Nossa pesquisa se concentra na compreensão do papel do sistema nervoso na progressão da aterosclerose. Especificamente a cada interação com a crista, pretendemos responder como o nervo muda durante a aterosclerose e como sua interação influencia a progressão da doença. Várias tecnologias de ponta são usadas atualmente para avançar na pesquisa da aterosclerose para melhorar a compreensão dos mecanismos da doença.
Isso inclui limpeza de tecidos e imagens 3D, técnicas microscópicas avançadas, inteligência artificial, sequenciamento de células únicas e aprendizado de máquina. Durante a progressão da aterosclerose, os componentes da parede arterial sofrem uma reestruturação robusta. Delinear as mudanças na imagem 3D e de alta resolução dos tecidos intactos são os principais desafios experimentais.
As ferramentas de imagem descritas aqui ajudarão pesquisadores e cardiologistas a entender melhor a doença e, eventualmente, ajudar a tratar os pacientes. O protocolo descrito aqui oferece várias vantagens sobre as técnicas tradicionais, como imagens de tecidos profundos dos tecidos intactos, bem como a visualização de sua estrutura que, de outra forma, seria inacessível. Esses protocolos ajudarão a entender melhor a interação célula-célula e célula-tecido para melhorar a compreensão da progressão da doença.
Visualizar as mudanças celulares e estruturais em 3D no tecido intacto pode fornecer uma nova visão para entender melhor as questões biológicas não respondidas na pesquisa cardiovascular. Para começar, coloque o mouse anestesiado em uma placa de espuma coberta com toalhas de papel cirúrgicas. Fixe os braços e as pernas do mouse em decúbito dorsal usando fitas adesivas.
Desinfete o peito com etanol 75%. Colete o sangue do ventrículo esquerdo usando uma seringa descartável de um mililitro. Em seguida, faça uma incisão na linha média no tórax e uma pequena incisão no átrio direito.
Perfunda o ventrículo esquerdo do camundongo com 10 mililitros de EDTA de cinco milimolares em PBS por cinco minutos até que o sangue seja eliminado, seguido por 20 mililitros de PBS por 5 a 10 minutos. Por fim, perfunda com 10 mililitros de paraformaldeído a 4% por 20 minutos. Sob um microscópio estéreo de dissecação, remova os órgãos internos, incluindo órgãos gastrointestinais e reprodutivos.
Deixe o coração, a aorta e os rins intactos. Em seguida, remova cuidadosamente o timo e o tecido adiposo circundante. Exponha toda a aorta, desde a aorta ascendente até a bifurcação ilíaca.
Colha toda a aorta e coloque-a em uma placa de Petri cheia de PBS. Separe a aorta em diferentes segmentos e divida-a longitudinalmente para duas limpezas de 2, 2'Tiodietanol ou TDE. Prenda a aorta da face final em uma placa de cera preta plana em forma de Y e fixe-a em 4% de paraformaldeído durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, solte a aorta e transfira-a para o PBS para uma lavagem de cinco minutos. Em seguida, transfira a aorta para uma solução de bloqueio por duas horas para bloqueio e permeabilização. Em seguida, incube a aorta com anticorpos primários na solução de bloqueio por 24 horas.
Lave a aorta em PBS por cinco minutos, repetindo cinco vezes antes de incubar com anticorpos secundários em soro de burro normal a 10% e DAPI para coloração nuclear durante a noite, transfira a aorta corada para uma concentração crescente de solução de TDE. Em seguida, cole bem o espaçador de imagem retangular pegajoso de dupla face em uma lâmina de vidro limpa e transfira a aorta limpa, garantindo que a adventícia aórtica da face final esteja voltada para a lamínula. Monte a aorta com gotas de solução de TDE a 60% e prenda cuidadosamente uma lamínula no poço, evitando bolhas de ar.
Ligue o microscópio de varredura a laser confocal invertido equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 20x. Ajuste os detectores de diodo híbrido com base nos corantes de mancha. Ajuste as configurações de exibição e selecione o formato XY de 1024 x 1024 pixels para geração de imagens.
Coloque o óleo de imersão na lamínula e mova a objetiva 63x grosseiramente em direção à amostra até que ela toque o óleo de imersão e a lamínula. Em seguida, identifique a região de interesse e adquira pilhas Z do lado adventício da aorta da face final em um tamanho de passo de dois a quatro micrômetros até 60 micrômetros de profundidade para imagens tridimensionais. Nomeie o arquivo com detalhes de amostra e detalhes de verificação e salve os dados.
Usando um microscópio multifóton vertical equipado com uma objetiva de 20x, adquira pilhas Z do lado abluminal em um tamanho de passo de 10 a 15 micrômetros até 700 micrômetros de profundidade. Depois de anestesiar e perfundir o camundongo com PBS e paraformaldeído, disseque a parte do corpo acima do nível do diafragma. Fixe a parte inferior do corpo com 4% de paraformaldeído por um a dois dias a quatro graus Celsius.
Em seguida, lave bem a amostra em PBS por 10 minutos, repetindo três vezes. Incubar a amostra em solução cúbica a 20% por 48 horas. Após a lavagem com PBS, incube a amostra em solução de PGST durante a noite para permeabilização e bloqueio.
No dia seguinte, incubar a amostra com anticorpos primários em solução de PGST a quatro graus Celsius com agitação suave por 10 a 12 dias. Depois de lavar a amostra em PGST, adicionar anticorpos secundários em DAPI em PGST a quatro graus Celsius por sete dias. Lave bem a amostra em PGST por uma hora, repetindo cinco vezes.
Transferir a amostra corada para uma série de concentrações aumentadas de soluções de trabalho de tetra-hidrofurano para desidratação, incubando 12 horas por concentração. Após a desidratação, colocar a amostra em uma solução absoluta de diclorometano por três horas para remoção de lipídios. Em seguida, incubar a amostra numa solução de benzoato de benzilo de álcool benzílico correspondente ao índice de refracção durante três a seis horas.
Para começar, carregue as imagens lado a lado da pilha Z da aorta do camundongo e da parte inferior do corpo na estação de trabalho de processamento de imagem. Para codificar por cores a profundidade do volume de uma célula ou estrutura, use um software de restauração de imagem para deconvoluir a imagem bruta. No software Fiji, gere uma projeção de intensidade máxima dos dados descomplicados usando codificação de cores temporais.
Carregue a série de imagens TIFF lado a lado da pilha Z no software. Usando o plug-in de costura Fiji, costure as imagens e salve-as no formato TIFF. Em seguida, carregue as imagens unidas no software de visualização tridimensional para segmentação de imagens.
Trace manualmente as estruturas neuronais no eixo XYZ ao longo de todo o caminho entre a aorta e os gânglios. Carregue imagens pré-processadas no software de análise de imagem. Use a autofluorescência para segmentar a aorta e os tecidos conjuntivos.
Aplique pseudocores separadas para visualizar a parede e a placa aórticas distintas. Por fim, use a função de equalização de histograma adaptativo com limitação de contraste para aprimorar o contraste local sobre o plano de fundo das imagens processadas. A aorta aterosclerótica eliminada por TDE revelou células T coradas com CD3e em placas, uma extensa neogênese de fibras nervosas coradas com NF200 em órgãos linfóides terciários arteriais.
Imagens multifotônicas da aorta abdominal doente em camundongos knockout para APOE mostraram brotamento de axônio que expressa NF200 em regiões sem células B B220 positivas dentro dos órgãos linfóides terciários das artérias. A imagem de folha de luz do abdômen de camundongo limpo com iDISCO visualizou a relação espacial entre a aorta e os gânglios simpáticos com axônios corados com NF200 recém-formados na adventícia adjacente à placa aterosclerótica.
