıvı taşıma ve paracellular yolun bütünlüğünü belirleyen proteinleri tespit deneyler aşağıda özetlenmiştir. Bu in vitro deneylerde retina yeniden ^{yatıştırıldı} 6 bir hayvan modelinde onaylanmıştır .

Şekil 2. HfRPE hücreleri CFTR Yerelleştirme Sol üst paneli: CFTR hfRPE hücrelerin membran zenginleştirilmiş özler kullanılarak tespit edildi. M, moleküler ağırlık belirteci; şeritli 1, Merkezi alt panelde büyük olgun (bant C) ve immatür (A ve B grupları): CFTR immünofloresan lokalizasyonu (yeşil etiket) Top sağ panelde gösteren z düzlemi boyunca büyük kesit görünümü. z-ekseni üzerinden maksimum yoğunluk projeksiyon. ZO-1 (kırmızı olarak işaretlenmiş) RPE apikal ve bazolateral tarafı tasvir sıkı bir bağlantı belirteci olarak hizmet vermektedir. DAPI (mavi), bazal membran bulunan çekirdeklerin yakın etiketler. ZO-1 CFTR kırmızı etiket örtüşmektedir yeşil floresan bu yana, sarı / turuncu olarak görünür.

Şekil 3. HfRPE içinde IFNγ indüklenen fizyolojik değişiklikler A: bazal banyo IFNγ Ayrıca, ilköğretim, kültürlü hfRPE hücrelerin tek tabaka üzerinde transepitelyal sıvı taşımacılığı (J v) artmış J v üst izlemesi zaman fonksiyonu ve net sıvı olarak çizilir . emme (bazal banyo için apikal) pozitif değerler ile gösterilir; transepitelyal potansiyeli (TEP) ve total doku direnci (R _T) alt izleri zamanın bir fonksiyonu olarak çizilir. B: bazal banyo CFTRinh-172 (5 mcM) eklenmesi IFNγ uyarılmış J v artması engellenir.

Aşağıda hayvan modeli deneyler vitro bulgular hfRPE doğrulayan bir örnektir. Bu deneyde, yapay olarak oluşturulmuş retina dekolmanı (Şekil 4 A, B) dış göz yüzeyine IFNg eklenmesinden sonra önemli ölçüde azalmıştır. Bu etki kısmen tarafından bloke edilebilir: (1) Ayrıca cAMP bloker (Şekil 4D), (2) JAK ⁺ cAMP blokerler eklenmesinden sonra tamamen engellendi. Aşağıdaki resimlere Ekim tarayıcı kullanılarak elde edilir.

Şekil 4, in vivo retina dekolmanı deneylerde in vivo deneylerde bu prosedürleri daha önce ^ayrıntılı 6 tarif edilmiştir . Bu deneylerde, retina dekolmanları subretinal boşluk (SRS), tek başına ya JAK-STAT ve PKA yolak inhibitörleri kombinasyonu ile modifiye PBS çözüm 0,5-3 mcL enjeksiyon yoluyla sıçan göz yaratıldı. Her deneyde, retina dekolmanı oluşturulmasından sonra, 40-70 dk bir başlangıç ​​kontrolü süre vardı. Bu süre zarfında, bleb hacminin değişim oranı bleb istikrar sigorta ölçüldü. Optik koherens tomografi görüntüleme (Uygulamalı Fizik Enstitüsü, Rusya Bilimler Akademisi, Nizhniy Novgorod, Rusya) SRS ses düzeyini değiştirmek zaman ders ölçmek için kullanılmıştır.

Re-eki vol zaman kursuume değişiklik Optik Koherens Tomografi (OCT) ile ölçüldü. Dekolmanı boyutlarda bir değişim göstermektedir (A, B, oklar, ve D) 40-70 dakika süreyle ön yüzeyine IFNγ Ayrıca aşağıdaki 4 farklı deneyler (AD soldaki paneller) OCT görüntüleri. Paneller A ve IFNγ kontrol oranı JV arttığını B gösterisi (≈ 2 ul • ² • saat ^-1) sırasıyla 14 ve 12 ul • cm ² saat-1 cm. Kaynaklı emme oranları önemli ölçüde JAK-STAT yolu ve PKA inhibitörleri (C ve D), IFNγ ilavesinden sonra 0.2 ve 7.9 azaldı ul • cm ² • saat-1, sırasıyla. Oklar, kesikli çizgi içine alan, (başlangıç ​​hacim) ile karşılaştırıldığında bleb sınırını gösterir. Figürün sağ tarafı: t = 0 dekolmanı mekansal kapsamı ve çeşitli deneyler Ölçülen JV oranları üst panelde özeti; orta panel film ( buraya tıklayın ); alt panel-3D B. mavi Pseudocolor özetlenebilir deney bölümleri gösterir . INFγ ek 40 dakika sonra.

Vizyon Araştırma ve Oftalmoloji bildirimde Derneği ile uyumlu Tüm hayvan deneyleri yapılmıştır. Protokolü Ulusal Sağlık Enstitüleri Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı.

Mevcut deneylerde, göz başına elde edilen hücrelerin daha yüksek bir numaraları ile tutarlı hfRPE primer kültürlerinde üretmek için gerekli çoklu adımları kolaylaştırmak için tasarlanmış, daha önce yayınlanan teknikler ³ ek değişiklikler açıklanmaktadır. Orijinal prosedür her değişiklik, titizlikle değişiklikler eserleri tanıtmak etmedi ve sürekli olarak bu hücreleri kullanarak birçok diğer laboratuvarlar tarafından test edilen sağlamak için birden fazla fizyoloji ve moleküler biyoloji deneyleri test edildi. Son olarak, ek deneyler, hayvan modellerinde in vitro sonuçlar benzer tedirginlikler karşılaştırmak için yapılmıştır .

Biz Lab üyeleri Jeffrey Adijanto Tina Banzon Rong Li Qin Wan, Congxiao Zhang Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Ziya, Natalia Strunnikova bu hücre kültürleri karakterize yardım için teşekkür ederim. Jing Zhao, Connie Zhi, ve Tina Banzon hücre kültürleri büyük stoklar korunmasında yardım ettikleri için teşekkür ederiz.

Bu çalışma, Sağlık İntramural Araştırma Programı Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından da desteklenmiştir.