Наше исследование направлено на понимание роли нервной системы в прогрессировании атеросклероза. В частности, при каждом взаимодействии с гребнем мы стремимся ответить, как изменяется нерв во время атеросклероза и как его взаимодействие влияет на прогрессирование заболевания. В настоящее время используется несколько передовых технологий для продвижения исследований атеросклероза с целью улучшения понимания механизмов заболевания.
К ним относятся очистка тканей и 3D-визуализация, передовые микроскопические методы, искусственный интеллект, секвенирование отдельных клеток и машинное обучение. Во время прогрессирования атеросклероза компоненты артериальной стенки претерпевают мощную реструктуризацию. Определение изменений в 3D и визуализация интактных тканей с высоким разрешением являются ключевыми экспериментальными задачами.
Описанные здесь инструменты визуализации помогут исследователям и кардиологам лучше понять болезнь и, в конечном итоге, помочь в лечении пациентов. Описанный здесь протокол имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами, такими как визуализация глубоких тканей интактных тканей, а также визуализация их структуры, которая в противном случае недоступна. Эти протоколы помогут лучше понять взаимодействие между клетками и клетками-тканями, чтобы улучшить понимание прогрессирования заболевания.
Визуализация клеточных и структурных изменений в 3D в интактной ткани может дать новое понимание для лучшего понимания оставшихся без ответа биологических вопросов в исследованиях сердечно-сосудистой системы. Для начала поместите мышь под наркозом на поролоновую пластину, покрытую хирургическими бумажными полотенцами. Зафиксируйте руки и ноги мыши в лежачем положении с помощью липкой ленты.
Продезинфицируйте грудную клетку 75%-ным этанолом. Соберите кровь из левого желудочка с помощью одноразового шприца объемом один миллилитр. Затем сделайте разрез по средней линии на груди и небольшой разрез в правом предсердии.
Перфузируйте левый желудочек мыши 10 миллилитрами пяти миллимолярных ЭДТА в PBS в течение пяти минут, пока кровь не будет вымыта, а затем 20 миллилитров PBS в течение 5-10 минут. Наконец, перфузируйте 10 миллилитрами 4%-ного параформальдегида в течение 20 минут. Под препарирующим стереомикроскопом удаляют внутренние органы, в том числе желудочно-кишечные и репродуктивные органы.
Оставьте сердечную аорту и почки нетронутыми. Затем аккуратно удалите тимус и окружающие жировые ткани. Обнажите всю аорту от восходящей аорты до бифуркации подвздошной кости.
Соберите всю аорту и поместите ее в чашку Петри, наполненную PBS. Разделите аорту на разные сегменты и разделите ее в продольном направлении для двух очищений 2, 2'Тиодиотанолом или TDE. Прикрепите торцевую поверхность аорты к плоской черной восковой пластине в форме буквы Y и закрепите ее в 4% параформальдегиде на ночь при температуре четыре градуса Цельсия.
На следующий день отсоедините аорту и перенесите ее в PBS для пятиминутного промывки. Затем переведите аорту в раствор для блокировки на два часа для блокировки и пермеабилизации. Далее инкубируйте аорту с первичными антителами в блокирующем растворе в течение 24 часов.
Промойте аорту в PBS в течение пяти минут, повторив пять раз перед инкубацией со вторичными антителами в 10% нормальной сыворотке осла и DAPI для ядерного окрашивания на ночь, переведите окрашенную аорту в возрастающую концентрацию раствора TDE. Затем приклейте двустороннюю липкую прямоугольную проставку для визуализации к чистому предметному стеклу и перенесите очищенную аорту, убедившись, что конечная поверхность аорты обращена к защитному стеколу. Смонтируйте аорту каплями 60% раствора TDE и осторожно прикрепите к лунке защитный листок, избегая попадания пузырьков воздуха.
Включите инвертированный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный 20-кратным масляным иммерсионным объективом. Настройте гибридные диодные детекторы на основе красителей для окрашивания. Отрегулируйте параметры отображения и выберите формат XY 1024x1024 пикселей для создания изображений.
Капните иммерсионное масло на защитное стекло и крупно переместите объектив с 63-кратным увеличением по направлению к образцу, пока он не коснется иммерсионного масла и защитного стекла. Затем определите интересующую область и получите Z-стеки со стороны адвентиции торцевой поверхности аорты с шагом от двух до четырех микрометров на глубине до 60 микрометров для трехмерной визуализации. Присвойте файлу имя с информацией об образце и сканировании и сохраните данные.
С помощью вертикального многофотонного микроскопа, оснащенного 20-кратным объективом, можно получить Z-стеки с алюминальной стороны с шагом от 10 до 15 микрометров на глубине до 700 микрометров. После обезболивания и перфузии мыши PBS и параформальдегидом рассеките часть тела выше уровня диафрагмы. Зафиксируйте нижнюю часть тела с помощью 4% параформальдегида на один-два дня при температуре четыре градуса Цельсия.
Далее тщательно промойте пробу в PBS в течение 10 минут, повторив три раза. Инкубируйте образец в 20%-ном кубическом растворе в течение 48 часов. После промывки PBS инкубируйте образец в растворе PGST в течение ночи для пермеабилизации и блокировки.
На следующий день инкубируйте образец с первичными антителами в растворе PGST при температуре четыре градуса Цельсия с легким встряхиванием в течение 10–12 дней. После промывки образца в PGST добавьте вторичные антитела в DAPI в PGST при температуре четыре градуса Цельсия в течение семи дней. Тщательно промойте образец в PGST в течение одного часа, повторив пять раз.
Переведите окрашенный образец в ряд повышенных концентраций тетрагидрофурановых рабочих растворов для обезвоживания, инкубируя по 12 часов на каждую концентрацию. После обезвоживания поместите образец в абсолютный раствор дихлорметана на три часа для удаления липидов. Затем инкубируйте образец в растворе бензилового спирта, бензилбензоата, бензилбензоата с показателем преломления в течение трех-шести часов.
Для начала загрузите изображения аорты мыши и нижней части тела в виде Z-стека на рабочую станцию обработки изображений. Чтобы обозначить цветом объемную глубину ячейки или структуры, используйте программное обеспечение для восстановления изображений для деконволюции исходного изображения. В программном обеспечении для Фиджи сгенерируйте проекцию максимальной интенсивности деконволютированных данных с помощью временного цветового кодирования.
Загрузите в программу серию изображений TIFF с Z-стеком. Используя плагин для сшивания Fiji, сшейте изображения и сохраните их в формате TIFF. Затем загрузите сшитые изображения в программное обеспечение для трехмерной визуализации для сегментации изображений.
Вручную проследите нейронные структуры по оси X-Y-Z по всему пути между аортой и ганглиями. Загружайте предварительно обработанные изображения в программное обеспечение для анализа изображений. Используйте аутофлуоресценцию для сегментации аорты и соединительных тканей.
Нанесите отдельные псевдоцвета, чтобы визуализировать отчетливую стенку аорты и бляшку. Наконец, используйте функцию адаптивного выравнивания гистограммы с ограничением контраста для усиления локального контраста на фоне обработанных изображений. Очищенная от TDE атеросклеротическая аорта выявила окрашенные CD3e Т-клетки в бляшках, обширный неогенез окрашенных NF200 нервных волокон в артериальных третичных лимфоидных органах.
Многофотонная визуализация пораженной брюшной аорты у мышей с нокаутом APOE показала прорастание аксонов, экспрессирующих NF200, в областях, где отсутствуют B220-положительные В-клетки в третичных лимфоидных органах артерий. Световая послойная визуализация очищенного от iDISCO брюшной полости мыши позволила визуализировать пространственное соотношение между аортой и симпатическими ганглиями с недавно сформированными NF200-окрашенными аксонами на адвентиции, прилегающей к атеросклеротической бляшке.
